Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica non invasiva per il campionamento del liquido di rivestimento mucoso indisturbati dalle vie respiratorie superiori. Può essere utilizzato per eseguire la quantificazione dei livelli in vivo dei mediatori di proteina, quali citochine e chemochine, in soggetti di tutte le età.

Abstract

Questo protocollo descrive campionamento non invadente di liquido di rivestimento mucoso delle vie respiratorie superiore indisturbato. E ' anche in dettaglio la procedura di estrazione utilizzata prima dell'analisi di mediatori immuni in eluati fluidi per lo studio della firma immuni topica delle vie aeree, senza la necessità di procedure di stimolazione (spesso utilizzato da altre tecniche). Il liquido di rivestimento mucoso viene campionato su una striscia di carta da filtro posizionato sulla parte anteriore del inferior turbinate e sinistro per 2 min di assorbimento. Analiti vengono eluiti dalla carta da filtro, e gli eluati di base di proteine estratti vengono analizzati da un immunoassay elettrochemiluminescenza-based, che consente per la quantificazione di alto-sensibilità di analiti a basso e alto livello nello stesso campione. Abbiamo misurato i livelli in vivo di 20 mediatori immuni preselezionati legate alla specifica immunitario vie nella mucosa delle vie respiratorie superiore di segnalazione, ma la tecnica non è limitata a quel pannello specifico o il sito di campionamento. La tecnica innanzitutto è stata implementata nei bambini di 7-year-old da studi prospettivi Copenaghen sull'asma nella coorte di₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) di infanzia con rinite allergica. Da allora in poi è stato usato nella coorte di nascita₂₀₁₀ COPSAC longitudinale, provata a 1 mese, 2 anni e 6 anni di età e alle istanze di sintomi respiratori acuti. Abbiamo correttamente acquisiti e analizzati campioni da 620 (89%) di 700 1-mese-vecchi bambini; alcuni campioni erano sotto il limite di rilevamento del test (segnalato come la mediana (Inter-Quartile Range (IQR)). Il numero di campioni di sotto del limite di rilevazione (cioè da 0 al set point per il limite inferiore di rilevamento) per ogni Mediatore era 29 (7,25-119.5). Questa tecnica consente la quantificazione del profilo di in vivo delle vie respiratorie mucose immuni dalla nascita, può essere applicata longitudinalmente e può essere applicata agli studi sull'effetto di genetica e le esposizioni ambientali di presto-vita, patofisiologia, endotyping e il monitoraggio di malattie respiratorie, sviluppo e valutazione di nuove terapie.

Introduction

Il liquido di rivestimento mucoso del naso costituisce la parte liquida del sistema della superiore-via aerea. Si compone di una matrice complessa di mediatori derivati dall'interazione tra l'epitelio e cellule immunitarie che compongono la prima linea di difesa contro l'invasione di microrganismi. La mucosa nasale è facilmente accessibile, e c'è una forte relazione funzionale ed immunologica tra il naso e bronchi¹. Questo comparto è di particolare interesse in relazione a malattie delle vie respiratorie che sono comuni nell'infanzia, come l'asma e la rinite allergica, ma anche a una serie di altri disturbi respiratori più prevalente più tardi nella vita.

Qui, descriviamo l'implementazione di un metodo a campione indisturbato mucoso rivestimento liquido dalla cavità nasale usando una tecnica non invasiva basata su carta da filtro, così come una procedura di estrazione successiva, utilizzato per eluire basati su proteine analiti dalla carta da filtro prima della loro quantificazione. Questa tecnica, ad esempio, consente di ottenere in vivo immuni firme di individui sani e di individui con le varie malattie respiratorie. Inoltre, è possibile esaminare le esposizioni di importanza per una firma immune specifica e valutare se è un preannunciatore o mediatore di sviluppo successivo di malattia.

Liquido di rivestimento mucoso è stata ottenuta in precedenza da lavaggio nasale², che è spesso preceduto da una prova nasale di sfida, dove un allergene è stato introdotto in alti livelli di stimolare una risposta infiammatoria^3,4. Tuttavia, la tecnica di lavaggio nasale non è fattibile nei bambini piccoli e introduce un fattore di diluizione sconosciuto, che confonde gli esiti, come mediatore diluito livelli possono scendere sotto il limite di rilevamento del test⁵. Inoltre, a causa del fattore di diluizione sconosciuto, le risposte di analita misurato dal test di provocazione nasale non sono comparabili tra individui, limitando così l'utilità della tecnica del lavaggio nasale in una coorte di impostazione. Infine, la sfida dell'allergene è applicabile solo in soggetti sensibilizzati, e altre sfide, come la sfida di istamina, non sono fisiologicamente rilevanti, potenzialmente causando un effetto soffitto sul rilascio del Mediatore. Questi problemi vengono eluse la tecnica basata su carta da filtro presentato per accumulazione fluida rivestimento mucoso, dove i singola secrezione di fluidi e i suoi livelli analitici sono gli unici fattori che influenzano la varianza inter-individuale.

