Articolo metodologico

Metodi per l'estrazione di Endosymbionts dalla Whitefly Bemisia tabaci

DOI:

10.3791/55809

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19 giugno 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un protocollo per isolare endosymbionts dalla whitefly Bemisia tabaci attraverso la dissezione e la filtrazione. Dopo l'amplificazione, i campioni di DNA sono idonei per sequenziare e studiare successivamente il mutualismo tra endosymbionts e whitefly.

Abstract

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I simbionti batterici formano una relazione intima con i loro ospiti e conferiscono vantaggi agli ospiti nella maggior parte dei casi. Le informazioni genomiche sono fondamentali per studiare le funzioni e l'evoluzione dei simbionti batterici nel loro ospite. Poiché la maggior parte dei simbionti non possono essere coltivati in vitro , sono molto importanti metodi per isolare un'adeguata quantità di batteri per il sequenziamento dei genomi. Nella bianca Bemisia tabaci , sono stati identificati diversi endosymbionts e sono previsti di grande importanza nello sviluppo e nella riproduzione dei parassiti attraverso approcci multipli. Tuttavia, il meccanismo che sostiene le associazioni rimane in gran parte sconosciuto. L'ostacolo deriva parzialmente dal fatto che gli endosymbionts in whitefly, perlopiù restrittivi nei batteriociti, sono difficili da separare dalle cellule ospite. Qui riportiamo un protocollo passo per passo per l'identificazione, l'estrazione e la purificazione di endosymbionts dalla bianca B. tabaci principalmente da dissectiOn e filtrazione. I campioni di endosimbione preparati con questo metodo, pur essendo ancora una miscela di diverse specie endosimbiotici, sono adatti per la sequenza successiva del genoma e l'analisi dei possibili ruoli degli endosimbiotici in B. tabaci . Questo metodo può anche essere usato per isolare endosymbionts da altri insetti.

Introduzione

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I batteri che formano una relazione intima e simbiotica con i relativi padroni sono diffusi negli artropodi1. Gli endosymbionts sono stati dimostrati di influenzare gli aspetti degli ospiti, come il metabolismo nutrizionale, la riproduzione, le risposte alle sollecitazioni ambientali 2 , 3 , 4 ecc . In quasi ogni fase di sviluppo 5 . Tuttavia, il meccanismo che sostiene le associazioni resta ancora in gran parte sconosciuto. La genomica è di priorità ed importanza quando studia le potenziali funzioni ei ruoli dei batteri. Alcune informazioni fondamentali, vale a dire lo status tassonomico, i geni funzionali, i percorsi di metabolismo, i sistemi di secrezione, possono essere dedotti dalle sequenze genomiche, che spariscono le potenziali ruoli dei simbionti in simbiosi. Con lo sviluppo di sequenziamenti ad alta percentuale, sono stati sequenziati un vasto numero di genomi battericiIth diverse funzioni rivelate 6 .

Gli endosimbieti sono di vitale importanza per gli emipterani, quali gli afidi 7 , i cimici 8 , i psyllids 9 , i pianthoppers marroni 10 e le cicale 11 . Per esempio, Buchnera negli afidi, come il simbiont obbligatorio, è stato dimostrato di essere coinvolto nella biosintesi essenziale di aminoacidi, insieme ai geni del genoma aphid 12 . Inoltre, viene rivelata anche la regolazione trascrizionale di Buchnera 13 . In psyllids , Carsonella viene sequenziato e classificato il genoma batterico più piccolo mai trovato 14 . Tutti questi segni distintivi degli endosymbionts sono basati e dedotti dalle sequenze del genoma. Poiché questi endosymbionts non possono essere coltivati in vitro , sono stati applicati diversi approcci per isolare batteri adeguati per sequenzare. Negli afidi, gli endosimbieti vengono estratti mediante centrifugazione e filtrazione e sottoposti ad ulteriore analisi genomica e transcriptomica 5 . Nelle piante marrone, gli endosimbieti sono sequenziati insieme a tutto il genoma degli insetti 10 .

