Articolo metodologico

Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore

DOI:

10.3791/55800

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7 agosto 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood (COPSAC), Herlev and Gentofte Hospital, University of Copenhagen, 2Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive una tecnica non invasiva per il campionamento del liquido di rivestimento mucoso indisturbati dalle vie respiratorie superiori. Può essere utilizzato per eseguire la quantificazione dei livelli in vivo dei mediatori di proteina, quali citochine e chemochine, in soggetti di tutte le età.

Abstract

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Questo protocollo descrive campionamento non invadente di liquido di rivestimento mucoso delle vie respiratorie superiore indisturbato. E ' anche in dettaglio la procedura di estrazione utilizzata prima dell'analisi di mediatori immuni in eluati fluidi per lo studio della firma immuni topica delle vie aeree, senza la necessità di procedure di stimolazione (spesso utilizzato da altre tecniche). Il liquido di rivestimento mucoso viene campionato su una striscia di carta da filtro posizionato sulla parte anteriore del inferior turbinate e sinistro per 2 min di assorbimento. Analiti vengono eluiti dalla carta da filtro, e gli eluati di base di proteine estratti vengono analizzati da un immunoassay elettrochemiluminescenza-based, che consente per la quantificazione di alto-sensibilità di analiti a basso e alto livello nello stesso campione. Abbiamo misurato i livelli in vivo di 20 mediatori immuni preselezionati legate alla specifica immunitario vie nella mucosa delle vie respiratorie superiore di segnalazione, ma la tecnica non è limitata a quel pannello specifico o il sito di campionamento. La tecnica innanzitutto è stata implementata nei bambini di 7-year-old da studi prospettivi Copenaghen sull'asma nella coorte di2000 (COPSAC2000) di infanzia con rinite allergica. Da allora in poi è stato usato nella coorte di nascita2010 COPSAC longitudinale, provata a 1 mese, 2 anni e 6 anni di età e alle istanze di sintomi respiratori acuti. Abbiamo correttamente acquisiti e analizzati campioni da 620 (89%) di 700 1-mese-vecchi bambini; alcuni campioni erano sotto il limite di rilevamento del test (segnalato come la mediana (Inter-Quartile Range (IQR)). Il numero di campioni di sotto del limite di rilevazione (cioè da 0 al set point per il limite inferiore di rilevamento) per ogni Mediatore era 29 (7,25-119.5). Questa tecnica consente la quantificazione del profilo di in vivo delle vie respiratorie mucose immuni dalla nascita, può essere applicata longitudinalmente e può essere applicata agli studi sull'effetto di genetica e le esposizioni ambientali di presto-vita, patofisiologia, endotyping e il monitoraggio di malattie respiratorie, sviluppo e valutazione di nuove terapie.

Introduzione

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Il liquido di rivestimento mucoso del naso costituisce la parte liquida del sistema della superiore-via aerea. Si compone di una matrice complessa di mediatori derivati dall'interazione tra l'epitelio e cellule immunitarie che compongono la prima linea di difesa contro l'invasione di microrganismi. La mucosa nasale è facilmente accessibile, e c'è una forte relazione funzionale ed immunologica tra il naso e bronchi1. Questo comparto è di particolare interesse in relazione a malattie delle vie respiratorie che sono comuni nell'infanzia, come l'asma e la rinite allergica, ma anche a una serie di altri disturbi respiratori più prevalente più tardi ....

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Protocollo

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Gli studi sono stati condotti in conformità con i principi della dichiarazione di Helsinki. Sono state ottenute le approvazioni dal comitato etico per Copenhagen (KF 01-289/96 per COPSAC2000 ) e H-B-2008-093 per COPSAC2010e l'Agenzia danese per la protezione dei dati e consenso informato è stato ottenuto da entrambi i genitori di ogni soggetto prima dell'iscrizione.

1. organizzazione sperimentale

  1. Utilizzare fogli di carta da filtro (fibrosi idrossilati-poliestere fogli, vedere la Tabella materiali)6,7.
    1. Tagliare le strisce 3 x 15 mm di dimensio....

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Risultati

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Caratteristiche di base dei profili immunitari delle vie aeree:
I dati completi sui livelli di mediatore immunitario della mucosa delle vie aeree superiori a 1 mese di età sono stati ottenuti in 620 (89%) dei 700 bambini arruolati nella coorte COPSAC2010. Dieci neonati sono stati arruolati prima che la tecnica fosse stabilita e 19 non hanno partecipato alla visita di 1 mese. Inoltre, 47 campioni sono stati esclusi perché sono stati estratti e misurati in un.......

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Discussione

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Con la tecnica presentata qui, siamo stati in grado di determinare l'in vivo della superiore-via aerea mucoso profilo immunitario nei bambini da più presto 1 mese di età, che non è stato fatto in precedenza. Abbiamo osservato che la presenza di batteri specifici delle vie respiratorie e picornavirus7,11, così come altri pre e perinatale esposizioni, sono state rispecchiate nel profilo immunitario delle vie respiratorie dei neonati. Inoltre, abbiamo usato.......

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Dichiarazioni

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Tutti gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi potenziale, percepita o reale per quanto riguarda il contenuto di questo manoscritto. Le agenzie di finanziamento non hanno avuto alcun ruolo nell'ideazione e la conduzione dello studio; la raccolta, la gestione e l'interpretazione dei dati; o la preparazione, revisione e approvazione del manoscritto. Nessuna azienda farmaceutica è stato coinvolta nello studio.

Ringraziamenti

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Esprimiamo la nostra gratitudine per i bambini e le famiglie dello studio di coorte COPSAC2010 per tutto il loro sostegno e impegno. Riconosciamo e apprezzare gli sforzi unici della squadra di ricerca COPSAC e l'aiuto tecnico da tecnico Lisbeth Buus Rosholm, Technical University of Denmark, per la misurazione di citochine e chemochine.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lastre fibrose idrossilatein poliestereAccuwik UltraSPR0730Carta da filtro
Tampone per saggi Milliplex MilliporeL-ABBuffer
Piastre di conservazione a basso legame proteico Thermo ScientificCLS8161
Piastre Inibitore della proteasiRoche11873580001cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA
Lettore di piastre multi-spotMesoscaleNASector imager 6000
Saggi mesoscalachemochine a 9 plessi, e IL-17A a plesso singolo, TGF-β 1 e TSLP. Una descrizione può essere trovata online su www.mesoscale.com
Saggio delle citochine TH1/TH2 a 10 plessi umani a e test delle

Riferimenti

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  1. Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
  2. Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflamm....

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Quantificazione dei mediatori immunitariassorbimento su carta da filtrosaggio immunoenzimatico a chemiluminescenza elettrochemicaanalisi dell estratto nasalesupplementazione di inibitori delle proteasiconservazione a basso legame proteicomalattie respiratorie pediatriche

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