Durante la procedura di estrazione, analiti vengono eluiti dai giornali filtro dopo l'aggiunta di volumi identici del buffer per tutti i campioni. Questo favorisce la diluizione simile ex vivo di tutti i campioni. Un tampone di estrazione di soluzione salina isotonica basata su albumina viene utilizzata per la fase di estrazione; consente l'estrazione dei mediatori a base di proteine e stabilizza le proteine per limitare la denaturazione durante il successivo congelamento delle proteine eluite prima della quantificazione. Per evitare la degradazione della proteina durante la fase di estrazione, viene aggiunto un cocktail di inibitori della proteasi per il tampone di estrazione.

L'attuazione di tecniche che consentono per la quantificazione del indisturbati, in vivo-generati mediatori immuni alle mucose siti è della massima importanza. In primo luogo, il sito della mucosa costituisce il più grande organo immunologico nel corpo. In secondo luogo, la posizione nasale è il sito primario di esposizione dispersa nell'aria ed è strettamente collegata al vano respiratorie immunologico del polmoni¹. In terzo luogo, la possibilità di rilievo di questo importante organo con una tecnica non invasiva apre la possibilità di fornire una pletora di informazioni sull'asse di interazione di microbo-immunitario importante in materia di salute e malattia delle vie aeree. In quarto luogo, ci sono molte altre possibili applicazioni di questa tecnica, come studiare le alterazioni immunologiche locali in randomizzato, studi controllati di farmaci e micronutrienti.

Inizialmente abbiamo implementato la tecnica in studi prospettivi Copenaghen sull'asma nella coorte di infanzia₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀), dove abbiamo determinato il profilo immunitario del rivestimento mucoso fluido nel 7-anno-vecchi bambini con rinite allergica rispetto a controlli sani¹³. Successivamente, abbiamo applicato con successo questa tecnica al gruppo di₂₀₁₀ COPSAC longitudinale e profili immuni valutati delle vie respiratorie a 1 mese, 2 anni e 6 anni di età e alle istanze di sintomi respiratori acuti. Risultati dai neonati 1-mese-vecchio hanno dimostrato importanti associazioni tra la firma immune e l'esposizione ambientale di presto-vita^{7,8,9,10,11,12}.

Protocol

Gli studi sono stati condotti in conformità con i principi della dichiarazione di Helsinki. Sono state ottenute le approvazioni dal comitato etico per Copenhagen (KF 01-289/96 per COPSAC₂₀₀₀ ) e H-B-2008-093 per COPSAC₂₀₁₀e l'Agenzia danese per la protezione dei dati e consenso informato è stato ottenuto da entrambi i genitori di ogni soggetto prima dell'iscrizione.

1. organizzazione sperimentale

1. Utilizzare fogli di carta da filtro (fibrosi idrossilati-poliestere fogli, vedere la Tabella materiali)^6,7.
   1. Tagliare le strisce 3 x 15 mm di dimensione per un 1 mese-vecchio bambino e a forma di L per ragazzi ed adulti (5 x 20 x 10 mm (braccio corto della L)).
2. Inserire un pezzo di carta da filtro in ciascuna narice di un infante usando il forcipe. Posizionare il filtro di carta sulla parte anteriore del Turbinato inferiore (circa 1 cm dentro la narice per neonati e 1,5 cm per tutte le altre età).
   1. Posizionare neonati su un letto e dare loro acqua e zucchero per il comfort.
      Nota: Per i bambini di tutte le altre età, il campionamento viene eseguito più facilmente con il soggetto seduto su una sedia.
   2. Per bambini più grandi, è necessario inserire il braccio lungo della carta da filtro a forma di L in ogni narice.
3. Applicare una clip naso intorno alle narici per ridurre al minimo il disagio e per evitare la perdita accidentale della carta da filtro.
4. Rimuovere la carta da filtro dopo 2 min di assorbimento.
5. Posizionare la carta da filtro in provette e congelarli immediatamente a-80 ° C.
6. Prendere nota di qualsiasi sintomo di infezione delle vie respiratorie indicati dal bambino il giorno del campionamento.
7. Registrare qualsiasi starnuto, pianto persistente o epistassi che si verifica durante i 2 min di campionamento.

