Method Article

Facile manipolazione delle architetture in idrogel a base di proteine per applicazioni della coltura delle cellule

DOI:

10.3791/55813

⸱

August 4th, 2017

 ,  , 
1Center for Peptide Pharmaceuticals, Faculty of Natural Science, Ulm University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diversi metodi per manipolare architettura tridimensionale in idrogel a base di proteine vengono valutate qui rispetto alla proprietà del materiale. Le reti di macroporosa sono funzionalizzate con un peptide di cella-adesivo, e loro fattibilità in coltura cellulare viene valutata utilizzando due linee cellulari di modello diverso.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Idrogeli sono riconosciuti come materiali promettenti per applicazioni della coltura delle cellule dovuto la loro capacità di fornire ambienti di cellule altamente idratata. Il campo dei modelli 3D è in aumento per la somiglianza potenziale di tali materiali alla matrice extracellulare naturale. Idrogel a base di proteine sono particolarmente promettenti, perché possono facilmente essere funzionalizzati e può raggiungere strutture definite con proprietà fisico-chimiche regolabile. Tuttavia, la produzione di modelli 3D di macroporoso per applicazioni della coltura delle cellule usando materiali naturali è spesso limitata dalla loro proprietà meccaniche più deboli rispetto a quelle dei materiali sintetici. Qui, sono stati valutati diversi metodi per produrre macroporosa albumina di siero bovino (BSA)-sistemi basati su idrogel, con dimensioni dei pori regolabile nel range di 10 a 70 µm nel raggio. Inoltre, è stato stabilito un metodo per generare canali in questo materiale di base di proteine che sono lungo diverse centinaio di micron. I diversi metodi per produrre i pori, come pure l'influenza della dimensione dei pori sulla proprietà del materiale come gonfiore rapporto, pH, stabilità di temperatura e comportamento di degradazione enzimatica, sono stati analizzati. Dimensioni dei pori sono stati studiati nello stato nativo, gonfio di idrogeli mediante microscopia a scansione laser confocale. La fattibilità per applicazioni della coltura delle cellule è stata valutata usando una cella-adesivo RGD peptide modifica del sistema della proteina e di due linee cellulari modello: cellule di cancro al seno umane (A549) e adenocarcinomic alveolare basale epiteliale cellule umane (MCF7).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Idrogeli sono materiali che formano reti 3D insolubile in grado di legare grandi quantità di acqua. Tali materiali in grado di fornire ottime condizioni ambientali per le cellule viventi. Attualmente, vi è crescente interesse nella generazione di strutture tridimensionali idrogel e nello sviluppo di processi per adattare i loro proprietà chimiche e fisiche. Una volta che questo è realizzato, un modello per la crescita delle cellule e la manipolazione del comportamento cellulare può essere generato1,2,3,4. Queste strutture 3D non solo creano un ambiente più naturale e realistico che approcci convenzionali bidimensionali, ma loro anche rivelare nuove possibilità per la crescita delle cellule staminali o tumore modelli5. Diversi materiali possiedono una gamma di caratteristiche che dipendono principalmente la dimensione dei pori del gel6. I pori giocano un ruolo cruciale nelle applicazioni della coltura delle cellule, l'ingegneria dei tessuti e la crescita delle cellule staminali diretta. Ad esempio, ossigeno e sostanze nutritive si diffondono attraverso la matrice, e gli importi adeguati devono essere in grado di raggiungere le cellule7. D'altra parte, metaboliti nocivi devono essere rimossi nel minor tempo possibile, e spazio sufficiente per la crescita delle cellule deve essere disponibile7. Di conseguenza, le proprietà del materiale e così la dimensione dei pori, gravemente influenzano le applicazioni potenziali benefici e possibili della matrice. Processi di crescita delle cellule differenti dipendendo le proprietà del materiale, possono verificarsi nella coltura cellulare 3D, compresa la formazione di strutture di un neurone; la crescita e la differenziazione delle cellule della pelle o dell'osso; e la crescita diretta delle linee speciali sulle cellule staminali, come gli epatociti o fibroblasti2,3,8,9,10,11. Un altro punto cruciale che influenzano l'eventuale applicazione di un materiale è la sua stabilità verso stimoli esterni12. Ad esempio, l'idrogel deve mantenere la sua integrità meccanica in terreni di coltura delle cellule o il corpo umano.

