Preparazione su media scala di Drosophila Estratti di embrioni per esperimenti proteomici

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un approccio semplice e poco costoso per la raccolta di embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g) e la preparazione di estratti proteici che possono essere utilizzati nelle applicazioni proteomiche a valle, come la spettrometria di massa di purificazione-affinità (AP-MS ).

Abstract

L'analisi delle interazioni proteine-proteine ​​(PPI) è diventata un approccio indispensabile per studiare processi e meccanismi biologici, come la segnalazione cellulare, lo sviluppo dell'organismo e la malattia. Spesso è auspicabile ottenere informazioni PPI utilizzando materiale in vivo , per ottenere la visione più naturale e imparziale delle reti di interazione. La mosca di frutta Drosophila melanogaster è un'ottima piattaforma per studiare i PPI in vivo e si presta ad approcci semplici per isolare il materiale per esperimenti biochimici. In particolare, gli embrioni a base di frutta rappresentano un tipo di tessuto conveniente per studiare PPI, a causa della facilità di raccolta degli animali in questa fase di sviluppo e del fatto che la maggior parte delle proteine ​​sono espresse in embriogenesi, fornendo così un ambiente rilevante per rivelare la maggior parte dei PPI. Qui presentiamo un protocollo per la raccolta di embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g), che è una quantità ideale per una vasta gamma diApplicazioni proteomiche, compresa l'analisi di PPI per purificazione di affinità-spettrometria di massa (AP-MS). Descriviamo i nostri disegni per le gabbie da 1 L e 5 L per le collezioni di embrioni che possono essere facilmente e poco costose in qualsiasi laboratorio. Inoltre forniamo un protocollo generale per la raccolta di embrioni e per l'estrazione di proteine ​​per generare lisati che possono essere utilizzati direttamente nelle applicazioni a valle, ad esempio AP-MS. Il nostro obiettivo è quello di fornire un mezzo accessibile a tutti i ricercatori per effettuare le analisi di PPI in vivo .

Introduzione

Gli schermi genetici e, più di recente, gli approcci genomici hanno rivoluzionato lo studio delle funzioni biologiche. Tuttavia, importanti informazioni cellulari sono codificate in proteine ​​e nel loro insieme di partner interagenti. Mentre le schermate di modifica genetica tradizionali possono identificare componenti di percorso che limitano il tasso e recuperare interazioni indirette, la forza degli approcci proteomici è nella loro capacità di identificare reti complete di interazione immediata di proteine ​​di interesse. La proteomica è quindi un prezioso metodo ortogonale per studiare sistemi biologici e completa la genomica, le trascrizioni e gli schermi genetici tradizionali. La spettrometria di massa di purificazione di affinità (AP-MS) ha dimostrato di essere un approccio potente per studiare le interazioni proteine-proteine ​​(PPI) nel loro ambiente nativo nelle cellule e nei tessuti ^{1 , 2} . Questo metodo consente di identificare interazioni dirette o indirette in uno sviluppo specificoStadi o contesti tissutali ed è stato utilizzato con successo per identificare più PPI nuovi in ​​una varietà di percorsi di sviluppo (riveduti nel riferimento ¹ ). Nonostante il successo indiscusso degli studi PPI, la maggior parte di essi è stata effettuata in cellule colte, in cui le proteine ​​"esche" di interesse sono state sovraespresse. Ci sono due problemi con lo studio di PPI nella cultura cellulare: in primo luogo, una linea cellulare specifica non può fornire un completo complemento di interazioni a causa della mancanza di espressione di determinate proteine. In secondo luogo, un'alta sovraespressione di solito impiegata in tali analisi potrebbe portare a manufatti come la misfolding della proteina o l'identificazione di interazioni false positive.

Entrambe queste limitazioni possono essere superate analizzando i PPI in vivo . Una fase di limitazione in tali esperimenti è la disponibilità del materiale di partenza per la purificazione di complessi proteici. Drosophila melanogaster è da tempo utilizzato come modello per l'analisi funzionaleSis, e recentemente è anche stato dimostrato di essere un eccellente sistema per lo studio di PPI in vivo . L'embriogenesi di Drosophila rappresenta un tipo di tessuto particolarmente attraente per studiare i PPI, perché gli embrioni possono essere facilmente raccolti in grandi quantità e anche perché la maggior parte dei geni (> 88%) sono espressi nel corso dell'embrenogenesi, fornendo così un ambiente ricco in vivo per rilevare le PPIs ³ .