Whitefly B. tabaci è un complesso di specie che contiene più di 35 specie morfologicamente indistinguibili (specie criptiche), tra le quali due specie invasive hanno invaso in tutto il mondo e hanno causato enormi danni alla produzione agricola 15 . Da notare, endosymbionts all'interno delle specie B. tabaci hanno mostrato importanza nello sviluppo dei parassiti 16 . Fino ad oggi sono stati identificati otto endosimbiotici, tra cui il simbionto obbligatorio, Candidatus Portiera aleyrodidarum e sette simbionti secondari Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium ,Em> Wolbachia, Fritschea e Hemipteriphilus definito 17 , 18 .

A differenza degli hemipterani descritti in precedenza, la bianca B. tabaci è un insetto estremamente piccolo solo di 1 mm di lunghezza. La maggior parte degli endosymbionts sono limitati ai bacteriosi 19 (cellule specializzate contenenti simbioni, che formano ulteriormente il batterio in B. tabaci ). Inoltre, questi endosymbionts non possono essere coltivati in vitro . L'unico modo per ottenere endosymbionts da B. tabaci è quello di disseccare il batterio fuori. Tuttavia, c'è difficoltà nella dissezione. Innanzitutto, il fragile batterioma si collega sempre con altri tessuti della bianca, difficilmente separabile. In secondo luogo, la piccola dimensione della bianca limita l'isolamento di batteriomi sufficienti. In terzo luogo, l'endosymbionts cluster nel batterio, rendendo estremamente complicato l'acquisizione di una singola specie di batterio.

Qui segnalate un protocollo semplice e poco costoso per isolare endosymbionts di whitefly per successivi sequenziamenti di metagenomi. Attraverso la dissezione, la purificazione e l'amplificazione, si ottiene un adeguato DNA endosymbiont e la specie di batteri poteva essere confermata. Il protocollo descritto può essere usato in modo analogo in altri artropodi.

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Protocollo

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1. Identificazione delle specie di recupero di Whitefly e delle specie crittiche

  1. Mantenere le specie bianche in cotone Gossypium hirsutum (Malvaceae) (c.Zhe-Mian 1973) in gabbie in condizioni standard di 27 ± 1 ° C, umidità di 70 ± 10% e luce di 14 h: regime di 10 ore scuro.
  2. Raccogliere una singola adulte bianca e omogeneizzare in 30 μl di tampone di lisi (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt / vol] Tween-20, gelattina 0,2% [wt / vol], 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / mL Proteinasi K).
  3. Incubare l'omogenato a 65 ° C per 1 ora e poi 100 ° C per 10 min.
    NOTA: il tempo di incubazione a 65 ° C può essere aumentato se necessario. Il tempo di incubazione a 100 ° C deve essere controllato in modo critico per inattivare sufficientemente la Proteinase K ed evitare danni al DNA.
  4. Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) usando il DNA di Whitefly (acquisita nella sezione 1.3) basata su primers mitocondriali di citocromo ossidasi I.
    COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
    COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '
    1. Eseguire le reazioni PCR in un volume finale di 25 μL contenente 1 U di Taq DNA polimerasi, 2,5 μL di 10 volte di tampone, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM di ciascun primer e 2 μL di DNA bianca.
    2. Utilizzare le seguenti condizioni di procedura PCR: denaturazione iniziale 95 ° C per 3 minuti seguito da 35 cicli di 95 ° C per 45 s (denaturazione), 50 ° C per 45 s (annealing) e 72 ° C per 1 min (estensione) e Altri 10 minuti a 72 ° C per ulteriore estensione.
  5. Pulire il prodotto amplificato PCR utilizzando un kit di estrazione del DNA con il protocollo raccomandato.
  6. Sequenza dei campioni di DNA purificato con un sistema di sequenziamento dei campioni di DNA seguendo le istruzioni del produttore.
  7. Analizzare le sequenze usando lo strumento di ricerca di allineamento locale di base (BLAST) per identificare le specie cretiche della bianca e evitare la contaminazione di altre species.