Negli ultimi anni, ricerca sul cellulare 3D cultura idrogeli intensificati, e molti studi sono stati effettuati per risolvere le architetture 3D dei sistemi13. Idrogeli composti di componenti chimicamente sintetizzati sono più comunemente studiati perché possono essere facilmente sintetizzati e modificati chimicamente ed esibiscono alta stabilità (Vedi Zhu et al., 2011 per una recensione)5. Tuttavia, le proteine hanno molte proprietà benefiche: come cosiddetto "polimeri di precisione", sono biocompatibili; hanno una lunghezza definita; sono relativamente facili da modificare; e hanno un gran numero di destinazione siti14,15. A questo proposito, le strutture altamente specifiche, innovative possono essere generate per applicazione in molti campi. In questo studio, un idrogel a base di proteine16 è stato utilizzato per dimostrare la capacità dei metodi consolidati per influenzare l'architettura 3D del materiale. Inoltre, la capacità di e l'applicabilità al poro generazione inoltre è stata studiata.

Diverse tecniche sono disponibili per modificare le strutture 3D, inclusi sia metodi semplici e sofisticate, altamente specializzate tecniche provenienti da diversi campi della scienza dei materiali. Una tecnica diffusa è l'uso di elettrofilatura per generare strutture ben definite17. Carica le fibre vengono estratti da una soluzione da un campo elettrico e quindi solidificano sopra l'esposizione all'ossigeno. In questo modo, possono essere prodotte fibre nella gamma di diversi nanometri fino a parecchi micron. Ulteriori tecniche per ottimizzare le dimensioni, la struttura e la distribuzione dei pori all'interno della matrice sono litografia soft, fotolitografia, focalizzazione idrodinamica, electro-spruzzatura e bio-stampa18,19,20. Un notevole svantaggio di queste tecniche è la loro dipendenza specifiche, costose apparecchiature e prodotti chimici speciali o materiali. Inoltre, l'esperienza con queste tecniche spesso non è direttamente trasferibile ai materiali a base di proteine, e molte delle sostanze chimiche e metodi non sono cellulare compatibile.

D'altra parte, molte tecniche non fare affidamento su attrezzature speciali, che li rende più facile e più conveniente di applicare e di riprodurre. Un metodo diffuso per la manipolazione di struttura è colata solvente21,22,23. Le particelle vengono aggiunti prima della reazione di polimerizzazione e sono distribuite in modo omogeneo per saturare la soluzione. Dopo la polimerizzazione, un cambiamento delle circostanze, ad esempio una diluizione o un cambiamento di pH, conduce alla solvatazione delle particelle, mentre i pori rimangono all'interno del materiale. I prodotti chimici usati in queste tecniche, come sale, zucchero, paraffina, gelatina e gesso, sono a buon mercato e facilmente reperibili. Nella liofilizzazione, idrogeli gonfiati sono congelati. La successiva sublimazione delle fasi liquidi sotto vuoto è quindi eseguito23,24,25. Sublimazione di acqua dalla rete è abbastanza delicato per mantenere le strutture 3D specifiche del materiale. Nel gas di schiumatura, una soluzione è in streaming con un gas mentre la polimerizzazione avviene, lasciando i pori all'interno del gel di21. La dimensione e la distribuzione dei pori può essere regolate a seconda del flusso di gas.