Tradizionalmente, studi biochimici sulle mosche usavano raccolte di embrioni su larga scala (100-150 g), come quelle necessarie per la purificazione di lisati transcrizionali funzionali ^{4 , 5} . Precedenti studi AP-MS in Drosophila necessitano anche di grandi quantità di embrioni (5-10 g), poiché si sono basati su un approccio di purificazione a due fasi, come la tatim di affinità tandem (TAP), con la conseguente perdita di materiale in ogni fase ⁶ . Grande amounTs di materiale di partenza ha richiesto la creazione di collezioni di embrioni in grandi gabbie di popolazione, che possono essere costose (quando acquistate in commercio) e richiedono molto tempo per mantenere e pulire ^{7 , 8 , 9} .

I progressi recenti nello sviluppo di approcci di purificazione di affinità a singola fase, nonché la crescente sensibilità degli spettrometri di massa, hanno ridotto la quantità necessaria di materiale di partenza per un ordine di grandezza. Utilizzando tag come il peptide legante streptavidina (SBP) o la proteina fluorescente verde (GFP) e partendo da meno di 1 g di embrioni, è possibile isolare le quantità della proteina dell'esca e dei componenti interagenti che sarebbero sufficienti per l'identificazione Spettrometria di massa ^{10 , 11} .

L'obiettivo del protocollo qui presentato è quello di aiutare i ricercatori a superareUna barriera percepita all'analisi biochimica dei PPI in vivo . A tal fine, forniamo una procedura semplice e poco costosa per raccogliere embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g), seguita da una fase di preparazione di estratti proteici interi di cellule che sono idonei per l'analisi successiva da AP-MS o da altri approcci . Il nostro metodo si basa sull'utilizzo di gabbie di popolazione personalizzate da 1 o 5 L che possono essere facilmente prodotte da qualsiasi laboratorio. Inoltre, le condizioni di estrazione qui presentate sono state convalidate in diversi studi, sia in cellule colte che in vivo ^{10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} .

Protocollo

1. Preparazione di 5 gabbie di mosche (per inserire piatti da 15 cm)

1. Ottenere i materiali necessari: contenitore da 5 quart (4.7 litri) con coperchio ( figura 1A ), maglia in nylon e una lama di rasoio.
2. Segnare un cerchio di 12 cm di diametro e tagliare un foro nella parte inferiore del contenitore utilizzando la lama del rasoio ( figura 1B ). Tagliare un foro di diametro di 15 cm nel coperchio ( figura 1C ).
3. Taglia la maglia di nylon in piazze da 25 x 25 cm.
4. Mettere la maglia sul bordo superiore del contenitore e premere con il coperchio ( figura 1C ). Assicurarsi che la maglia sia fissa e che il coperchio non sia inclinato. La gabbia è pronta per essere popolata da mosche (vedere la fase 5.3).

2. Preparazione di 1 L gabbie di mosca (per piatti da 10 cm)

1. Ottenere i materiali necessari: un trapano elettrico, uno strumento di taglio da 3 pollici (76 mm) ( Figura 1E e FIgure 1F), un vaso di plastica 1 L con coperchio, maglia in nylon, una lama di rasoio, carta vetrata, occhiali e guanti da lavoro.
2. Tagliare i fori da 3 pollici (76 mm) nel fondo e il coperchio del vaso di plastica ( figura 1G ), con il coperchio avvitato a fondo sul contenitore durante la perforazione. Posizionare l'utensile di taglio al centro del cerchio quando inizierà a fare un foro.
   Attenzione: indossare protezione degli occhi e guanti di lavoro durante questo passaggio.
3. Smoothen i bordi dei fori con una lama di rasoio e carta vetrata.
4. Taglia la maglia di nylon in quadrati di 18 x 18 cm.
5. Mettere la maglia sul bordo superiore del vaso e stringere avvitando il coperchio ( Figura 1G ). Assicurarsi che la maglia sia fissa e che il coperchio non sia inclinato. La gabbia è pronta per essere popolata da mosche (vedere la fase 5.3).