2. Identificazione e localizzazione endosimbiotica

  1. Eseguire il PCR sul DNA della bianca (acquisito nel passo 1.3) per amplificare i geni specifici di ciascuna endosymbiont all'interno della bianca (la ricetta PCR è descritta nel paragrafo 1.4 e le procedure e i primer PCR sono elencati nella tabella 1 ).
  2. Soggetto il campione amplificato all'elettroforesi del gel agarosico secondo il protocollo 20 precedentemente pubblicato (1% agarosio gel, Tris-acetato-EDTA come buffer di esecuzione, tensione 5 V / cm) per identificare il gene specifico di ogni batterio.
  3. Recuperare e sequenziare ciascuna fascia per determinare la specie batterica all'interno della bianca (vedere paragrafi 1.5-1.7).
  4. Eseguire fluorescenza in ibridizzazione in situ (FISH) in whiteflies per identificare la localizzazione degli endosymbionts secondo il protocollo 19 precedentemente pubblicato.
    NOTA: aumentare la concentrazione delle sonde fluorescenti se necessario.

3. Microscopia elettronica di trasmissione (TEM)

  1. Immergere e fissare le bianche in tampone di fosfato (0,1 M, pH 7,0) contenenti glutaraldeide di 2,5% [vol / vol] per 4 ore.
  2. Lavare i campioni in tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0) tre volte, 15 minuti ogni volta.
  3. Immergere e fissare nuovamente i campioni in tampone di fosfato (0,1 M, pH 7,0) contenenti 1% [wt / vol] OsO 4 per 2 ore.
  4. Dehidrate i campioni con una serie di etanolo gradito (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100%), 15 minuti ogni volta.
  5. Trasferire e immergere i campioni in acetone al 100% per 20 minuti.
  6. Posizionare i campioni in miscela di acetone al 100% e resina 100% Spurr (1: 1) per 1 h a temperatura ambiente.
  7. Trasferire i campioni in miscela di acetone al 100% e resina 100% Spurr (1: 3) per 3 ore a temperatura ambiente.
  8. Trasferire e immergere i campioni in resina 100% Spurr (incubata a 70 ° C) per più di 9 h.
  9. Seguire i campioni bianchi usando un microper me.
  10. Macchiare i film ultra-sottili (acquisiti nella sezione 3.9) immersione in acetato assoluto di uranile per 5-10 min, seguita da immersione nel citrato alcalino al piombo al 50% per altri 5-10 min.
    NOTA: I volumi dei reagenti utilizzati nella sezione 3.1-3.10 dipendono dai campioni. Assicurarsi che i campioni siano immersi nei reagenti.
  11. Osservare i campioni sotto microscopia elettronica di trasmissione (15.000x) per determinare la localizzazione, la forma e la dimensione dei batteri per ulteriore uso (vedere paragrafo 4.6).

4. Disettazione e purificazione di Whitefly Bacteriome

  1. Aggiungere 100 μL di soluzione 1x PBS su uno scivolo a microscopio. Scegli le ninfe di 3 o 4 ° istare dalle foglie di cotone e immergetele nella soluzione PBS.
  2. Utilizzare aghi entomologici fine sotto uno stereomicroscopio e tirare fuori i batteri dal corpo del mulino.
    1. Tagliare delicatamente un foro su un lato della ninfa e premere leggermente l'altroLato per lasciare i batteri fuori.
  3. Montare un microelaboratore da 20 μL (con il taglio finale terminato per soddisfare le dimensioni del batterioio) su una pipetta da 0,5-10 μL. Estrarre il batterioio individuale dalla soluzione PBS nel microelaboratore.
  4. Lavare il batterio per eliminare la contaminazione di altri tessuti bianchi pipettando il batterioio nella soluzione PBS ed estraendo il batterio. Ripetere tre volte.
  5. Immediatamente pipettare il batterio lavato in un tubo di centrifuga contenente 60 μL di soluzione 1x PBS.
  6. Siringa-filtra il batterio assemblato attraverso una membrana filtrante da 5 μm (determinata per dimensioni di batteri e nucleo batteriociente in bianca). Ripetere più volte per spostare completamente il liquido miscelato attraverso la membrana del filtro.
    NOTA: Per ottenere un risultato migliore dell'amplificazione e del sequenziamento, raccogliere più di 100 batteriomi. Bagnare la membrana filtrante prima utilizzando la soluzione 1x PBS per diminuire la perdita di batteriLegandosi alla membrana.