Per formare la proteina idrogel, BSA viene fatto reagire con cloruro di tetrachis (idrossimetil) fosfonio (THPC) in una reazione di Mannich-tipo per consentire la formazione di legami covalenti tra le ammine primarie e i gruppi idrossi della molecola del linker quattro braccia26. Eventuali intermedi reattivi nocivi vengono rimossi mediante lavaggio eccessivo del materiale dopo la reazione si verifica.

Questo studio dimostra la possibilità di trattare un materiale a base di BSA con diverse tecniche per manipolare e adattare la dimensione dei pori. Ciascuna delle tecniche può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio in tutto il mondo, come nessuna attrezzatura speciale è necessaria. Inoltre, diversi parametri, come rapporto di gonfiore, degradabilità enzimatica, stabilità del pH e la sensibilità di temperatura, esaminati e confrontati tra loro, soprattutto rispettano all'influenza delle diverse tecniche sulla generazione di architetture 3D. Infine, i materiali sono stati funzionalizzati con peptidi di cella-adesivo per indagare la possibile applicazione dei materiali in coltura cellulare. Due linee di cellule di diverso modello sono stati utilizzati: A549 e MCF7.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. idrogel preparazione

  1. Mescolare 200 mg di BSA con 1 mL di deionizzata di H2O di creare 20% (p/v) BSA stock (stock soluzione A).
  2. Mix 165 µ l di soluzione di THPC (134 mg/mL) con 4,835 mL di acqua deionizzata per creare THPC soluzione (soluzione B).
  3. Pesare 1 mg di KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) peptide (o un equivalente peptide di cella-adesivo) e diluirlo in 100 µ l di sterile di H2O per ottenere una soluzione di 10 mg/mL (soluzione C).
    Nota: Questo passaggio è facoltativo e deve solo essere incluso se l'idrogel è destinato per applicazione di cultura cellulare.
  4. Rimuovere il fondo di una piastra a 96 pozzetti e sostituirlo con involucro di plastica rimovibile.
    Nota: Per le piastre usate qui, il fondo può essere facilmente rimosso applicando pressione sul fondo di ciascun pozzetto; il fondo in plastica sottile cadrà semplicemente.
  5. Mix 100 µ l di soluzione madre di BSA (A) e 100 µ l di THPC stock soluzione (B) (opzionale: 4 µ l di soluzione madre C per idrogeli funzionalizzati, cella-adesivo) nella piastra 96 pozzetti per ottenere 200 µ l di idrogel. Miscelare i componenti pipettando su e giù, almeno 5 volte a garantire un uniforme idrogel dopo la polimerizzazione.
  6. Posizionare la piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente (TA) per circa 10 minuti fino a quando tutti gli idrogeli correttamente sono polimerizzati.
  7. Togliere lentamente ed attentamente l'involucro di plastica dalla parte inferiore della piastra.
  8. Premere nel caso degli idrogeli fuori la piastra a 96 pozzetti utilizzando un piccolo timbro e trasferirli in provette da 1,5 mL con PBS sterile, pH 7,4.
    Nota: Nel caso degli idrogeli hanno una forma cilindrica, con un diametro di circa 4 mm e un'altezza di 8 mm.
  9. Conservare nel caso degli idrogeli in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C per fino a parecchi mesi.

2. nel caso degli idrogeli di liofilizzazione

  1. Riempire le provette da 1,5 mL con 500 µ l di sterile deionizzata H2O e rimuovere il tappo. Trasferire nel caso degli idrogeli le provette di reazione da 1,5 mL con una spatola.
  2. Avvolgere le provette da 1,5 mL strettamente con paraffina pellicola-presso almeno tre strati per ogni flaconcino. Utilizzare un ago per forare piccoli fori nella pellicola per consentire il rilascio di gas dal tubo.
  3. Passare a una delle seguenti operazioni:
    1. Trasferire il flaconcino di soluzione di azoto liquido per 5 min garantire che l'acqua e idrogel congelare completamente. Immediatamente dopo la rimozione dell'azoto liquido, è possibile trasferire le fiale per il congelamento essiccatore per impedire al materiale di scongelamento.
      Nota: Questa procedura comporta nei pori circa 10-15 µm nel raggio.
    2. Conservare i flaconcini a-20 ° C durante la notte per congelare lentamente nel caso degli idrogeli. Immediatamente dopo la rimozione da-20 ° C, è possibile trasferire le fiale per il congelamento essiccatore per impedire al materiale di scongelamento.
      Nota: Questa procedura comporta nei pori circa 50-60 µm nel raggio.
  4. Dopo 24 h (e la completa evaporazione dell'acqua nei pressi dell'idrogel), scongelare il materiale rimuovendolo dal freeze dryer.
    Nota: Le dimensioni dei pori possono essere analizzate con laser confocale microscopia (passaggio 5, "Idrogel Visualization").