3. Preparazione di piatti di succo di mela (AJ)

1. Aggiungere 19 g di agar e 1 L di 18,2 MΩ · cm di acqua in un pallone da 2 L.Aggiungere una barra di agitazione e mescolare brevemente.
2. Autoclave per 30 min. Nel frattempo, scongelare il 100% di succo di mele concentrato da scorta congelata e preparare 10 ml di 10% (peso / volume) metil 4-idrossibenzoato soluzione in etanolo.
3. Dopo l'autoclavazione, iniziare a mescolare l'agar su una piastra di mescolanza e aggiungere al campione 80 ml di concentrato di succo di mela al 100% e 10 ml di 10% (peso / volume) di metile 4-idrossibenzoato. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente con miscelazione costante.
4. Versare i piatti di Petri da 15 cm (per 5 gabbie da caccia) o piatti di Petri da 10 cm (per gabbie da 1 L) in modo che il livello di agar in ciascun piatto sia di circa 5 mm di spessore. Lasciare solidificare a temperatura ambiente e avvolgere in sacchetti di plastica. Le piastre AJ possono essere conservate a 4 ° C per due settimane.
   Nota: i piatti di Petri possono essere lavati e riutilizzati.
5. Preparare la pasta di lievito umido: versare un lievito secco attivo in un contenitore da 100 ml con un coperchio che permetterebbe una facile miscelazione e aggiungere acqua in piccole quantità mentre si agita, per ottenere uno spesso ma ben miscelatoincolla. Conservare a 4 ° C fino a 2 settimane.

4. Preparazione di reagenti di lisi

1. Preparare un tampone di lisi di 5x: 250 mM Tris pH 7,5, 25% glicerolo, 1% ottilfenossi poli (etileneossil) etanolo (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na ₃ VO ₄ .
   1. Per ottenere 200 ml: sciogliere completamente 1 g di NaF e 184 mg di Na ₃ VO ₄ in 71 ml di acqua con agitazione continua. Aggiungere 50 mL 1 M Tris pH 7,5, 2 mL 100% IGEPAL, 1,5 mL 1 M MgCl ₂ e 25 mL 5 M NaCl. Quindi aggiungere 50 ml di glicerolo (aggiungere ultimo) e continuare a mescolare per 1 h.
   2. Filtro-sterilizza usando unità filtranti da 250 ml. Questo passo può essere lento, ma filtrare la soluzione è importante per rimuovere particolati insolubili. Aliquota di 10 mL in tubi da 50 mL e conservare a -80 ° C.
2. Preparare la soluzione di dithiothreitol (DTT) da 1 M in acqua. Conservare a -20 ° C in aliquote di 1 ml.
3. Ottenere proteAse inibitore, con acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA). Conservare a 4 ° C.
4. Ottieni 10 ml di siringhe e filtri a siringa: 26 mm di diametro, membrana di cellulosa acetosa libera da tensioattivi (SFCA), dimensione dei pori di 0,45 μm.