5. Amplificazione degli endosymbiont Genomes

  1. Amplificare il filtrato (contenente prevalentemente gli endosimbiotici della bianca) utilizzando un kit di amplificazione del DNA dal protocollo raccomandato con qualche modifica.
    1. Scegliere il protocollo di amplificazione del DNA genomico da sangue o cellule e preparare il buffer D2 per l'esperimento successivo.
    2. Aggiungere direttamente 1,5 μl di filtrato (vedi sezione 4.6) al tubo di centrifuga, seguita da 1,5 μL del Tampone D2 e ​​mescolare bene.
    3. Incubare su ghiaccio per 10 min e aggiungere 1,5 μL della soluzione di arresto.
    4. Aggiungere 15 μL del tampone di reazione e 1 μL della DNA polimerasi e mescolare delicatamente.
    5. Incubare la miscela a 30 ° C per 16 h, seguita da 3 min a 65 ° C.
  2. Eseguire il PCR direttamente sul filtrato amplificato (diluire eventualmente i campioni amplificati) utilizzando appositi primer progettati per bacTeria per confermare le specie batteriche (vedere paragrafo 2.1).
  3. Eseguire la PCR per verificare se vi sia contaminazione del genoma ospite mediante l'uso di beta- Actin e EF1 primari di whitefly secondo il metodo 21 precedentemente pubblicato (la ricetta PCR è descritta nel paragrafo 1.4).

6. Endosymbiont Metagenome Sequencing

  1. Soddisfare il filtrato amplificato a uno spettrofotometro e un fluorometro (secondo le istruzioni del produttore) prima della sequenza per verificare la qualità dei campioni e se i campioni soddisfano i criteri di sequenziamento.
  2. Soggetti l'amplificato a un sequencer genomico secondo le istruzioni del produttore.

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Risultati

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Le specie del complesso B. tabaci del Medio Oriente Asia Minore 1 (MEAM1) sono state prese qui come esempio per la descrizione. Il cotone per l'allevamento di bianche e diverse fasi di sviluppo delle bianche sono riportate in figura 1, tra cui una pianta di cotone, la bianca adulta e le 1. , 2. e 4. ninfa installa di bianca (la nona di secondo istante sembra simile alla quarta nima ). Era ovvio che la nima del quarto...

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Discussione

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Poiché gli endosimbionti all'interno delle mosche bianche non possono essere coltivati in vitro, la dissezione e l'assemblaggio dei batteriociti è un modo efficace per ottenere abbastanza materiale genetico di endosimbionti. Prima della dissezione, le specie di mosca bianca e gli endosimbionti coinvolti devono essere esplicitamente confermati. La mosca bianca B. tabaci è un complesso di specie con più di 35 specie morfologicamente indistinguibili e diverse specie criptiche possono contenere diversi endo...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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Il sostegno finanziario a questo studio è stato fornito dal National Key Research and Development Programme (2016YFC1200601) e dalla National Science Foundation of China (31390421).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Taq DNA polimerasiTakaraR001Aincluso rTaq, 10&volte; Kit di estrazione del DNA tampone e gel dNTP
Qiagen28704
Sistema di sequenziamento del campione di DNAABIABI-3730XL
MicrotomoLeicaEM UC7
Microscopia elettronica a trasmissioneHitachiH-7650 TEM
StereomicroscopioZeissStemi 2000-C
20 μ L microloaderEppendorfF2771951
PortafiltroMilliporeSX0001300
Filtro a membranaMilliporeSMWP0013005.0 μ m SMWP
REPLI-g Kit UltraFast Mini Kitamlificazione del DNAQiagen150033
NanoDropThermo Scientific NanoDrop2000
Qubit FluorimetroThermo Fisher ScientificQ33216
Sequenziatore del genomaIlluminaHiseq 2000
di

Riferimenti

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