3. particelle lisciviazione

  1. Preparare l'idrogel come descritto ai punti 1.1-1.5.
  2. Subito dopo la miscelazione dei componenti, aggiungere NaCl fino a saturazione si verifica (36 mg/mL). Aggiungere il sale fino a quando un cristallo di sale può essere visto nella soluzione come un precipitato bianco.
  3. Trasferire la piastra a 96 pozzetti a uno shaker e agitare fino a quando la polimerizzazione avviene (circa 10 min). Rimuovere gli idrogeli dalla piastra, come descritto nei passaggi 1.7-1.8.
  4. Incubare l'idrogel per almeno 24 h a RT in acqua sterile su un agitatore (20 giri) per eluire tutto sale dal modello idrogel. Memorizzare nel caso degli idrogeli a 4 ° C in PBS per fino a parecchi mesi.

4. canale formazione

  1. Preparare gli idrogel come descritto nel passaggio 1. Rimuovere un idrogel da soluzione utilizzando una pinza, rimuovere l'acqua in eccesso con carta assorbente e posizionarlo sulla cima di un blocco di ghiaccio secco.
  2. Congelare l'idrogel per 30 s e rimuoverlo con cautela dal blocco. Non danneggiare l'idrogel; con attenzione è possibile utilizzare una spatola per togliere il blocco. Trasferire l'idrogel in una provetta da 1,5 mL e asciugare per una notte a 37 ° C.

5. idrogel Visualization

  1. Preparare una soluzione stock di Rodamina B diluendo 1 mg di Rodamina B in 10 mL di PBS. Preparare una diluizione seriale diluendo la soluzione di riserva di rodamina in PBS, fino a raggiunta una concentrazione di 0,001 mg/mL (fattore di diluizione: 100)
  2. Rimuovere l'idrogel dalla soluzione di archiviazione (ad esempio, dal passaggio 2.4.) e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL con 1 mL di soluzione di Rodamina B 0,01 mg/mL. Macchia l'idrogel pernottamento in soluzione di Rodamina B a TA.
  3. Il giorno successivo, trasferire l'idrogel che deve essere visualizzato a 10 mL di PBS (pH 7,4) e lavare per almeno 3 ore.
  4. Trasferire l'idrogel in una µ-diapositiva 8 bene e coprire con PBS.
  5. Tagliare piccole sezioni fuori l'idrogel (circa 0,5 mm di altezza) con una lama.
  6. Utilizzando un laser confocale a scansione microscopio, visualizzare l'idrogel ad una lunghezza d'onda di 514 nm (obiettivo: CE Plan-Neofluar 40 x / 1.30 olio DIC M27, modalità di scansione piano: 514 nm e zoom: 1 X).