5. Raccolta di embrioni di volatili

1. Amplificare le linee di mosche transgeniche che trasportano la proteina tagliata di interesse in bottiglie (circa 100 mosche per bottiglia) e trasferire le bottiglie ogni 2 giorni fino a 25-30 bottiglie accumulate per ogni linea di mosca. Amplificare lo stock di controllo ( ad es. La linea yw ) in modo simile.
2. Le piastrine AJ calde a temperatura ambiente (circa 1-2 h, possono essere fatte durante la notte). Utilizzando un dito guantato, spalmare una pasta di lievito umido al centro delle piastre AJ, per fare una ca. Cerchio da 6 cm per una piastra di 15 cm e un cerchio di 4 cm per una piastra da 10 cm.
3. Anestetizzare le mosche con un flusso di anidride carbonica usando una configurazione standard di stage Drosophila e trasferirli inLe gabbie (circa 15 bottiglie di mosche per 5 L gabbia, 5 bottiglie per 1 gabbia L).
   1. Coprire il fondo della gabbia con piastre AJ preparate dalla fase 5.2 e nastro il piatto AJ alla gabbia utilizzando due strisce di nastro ( figure 1D e 1H ). È utile ripiegare le punte del nastro che attraversano la piastra per facilitare la sbucciatura quando si cambiano le lastre.
   2. Dopo che le mosche si riprendono dall'anestesia, tenere le gabbie con le piastre in basso e maglia in cima.
      Nota: è importante attendere fino a quando le mosche si riprendono completamente, poiché altrimenti si attaccheranno alla piastra AJ e alla pasta di lievito.
   3. Alla fine dell'esperimento, per preparare la gabbia per la pulizia, mettere la gabbia nel congelatore per diverse ore. Assorbire la maglia in acqua per poche ore faciliterà la pulizia.
4. Incubare le gabbie con le mosche a temperatura ambiente per 2-3 giorni e cambiare le piastre AJ due volte al giorno. Per cambiare le piastre, girare la gabbia a testa in giù,Scollegare il nastro dalla piastra, ma tenere la piastra alla gabbia, sfiorare tutta la gabbia dolcemente sul banco e rapidamente scambiare la vecchia piastra per una nuova, cercando di non permettere che le mosche scappino.
   Nota: Le mosche necessitano di adattarsi alla gabbia e si posizioneranno meglio a partire dal giorno 3. Continueranno a posizionare a livello di picco per circa 4-5 giorni. Due gabbie da 5 L alla massima capacità di posa possono produrre fino a 1 g di embrioni in una raccolta notturna. Usare 1 gabbie L per esperimenti su piccola scala.
5. Permettono alle mosche di emettere piante di AJ fresche durante la notte (circa 16 ore) o per qualsiasi altra durata desiderata.
6. La mattina successiva, contrassegnare e pesare i contenitori per la raccolta di embrioni, uno per ogni linea di mosca utilizzata.
7. Preparare il tampone di lisi 1x utilizzando i reagenti della sezione 4 (Nota: il tampone di lisi pronto per l'uso deve essere preparato subito prima dell'estrazione): aggiungere 40 mL di acqua a 10 mL di tampone di lisi concentrato a 5x (conservato a -80 ° C) In un tubo da 50 ml.
   1. Aggiungere 50 μl di 1 MDTT ad una concentrazione finale di 1 mM, mescolare bene e separare in due tubi da 50 mL, ciascuno di 25 mL. Ad uno dei tubi, aggiungere una compressa inibitori della proteasi e ruotare a 4 ° C per 30 min. Mentre la compressa sta dissolvendo, raccogliere e decifrare gli embrioni (passaggi da 5.8 a 6.6). Controllare per assicurarsi che la compressa sia completamente sciolta e mantenere il tampone in ghiaccio.
      Nota: il secondo tubo di tampone 1x con DTT può essere memorizzato a -80 ° C e richiede solo l'aggiunta della tavoletta prima dell'esperimento successivo. 25 ml di tampone di lisi è sufficiente per un massimo di 2 campioni, tenendo conto delle successive lavaggi durante i passaggi di purificazione proteica.
8. Segna le piastre AJ sulle gabbie con i genotipi delle linee di mosche utilizzate e scambia le piastre per fresche.
   Nota: in questa fase è possibile strappare la pasta di lievito fuori dalla piastra. Gli embrioni possono essere invecchiati sulle piastre a 25 ° C oa temperatura ambiente per ottenere la finestra desiderata del tempo di sviluppo.
9. Aggiungere abbastanza acquaCoprire ogni piastra AJ. Spostare delicatamente gli embrioni dalla piastra con una spazzola morbida (una testa piatta circa 10 mm di larghezza funziona bene per le piastre grandi). Versare gli embrioni nel contenitore di maglie precedentemente pesato e marcato e scaricare l'acqua in eccesso.
   1. Se necessario, eseguire un secondo lavaggio e spazzolatura della piastra per rimuovere tutti gli embrioni. Unire gli embrioni da piastre aggiuntive per la stessa linea di mosca nello stesso contenitore di maglie.
10. Scorrete brevemente la maglia sugli asciugamani per rimuovere l'acqua in eccesso.

