Questo documento descrive due nuovi plugin ImageJ per l'analisi delle immagini "Clock Scan". Questi plugin espandono la funzionalità del programma originale visual basic 6 e, soprattutto, rendono disponibile il programma a una grande comunità di ricerca associandola con il pacchetto software ImageJ per l'analisi delle immagini.
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Articolo metodologico
Protocollo di controllo dell'orologio per l'analisi delle immagini: plugin ImageJ
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il protocollo di scansione dell'orologio per l'analisi delle immagini è uno strumento efficace per quantificare l'intensità media del pixel all'interno, al confine e all'esterno (uno sfondo) di una regione di interesse convessa o segmentata, che porta alla generazione di un valore radiale pixel- Profilo di intensità. Questo protocollo è stato originariamente sviluppato nel 2006, come uno script di visual basic 6, ma come tale, aveva una distribuzione limitata. Per risolvere questo problema e per partecipare ad altri simili sforzi recenti da altri, abbiamo convertito il codice originale del protocollo di scansione dell'orologio in due plug-in Java compatibili con programmi di analisi di immagini sponsorizzati da NIH e liberamente disponibili come ImageJ o Fiji ImageJ. Inoltre, questi plugin dispongono di diverse funzioni, ampliando ulteriormente l'intervallo di funzionalità del protocollo originale, ad esempio l'analisi di più aree di interesse e gli stack di immagini. Quest'ultima caratteristica del programma è particolarmente utile in applicazioni in cui è importante determinare i cambiamenti correlatiAl tempo e alla posizione. Pertanto, l'analisi della scansione orologio di pile di immagini biologiche può essere applicata potenzialmente alla diffusione di Na + o Ca ++ all'interno di una singola cella, nonché all'analisi dell'attività di diffusione ( ad esempio , onde Ca ++ ) in popolazioni sinapticamente -connected o gap junction-coupled cellule. Qui descriviamo questi nuovi plugin di scansione orologi e mostriamo alcuni esempi delle loro applicazioni nell'analisi delle immagini.
Introduzione
L'obiettivo di questo lavoro è quello di presentare un protocollo di Clock Scan senza piattaforma e liberamente a disposizione di qualsiasi ricercatore interessato a questo tipo di analisi delle immagini. Il protocollo di clock scan è stato originariamente sviluppato nel 2006 1 , con l'obiettivo di migliorare i metodi esistenti di quantificazione dell'intensità di pixel all'interno di regioni di interesse convex (ROI), un metodo che ha una migliore capacità integrativa e una migliore risoluzione spaziale. Durante l'acquisizione, il protocollo raccoglie in sequenza più profili di intensità pixel radiali, scansionati dal centro ROI al suo bordo oa una distanza predeterminata al di fuori del ROI allo scopo di misurare l'intensità del pixel di "background". Il protocollo scala questi profili in base al raggio della cella, misurato nella direzione della scansione. Così, la distanza dal centro al bordo ROI di ogni singola scansione radiale è sempre al 100% della scala X. Infine, il programma mette in media questi individuiProfili in un profilo integrale di intensità pixel radiale. A causa della scalatura, il profilo medio di intensità pixel, prodotto dal protocollo "Clock Scan", non dipende né dalla dimensione ROI né, entro limiti ragionevoli, sulla forma ROI. Questo metodo consente un confronto diretto o, se necessario, la mediazione o la sottrazione di profili di differenti ROI. Il protocollo consente anche la correzione dei profili di intensità pixel integrali, di qualsiasi oggetto per il rumore di fondo, mediante una semplice sottrazione dell'intensità media di pixel situati al di fuori dell'oggetto. Anche se è stato testato solo in campioni biologici, il nostro protocollo fornisce una valida aggiunta ad altri strumenti di analisi delle immagini esistenti utilizzati per studi di immagini di processi fisici o chimici disposti attorno ad un punto di origine (come la diffusione di sostanze da una sorgente di punti ) 1 .
Tuttavia, la principale limitazione del metodo di analisi dell'immagine originale era che il protocollo era devElicottero come Visual Basic 6 (VB6) (codice e quindi era piattaforma dipendente e difficile da distribuire (che richiede VB6). Per risolvere questo problema e ad aderire a simili tentativi recenti da altri investigatori 2 , abbiamo convertito la VB6 Clock Scan Codice di programma in due plug-in Java compatibili con i programmi di analisi delle immagini open source e piattaforme indipendenti, sponsorizzati da NIH, ImageJ 3 e Fiji ImageJ 4. Inoltre, questi plugin hanno ora diverse nuove funzioni che espandono la funzionalità Del protocollo originale per elaborare più ROI e stack di immagini Molte applicazioni di analisi delle immagini non sono user-friendly, per quanto riguarda l'analisi statistica di più oggetti e quindi spesso vengono rappresentati solo i dati rappresentativi.Con il plugin Multi Clock Scan ImageJ, È possibile facilitare l'analisi di più oggetti contemporaneamente Una robusta valutazione statistica dei dati di microscopia,Per quanto riguarda la distribuzione di intensità del segnale in singole celle / oggetti, è ora possibile con questa estensione del plugin. Qui descriviamo i plugin di Scansione Clock e mostriamo esempi delle loro applicazioni nell'analisi delle immagini.