6. cella cultura fattibilità

  1. Sterile-filtro tutti magazzino soluzioni (A, B e C) con un filtro da 0,45 µm.
  2. Preparare l'idrogel come descritto ai punti 1.1-1.4, inclusi il peptide di cella-adesivo prima della polimerizzazione di idrogel.
  3. Dopo la miscelazione dei componenti, pipettare immediatamente la miscela in una diapositiva-µ 8 bene fino a quando il fondo è completamente coperto.
    Nota: Questo passaggio deve essere eseguito rapidamente e direttamente dopo la miscelazione dei componenti, come la polimerizzazione avviene all'interno di minuti nella diapositiva.
  4. Cellule di adesione di cultura e passaggio per ottenere una sospensione di singola cellula utilizzando tecniche di coltura cellulare standard. Trasferire le cellule in pre-riscaldato, sterile medium di coltura cellulare DMEM completate con siero bovino fetale (FBS, 10% (p/v)), penicillina-streptomicina (1% (p/v)) e la soluzione di aminoacido non essenziale (MEM, 1% (p/v)).
  5. Contare le celle con un Neubauer contando camera e accuratamente pipetta 200 µ l del numero desiderato di cellule (2 x 105 cellule/cm2) sulla superficie di idrogel.
  6. Coprire la µ-diapositiva 8 bene con il coperchio e trasferirlo in un incubatore (37 ° C, 5% CO2). Incubare per almeno 4 ore a 37 ° C.
  7. Dopo almeno 4 h di attaccamento cellulare, lavare le cellule due volte con 200 µ l della coltura delle cellule sterile PBS.
  8. Fissare le cellule con 200 µ l di formaldeide di 3,7% (v/v) per 10 min a RT e lavare due volte con PBS (~ 200 µ l).
    Nota: Indossare adeguati dispositivi di protezione personali maneggiare formaldeide.
  9. Permeabilize le cellule con 200 µ l di 0.1% Triton X per 5 min, lavare due volte con PBS.
  10. Macchia le celle con falloidina-rodamina mescolando 5 µ l di soluzione metanolica stock con 195 µ l di PBS e aggiungendo alle celle RT. macchia le celle per 20 min al buio. Lavare due volte con PBS.
  11. Studiare le proprietà di adesione delle cellule usando un microscopio confocale a 514 nm (obiettivo: CE Plan-Neofluar 40 x / 1.30 olio DIC M27, modalità di scansione piano: 514 nm e zoom: 1 X). Analizzare le immagini usando il software adatto (Vedi la Tabella materiali).

7. idrogel proprietà

  1. Rapporto di gonfiore.
    1. Asciugare completamente l'idrogel a 37 ° C per almeno un giorno.
    2. Pesare ogni idrogel e annotare il peso esatto.
    3. Riempire una provetta di reazione di 2 mL con 1,5 mL di PBS.
    4. Trasferire l'idrogel in questo tubo di reazione di 2 mL e immergere completamente in PBS.
    5. Lasciare l'idrogel per almeno due giorni in PBS a RT per raggiungere un equilibrio con il PBS.
    6. Dopo tre giorni, è necessario rimuovere l'idrogel dalla soluzione e asciugarlo con un fazzoletto di carta per rimuovere l'acqua in eccesso dalla superficie idrogel.
    7. Pesare l'idrogel.
    8. Calcolare il rapporto gonfiore utilizzando la seguente formula:
      figure-protocol-1
      dove Wd è il peso del gel essiccato (passo 7.1.2.) e Ws è il peso del gel bagnato (punto 7.1.7). Moltiplica con 100 per ottenere la percentuale di rapporto gonfiore.
  2. stabilità di temperatura e di pH.
    1. Trasferire 5 mL di PBS in una provetta di reazione di 15 mL.
    2. Regolare la soluzione a pH appropriato (ad es., pH 2, 7 o 10) con NaOH e HCl. Bring la soluzione alla temperatura appropriata (ad es., RT, 37 ° C o 80 ° C).
    3. Trasferire l'idrogel che deve essere studiato per la sua stabilità nella soluzione appropriata. Se necessario, regolare il pH.
      Nota: Tutti gli idrogeli dovrebbero essere completamente gonfio a questo punto (Vedi il rapporto di gonfiore) per impedire l'errata interpretazione del peso dovuto il gonfiamento del materiale.
    4. Dopo determinati intervalli di tempo, rimuovere l'idrogel dalla soluzione (ad esempio, ogni ora fino a 2 giorni), asciugarlo con un panno di carta altamente assorbente per rimuovere l'acqua in eccesso e pesarlo.
  3. Degradazione enzimatica.
    1. Preparare una soluzione di enzima stock di 300 U tripsina e pepsina, secondo le istruzioni del produttore.
    2. Trasferire l'idrogel (ad es., dal punto 1.8) la soluzione appropriata.
      Nota: Tutti gli idrogeli dovrebbero essere completamente gonfio a questo punto per evitare l'errata interpretazione del peso.
    3. Dopo determinati intervalli di tempo, rimuovere l'idrogel dalla soluzione (ad esempio, ogni ora), asciugarlo con un panno di carta altamente assorbente per rimuovere l'acqua in eccesso e pesarlo.