6. Dechorionation dell'embrione

1. Mescolare un piatto di Petri da 6 cm con una candeggina del 50% (vol / vol in acqua).
   Nota: vedere importanti commenti sulla marca della candeggina nella Tabella dei Materiali e dei Reattivi.
   Attenzione: indossare guanti e evitare di ottenere candeggina sui vestiti.
2. Preparare 2 piatti grandi Petri con acqua.
3. Immergere il contenitore di maglie con embrioni in candeggina al 50% per 90 s. Tocca la maglia dolcemente durante l'incuBazione un paio di volte per sospendere gli embrioni nella soluzione di candeggina.
4. Alla fine dell'incubazione a 90 s, lavare il contenitore di rete in ognuno dei due piatti con acqua per circa 10 s.
5. Sciacquare accuratamente il contenitore della maglia con acqua di 18,2 MΩ · cm utilizzando la bottiglia dello spruzzo. Inoltre, lavare i lati e l'esterno del contenitore della maglia.
   Nota: non deve essere rilevato alcun odore di candeggina dopo un lavaggio approfondito.
6. Blot il contenitore di maglie sugli asciugamani di carta. Pesare il contenitore della maglia con gli embrioni e sottrarre il peso del contenitore vuoto ottenuto al punto 5.6. Registrare il peso risultante degli embrioni. Una buona quantità di embrioni da puntare è di 0,5 - 1 g.

7. Preparazione dell'estratto di embrioni

1. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi con gli inibitori della proteasi (dal punto 5.7) ad un omogeneizzatore di vetrino e tenerlo su ghiaccio. Trasferire gli embrioni dal contenitore della maglia nell'omogeneizzatore.
   Nota: gli embrioni possono essere prelevati con un estremo piano oFa spatola metallica o una spazzola e trasferiti direttamente nel tampone. Eseguire tutte le fasi di questa sezione su ghiaccio.
2. Lavare gli embrioni rimanenti sulla maglia con un ulteriore 1 ml di tampone di lisi e aggiungere al materiale nell'omogenizzatore. Lasciate che gli embrioni si stabiliscano fino alla base dell'omogeneizzatore e aspira attentamente il surnatante.
3. Aggiungere il tampone di lisi con inibitori della proteasi (dal punto 5.7) all'omogenizzatore, mirando a 5-6 ml di tampone di lisi per grammo di embrioni.
4. Omogeneizzare gli embrioni con 4-6 colpi con un pestello adatto.
   Nota: Durante i primi tratti, ci sarà più resistenza. Cercare di spostare il pestello in un movimento continuo per evitare di spruzzare la soluzione.
5. Omogeneizzare gli embrioni con 8-10 colpi con un pestello aderente.
6. Incubare l'omogenato su ghiaccio per 20 min.
7. Trasferire l'omogeneato in tubi di microcentrifuga e centrifugare a 4 ° C per 15 minuti alla massima velocità (circa 13.000 xg).
8. AvoidiI pellet e lo strato di lipidi molto alti, trasferiscono i supernatanti in tubi di microcentrifuga freschi e centrifugano a 4 ° C per 15 minuti alla massima velocità (circa 13.000 xg).
9. Aspirare con delicatezza i supernatanti con una punta da 1 ml e caricarli in refrigerate siringhe da 10 mL con filtri da 0,45 μm collegati (combinare aliquote dello stesso campione in una siringa). Spingere tutta la soluzione in un tubo di 15 ml etichettato sul ghiaccio. L'estratto può essere utilizzato immediatamente per ulteriori esperimenti di purificazione della proteina o congelato in azoto liquido e mantenuto a -80 ° C per uso futuro.
   Nota: è meglio congelare gli estratti piuttosto che gli embrioni, perché durante la successiva scongelazione di embrioni le proteasi possono diventare attivate e portare alla degradazione delle proteine.

Risultati

Per illustrare l'uso di questo protocollo in un esperimento di purificazione complessa di proteine, abbiamo generato una linea fly flygable omozigote, arm-EGFP-ERK , che esprimeva EGFP-tagged Drosophila chirurgia extracellulare-regolata (ERK, codificata dal gene laminato ) sotto il controllo Di un promotore armadillo ( braccio ) espresso in modo omnicomprensivo ^{18 , 19} . Il pro...