2. quantificazione delle vie respiratorie immunitario-mediatori

1. Prendere fino a 10 campioni casuali dal freezer. Registrare i numeri di identificazione. Mantenere i campioni sul ghiaccio durante l'intero processo di lavoro.
2. Dopo lo scongelamento sul ghiaccio, immergere la carta da filtro (per soggetto) da entrambe le narici a 300 µ l di preparati tampone contenente una compressa da inibitore della proteasi completa (Vedi la Tabella materiali) (Vedi la Tabella materiali) per 25 mL di buffer.
   1. Regolare il volume di tampone secondo il formato della carta da filtro.
      1. Utilizzare 300 µ l di tampone per filtri di carta 3 x 15 millimetri nel formato.
      2. Se solo una carta da filtro è disponibile, utilizzare la metà del volume di tampone (150 µ l).
3. Trasferire i campioni di un agitatore per piastre (400 giri/min) per 5 min, uso un timer.
4. Trasferire i filtri di carta umidi e tampone del saggio nella tazza di un filtro di tubo di acetato di cellulosa (dimensione dei pori di 0.22 µm) collocato all'interno di una microcentrifuga tubo (vedere la Tabella materiali).
5. Centrifugare a 16.000 x g per 5 min in una centrifuga refrigerata (a 4 ° C) per ottenere Estratto filtrato nasale nel tubo.
6. Rimuovere la Coppa e mantenere i tubi sul ghiaccio mentre aliquotare l'Estratto nasale nei pozzetti di piastre di deposito associazione basso contenuto proteico (Vedi la Tabella materiali).
7. Conservare a-80 ° C fino all'analisi.
8. Determinare le concentrazioni di citochine e chemochine negli estratti nasali utilizzando un sistema ad alta sensibilità, electrochemiluminesce-based array multiplex (Vedi la Tabella materiali).
   Nota: Un'analisi di umano 10-plex T_H1/T_H2 cytokine, 9-plex chemokine analisi e IL singolo-plex-17A, TGF-β1 e TSLP sono stati eseguiti qui.
   1. Per i dosaggi, Incubare gli estratti nasali durante la notte a 4 ° C. Condurre le misurazioni per il costruttore standard protocollo (Vedi la Tabella materiali).
      Nota: I test immunologici (Vedi la Tabella materiali) in genere hanno un'alta gamma dinamica per misurazione compreso tra il 1 & 10.000 pg/mL, ma per alcuni test, può essere 100.000 pg/mL. Ciò significa che tutti i campioni possono essere eseguiti con la stessa diluizione, limitando così l'influenza delle diluizioni dissimili in soggetti sani e malati, come è il caso in altri simili test immunologici. Il limite inferiore di rilevamento per tutte le citochine era 1 pg/mL o meno e per chemochine, esso ha variato fra 1 & 50 pg/mL. TSLP non era rilevabile nel 98% dei campioni a 1 mese di età.

3. statistiche

1. Registro-trasformare i dati prima dell'analisi per ottenere distribuiti normalmente residui dei livelli di citochine e chemochine.
2. Se i campioni sono analizzati in più di un batch, correggere i dati di citochine e chemochine per centraggio per singoli batch sui dati registro-ha trasformato.
   1. Incorporare la media complessiva e la trasformazione di anti-registro per ottenere i dati nelle unità di misura originale.
      Nota: Per ogni serie di analisi fatto, si consiglia di regolare le variabili che influiscono sul livello di citochine e chemochine. Questo potrebbe essere influenze materne (ad esempio, il consumo di alcol e fumo durante la gravidanza), l'allattamento al seno, gli eventi avversi durante il campionamento, fratelli, animali domestici nella casa, ecc.

Results

Caratteristiche di base dei profili immunitari delle vie aeree:
I dati completi sui livelli di mediatore immunitario della mucosa delle vie aeree superiori a 1 mese di età sono stati ottenuti in 620 (89%) dei 700 bambini arruolati nella coorte COPSAC₂₀₁₀. Dieci neonati sono stati arruolati prima che la tecnica fosse stabilita e 19 non hanno partecipato alla visita di 1 mese. Inoltre, 47 campioni sono stati esclusi perché sono stati estratti e misurati in un...

Discussion

Con la tecnica presentata qui, siamo stati in grado di determinare l'in vivo della superiore-via aerea mucoso profilo immunitario nei bambini da più presto 1 mese di età, che non è stato fatto in precedenza. Abbiamo osservato che la presenza di batteri specifici delle vie respiratorie e picornavirus^7,11, così come altri pre e perinatale esposizioni, sono state rispecchiate nel profilo immunitario delle vie respiratorie dei neonati. Inoltre, abbiamo usato...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lastre fibrose idrossilatein poliestere	Accuwik Ultra	SPR0730	Carta da filtro
Tampone per saggi Milliplex	Millipore	L-AB	Buffer
Piastre di conservazione a basso legame proteico	Thermo Scientific	CLS8161
Piastre Inibitore della proteasi	Roche	11873580001	cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA
Lettore di piastre multi-spot	Mesoscale	NA	Sector imager 6000
Saggi	mesoscala		chemochine a 9 plessi, e IL-17A a plesso singolo, TGF-β 1 e TSLP. Una descrizione può essere trovata online su www.mesoscale.com