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Results

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Lo sviluppo dell'idrogel è diventato uno dei campi più importanti negli studi biologici relativi alla ricerca sui materiali, con migliaia di voci indicizzate negli archivi della ricerca scientifica. Sebbene il comportamento di molti sistemi sia ben studiato, la manipolazione di reti 3D, in particolare di materiali sensibili a base di proteine, è spesso un problema importante nella scienza dei materiali. Un'altra sfida comunemente sottovalutata è la corretta misurazione della struttura nat...

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Discussion

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La produzione di matrici macroporose può essere vantaggiosa per molti campi diversi. Ha un elevato potenziale tecnico ed economico grazie alla struttura definita dell'idrogel e alla capacità di controllare e mettere a punto le proprietà specifiche del materiale. Tuttavia, l'introduzione di elementi strutturali supramolecolari, come pori o canali, in un modello 3D potrebbe influenzare le proprietà complessive di un materiale, come il rapporto di rigonfiamento o la rigidità. Ciò può comportare la decomposizione, il degrado...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori vorrei ringraziare Stiftung di Baden-Württemberg per il loro sostegno finanziario nel quadro "Sintesi di materiali bioinalati" (biostuoie-14).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Dulbecco' s Eagle modificato' s medio (alto glucosio)Life Technologies / Thermo Fisher 11140-050
Siero fetale bovino (FBS)Life Technologies / Thermo Fisher 10270-106
Penicillina-streptomicinaLife Technologies / Thermo FisherSoluzione di
aminoacidi non essenziali MEMSigma AldrichM7145-100ML
Tripsina EDTA 0,05% Fenolo RossoThermo Fisher Scientific25300062
Etanolo 99,8%, vergä lltÖ lfabrik Schmidt2133
NaCl Carl Roth9265.1
Frazione di albumina VCarl Roth3854.2
THPCSigma Aldrich404861-100MLTossico
0,1% Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
Falloidina-rodaminaTecnologie per la vita / Thermo FisherR415
3,7% FormaldeideTecnologie per la vita / Thermo FisherF8775-25ML
Tossico Rodamina BSigma Aldrich81-88-9
Filtropur S 0.2 Sarsted Ag und Co.2 83.1826.001     
µ scivolo 8 pozzettiIbidi GmbH80826
KCSSGKSRGDS peptideUPEP UlmSintesi
Etanolo 99,8%, vergä lltCarl Roth K928.5
Falcon 5 ml Tubo a fondo tondo in polisterene Sarsted Ag und Co.62.547.254     
Tubi da 50 mlSarsted Ag und Co.62.547.254     
Tubi da 1,5 ml   Sarsted Ag und Co.72.690.001
Provette da 2 ml  Sarsted Ag und Co.72.691
MICROPIASTRE PER COLTURE CELLULARI, 96 POZZETTI, PS, F-BOTTOMGreiner655073
Liofilizzatore Epsilon 1-6D, Christ, Osterode am Harz, Germania
Microscopio confocale a scansione laser Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germania
Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germania
GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7GSA GmbH
15140122 leggermente tossica.personalizzata

References

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