Discussione

Il protocollo qui presentato è una procedura semplice e generale per la creazione di gabbie di popolazione Drosophila a media scala e la realizzazione di proteine ​​intere di cellule da embrioni. Gli estratti risultanti possono essere utilizzati in una varietà di applicazioni a valle, come la purificazione di complessi proteici sulle resine di affinità. È fondamentale eseguire le fasi di estrazione sul ghiaccio e utilizzare una forte inibizione della proteasi, per minimizzare il degrado delle proteine. Come des...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Leaktite 5-Qt. Contenitore Multi Mix Naturale (Confezione da 3)	Home Depot	209330	Per realizzare gabbie da 5 L.
Leaktite 5-Qt. Coperchio Multi Mix Naturale (Confezione da 3)	Home Depot	209320	Diametro 8,37 in. Coperchi per gabbie da 5 litri.
Piastre Petri Fisherbrand con coperchio trasparente, 100 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875712	Materiale: Polistirolo. Da utilizzare con gabbie da 1 L.
Piastre Petri Fisherbrand con coperchio trasparente, 150 x 15 mm	Fisher Scientific FB0875714		Materiale: Polistirolo. Da utilizzare con gabbie da 5 litri.
Fisherbrand Piastre Petri con coperchio trasparente, 60 x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A	Materiale: Polistirolo. Utilizzato durante la decorionazione dell'embrione.
Sefar NITEX rete in nylon	Sefar	03-180/44	180 micron, 44% area aperta, utilizzata per gabbie antimosche.
Milwaukee 3 pollici. Sega a tazza apripista con Arbor	Home Depot	49-56-9670	Utensile da taglio da 3 pollici per la realizzazione di gabbie da 1 L.
Barattoli in PMP a bocca larga Nalgene con chiusura a vite in polipropilene bianco	Fisher Scientific	11-823-33	Per la realizzazione di gabbie da 1 L. Thermo Scientific gatto # 21171000. È possibile utilizzare contenitori alternativi da 1 L.
Lievito secco attivo Red Star, busta da 2 libbre	Red Star		Può essere acquistato da Amazon.com o da altri fornitori.
Concentrato di succo di mela congelato al 100%			Può essere acquistato in un negozio di alimentari. Deve dire "100% succo di mela" sulla lattina.
Il metil4-idrossibenzoato	Acros Organics	AC126965000	noto anche come metilparabene o Tegosept. Usato come conservante nelle piastre AJ.
IGEPAL CA-630 per biologia molecolare, 100 ml	Sigma	I8896	utilizzato per la preparazione del tampone di lisi.
Unità filtranti monouso sterili a flusso rapido Nalgene con membrana CN	Fisher Scientific	09-740-2A	0,2 μ m dimensione dei pori. Utilizzato per filtrare il tampone di lisi 5x. Thermo Scientific gatto # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor	Sigma	11697498001	Flaconcino da 20 compresse. Utilizzato per l'inibizione della proteasi nel tampone di lisi.
Filtri per siringhe Corning SFCA	Fisher Scientific	09-754-21	Membrana SFCA, diametro 26 mm, dimensione dei pori 0,45 &m. Utilizzata per filtrare i campioni di estratto finale.
BD  Siringhe monouso Luer-Lok senza aghi	Fisher Scientific	14-823-2A	per filtrare i campioni di estratto finale. BD gatto # 309604.
La candeggina	Clorox		utilizzata per la decorionazione degli embrioni al 50% (vol/vol) in acqua, può essere acquistata in qualsiasi supermercato. È importante utilizzare il marchio Clorox, poiché altre marche possono causare una decorionazione incompleta o possono essere tossiche per gli embrioni.
Corning Costar Netwell Plates	Fisher Scientific	07-200-213	contenitori a rete per collezioni di embrioni. 74 μ m dimensione della maglia, 6 pozzetti.
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacità 15 ml	Fisher Scientific	06-435B	omogeneizzatore per embrioni, con pestelli sciolti e stretti. Gatto Wheaton # 357544.