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Protocollo
1. Installazione del software
- Installare le versioni più recenti di Java in dotazione e ImageJ o Fiji ImageJ come raccomandato nei rispettivi siti web (consultare la tabella dei materiali per i collegamenti ai siti web corrispondenti). Nel testo sottostante, entrambi i programmi sono denominati "ImageJ".
- Copiare i file di plugin "Clock_Scan-1.0.1 jar" e "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" utilizzando il collegamento fornito nella tabella dei materiali e incollarli nella directory plugin ImageJ. In alternativa, utilizzare l'opzione di menu "Plugins | Install plugin" per installare questi file dopo essere stati salvati sul disco rigido del computer.
2. Analisi dell'orologio
- Plugin di scansione standard dell'orologio ( Figura 1 ):
- Utilizza il comando di menu ImageJ "File | Apri" per aprire un'immagine di interesse.
- Fai clic sullo strumento 'poligono' o 'selezione lineare segmentata'Quindi attingere all'immagine per definire l'intero ROI o un segmento di questa regione. Vedere la Figura 1 A per un esempio di selezione poligonale (profilo interno tratteggiato).
NOTA: possono essere utilizzati anche altri strumenti di selezione disponibili nel software (selezione rettangolare, ovale e lineare). - Selezionare "Plugins | Clock Scan" dal menu per aprire la finestra opzione pop-up del protocollo di scansione orologio standard. Tieni presente che questo comando apre anche la finestra del ROI Manager con il contorno aggiunto automaticamente.
- Utilizza la finestra dell'opzione plugin per effettuare quanto segue.
- Rivedere e modificare le coordinate X e Y del centro ROI (calcolate automaticamente come coordinate del centro di massa fisico) utilizzando le barre di scorrimento o modificando i valori nelle corrispondenti caselle di immissione. Vedi Figura 1 B.
- A seconda di quale parte della regione di sfondo al di fuori dell'oggettoPer essere coperti dalla scansione, regolare i limiti di scansione utilizzando la barra di scorrimento "scansione limite". Vedi Figura 1 A.
NOTA: Il limite di scansione è il numero frazionario che rappresenta la distanza in cui la scansione deve andare oltre il bordo degli oggetti in una data direzione; Il valore predefinito è 1,20, indicando che la lunghezza della scansione sarà 20% più lunga del raggio dell'oggetto nella direzione della scansione; Vedi figura 1 A , linea tratteggiata esterna). - Modificare l'output del plugin utilizzando "check", "sottoscrizioni di sfondo", "trasformazione polare" e / o "traccia con deviazione standard".
- Fai clic su "OK" per eseguire il plugin. Vedere la Figura 1 C-H .
NOTA: Esempi di output del protocollo con "trama con deviazione standard" e "trasformazione polare" o "raggio reale" e "transf polareOrm "sono illustrate in Figura 1 C e 1D e rispettivamente in Figura 1 E e 1. Si noti che i valori di deviazione standard calcolati (SD) rappresentano la variazione tra le singole scansioni di intensità del pixel radiale dell'oggetto. Lunghezza "nella finestra plugin, che visualizza le informazioni sulla lunghezza del contorno ROI misurato in pixel.
- Nel generato "Plot di profilo di scansione orologio", utilizzare il comando "Elenco" per tracciare i valori visualizzati in due colonne X e Y di dati per immagini a scala di grigio e in X e quattro colonne di dati Y per immagini RGB, di cui Y0, Le colonne Y1, Y2 e Y3 verranno riempite con valori integrali e individuali (rosso, verde e blu) i valori di intensità del pixel dei canali di colore.
- Più plugin per la verifica dell'orologio ROI - che utilizza più ROI ( Figura 2 ):
- Apri un'immagine contenente più ROI.
- Aprire il Gestore ROI facendo clic su "Analizza | Strumenti | Gestione ROI".
- Schema sequenziale (vedere passo 2.1.2) e aggiungere ogni ROI al Gestore ROI facendo clic su "Aggiungi" nella finestra Gestione ROI; Fai questo per tutti i ROI all'interno dell'immagine. Utilizza il comando "Analizza | Misura" se le metriche ROI sono di interesse.
- Vedere la Figura 2 A per un esempio di selezioni di più segmenti segmentati e la Figura 2 E per un esempio di selezioni multiple di poligoni.
- Selezionare "Multi Clock Scan" nel menu "Plugins" per aprire la finestra popup di opzioni del protocollo.
- Utilizzare la finestra delle opzioni del protocollo per eseguire le seguenti operazioni.
- Se necessario, reimpostare il limite di scansione come descritto nel punto 2.1.4.2; Il valore predefinito è 1,20.
- Se necessario, selezionare l'opzioneIone per tracciare il profilo di scansione dell'orologio medio con le barre SD controllando la casella "Trama con deviazione standard". Vedere la Figura 2 C e D.
NOTA: I valori SD calcolati rappresentano la variazione tra i profili di scansione orologio integrati di diversi oggetti. Inoltre, nota la riga nella finestra plugin che mostra informazioni sul "numero di ROI selezionati". - Fare clic su "OK" per eseguire il protocollo.
- Nel generato "Plot di profilo di scansione orologio", utilizzare il comando "Elenco" per tracciare i valori visualizzati nella finestra "Plot Values". Vedere la legenda della finestra "Multiple Clock Scan Profile Plot" per la designazione di colonne per canale a colori.
- Si noti che i ROI sono numerati ei loro profili di scansione orologi per un determinato canale di colore sono tracciati nella stessa sequenza in cui i ROI sono stati definiti e aggiunti al "Gestore ROI".
- MulPlugin di scansione dell'orologio ROI di punta - lavorare con una pila di immagini ( Figura 3 ):
- Apri una pila di immagini di interesse.
- Aprire il Gestore ROI facendo clic su "Analizza | Strumenti | Gestione ROI".
- Descrivere il ROI delle immagini all'interno della pila e aggiungerlo al gestore ROI come descritto nei passaggi 2.1.2 e 2.2.3. Utilizza il comando "Analizza | Misura" se le metriche ROI sono di interesse.
- Selezionare "Multi Clock Scan" nel menu "Plugins" per aprire la finestra popup di opzioni del protocollo.
- Utilizzare la finestra delle opzioni del protocollo per eseguire le seguenti operazioni.
- Ripristinare il limite di scansione come descritto nel punto 2.1.4.2; Il valore predefinito è 1,20.
- Selezionare l'opzione per tracciare il profilo di scansione dell'orologio medio con le barre SD controllando la casella "Plot with deviance standard".
NOTA: I valori SD calcolati rappresentano la variazione tra le diverse istanze dell'oggetto selezionato nello stadio immagineck. Inoltre, nota la riga nella finestra plugin che mostra informazioni sul "numero di immagini in pila". - Fare clic su "OK" per eseguire il protocollo.
- Nella finestra "Profilo diagramma di scansione orologio", fare clic su "Elenco" per tracciare i valori visualizzati nella finestra "Valori del diagramma", dove il numero della colonna Y rappresenta la posizione dell'immagine all'interno dello stack - 1.
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Risultati
Le immagini qui utilizzate per scopi illustrativi vengono prelevati da database creati durante i nostri studi biologici precedenti di cellule e tessuti 5 , 6 , 7 e dall'allenatore del cervello Allen Mouse 8 . Entrambi i plugin sono stati testati con successo con l'ambiente di programma di ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 e F...
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Discussione
Protocollo di scansione orologio: il protocollo di scansione dell'orologio è uno strumento veloce e semplice dell'analisi delle immagini. I vantaggi di questo protocollo, rispetto agli attuali approcci comuni di analisi delle immagini (come le scansioni di intensità pixel pixel o il calcolo dell'intensità pixel del ROI), sono stati descritti in dettaglio nelle pubblicazioni precedenti 1 , 9 . In breve, questo protocollo consente di g...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo il dottor Tanja Maritzen e il dottor Fabian Feutlinske (Istituto Leibniz di Farmacologia Molecolare, Berlino, Germania) per condividere con noi la loro versione del plugin Fuji ImageJ Clock Scan e ci stimolano a sviluppare questa versione del programma. Siamo anche grati al Dr. Fritz Melchers (Dipartimento per lo sviluppo di linfociti, Max Planck Institute per la biologia delle infezioni) per il suo gentile permesso di utilizzare le immagini dal database del suo dipartimento al fine di testare e migliorare il plugin. Supporto: Centro per le neuroscienze transazionali; Concessione NIH: P30-GM110702-03.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Computer | Qualsiasi | compatibile con i software elencati di seguito | |
| ImageJ o Fiji | ImageJ NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ o https://fiji.sc/ | in bundle con Java 1.8 o versioni successive |
| Plugin di scansione dell'orologio | freeware | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar e Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar |
| Origin 9.0 | OriginLab | Northampton, MA, USA | Questo programma è stato utilizzato per generare alcuni grafici dei dati originali di Clock Scan. Qualsiasi altro software di grafica può essere utilizzato per eseguire questa funzione |
Riferimenti
- Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
- Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535(2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
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- Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1(2015).
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