Agenti patogeni di origine alimentare Screening utilizzando Magneto-fluorescente nanosensore: Rilevazione rapida di e. Coli O157: H7

Summary

L'obiettivo generale del presente protocollo è di sintetizzare funzionale Nanosensori per il portatile, conveniente, e rilevamento rapido di specificamente mirati batteri patogeni attraverso una combinazione di rilassamento magnetico e le modalità di emissione di fluorescenza.

Abstract

Enteroemorragica Escherichia coli O157: H7 è stato collegato ad entrambi a base acquosa e malattie di origine alimentare e resta una minaccia nonostante i metodi di screening di cibo e di acqua utilizzata attualmente. Mentre i metodi convenzionali di rilevazione batterica, come reazione a catena della polimerasi (PCR) e analisi enzima-collegate dell'immunosorbente (ELISA) in grado di rilevare specificamente patogeni contaminanti, richiedono preparazione dei campioni ampi e lunghi periodi di attesa. Inoltre, queste pratiche richiedono impostazioni e strumenti di laboratorio sofisticati e devono essere eseguite da professionisti qualificati. Nel presente accordo, un protocollo è proposto per una più semplice tecnica diagnostica che caratterizza la combinazione unica di parametri magnetici e fluorescente in una piattaforma basata su nanoparticelle. La proposta multiparametrica magneto-fluorescente nanosensori (MFnS) in grado di rilevare e. coli O157: H7 contaminazione con appena 1 unità formanti colonie presenti in soluzione entro meno di 1 h. Inoltre, la capacità di MFnS di rimanere altamente funzionale in supporti complessi come latte ed acqua del lago è stata verificata. Ulteriori specificità analisi inoltre sono state usate per dimostrare la capacità di MFnS di rilevare solo i batteri specifici, anche in presenza di specie batteriche simili. L'abbinamento delle modalità magnetica e fluorescente permette per la rilevazione e la quantificazione di contaminazione da agenti patogeni in una vasta gamma di concentrazioni, esibendo le sue alte prestazioni nella rilevazione di contaminazione sia precoce e tardiva-stadio. L'efficacia, convenienza e portabilità della MFnS li rendono un candidato ideale per lo screening di point-of-care per contaminanti batterici in una vasta gamma di impostazioni, dai bacini acquatici per gli alimenti in commercio confezionati.

Introduction

La presenza persistente di contaminazione batterica in entrambi il cibo prodotto commercialmente e fonti d'acqua ha creato la necessità di piattaforme diagnostiche sempre più rapide e specifiche. ^{1 , 2} alcuni dei più comuni contaminanti batterici responsabili della contaminazione di cibo e acqua sono dei generi Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus ed Escherichia. ^{3 , 4} contaminazione batterica di questi agenti patogeni spesso provoca sintomi quali febbre, colera, gastroenterite e diarrea. ⁴ contaminazione delle fonti d'acqua spesso ha effetti drastici e negativi sulle comunità senza accesso all'acqua sufficientemente filtrata e contaminazione degli alimenti ha portato ad un gran numero di malattie e sforzi di richiamo del prodotto. ^{5 , 6}

Al fine di ridurre l'occorrenza di malattie causate dalla contaminazione batterica, ci sono stati una serie di sforzi per sviluppare metodi che acqua e cibo possono essere efficientemente acquisiti prima della vendita o consumo. ³ tecniche come la PCR,^1,7,8,9,10 ELISA,^11,12 (amplificazione isotermica mediata da loop LAMPADA),^13,14 , tra gli altri,^{15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24} recentemente sono state usate per il rilevamento di vari agenti patogeni. Rispetto al tradizionale batteriche metodi di coltura, queste tecniche sono molto più efficiente per quanto riguarda la specificità e l'ora. Tuttavia, queste tecniche ancora lottano con falsi positivi e negativi, procedure complesse e costo. ^{1 , 3 , 25} è per questo motivo che multiparametriche magneto-fluorescente nanosensori (MFnS) sono proposti come metodo alternativo per rilevazione batterica.

Questi nanosensori unicamente insieme coppia rilassamento magnetico e modalità fluorescente, permettendo per una piattaforma dual-rilevazione che sia rapida e accurata. Utilizzando e. coli O157: H7 come contaminante campione, la capacità di MFnS per rilevare appena 1 CFU in minuti è dimostrata. Patogeno-specifiche anticorpi sono usati per aumentare la specificità e la combinazione delle modalità sia magnetiche che fluorescente permette per la rilevazione e quantificazione di contaminanti batterici in entrambi gli intervalli di bassa e alta contaminazione. ¹⁶ nel caso di contaminazione batterica, i nanosensori saranno sciame intorno i batteri a causa della capacità di targeting degli anticorpi patogeni specifici. L'associazione tra i nanosensori magnetico e batteri limita l'interazione tra il nucleo di ferro magnetico e i protoni dell'acqua circostante. Questo provoca un aumento i tempi di rilassamento T2, come registrato da una relaxometer magnetica. Come la concentrazione di batteri in soluzione aumenta, i nanosensori disperdono con l'aumento del numero di batteri, con conseguente più bassi valori di T2. Al contrario, l'emissione di fluorescenza aumenterà in proporzione con la concentrazione dei batteri, dovuto il numero aumentato di nanosensori direttamente legati al patogeno. Centrifugazione dei campioni e l'isolamento del pellet batterico, conserverà solo le nanoparticelle direttamente collegate ai batteri, rimuovendo qualsiasi nanosensori digalleggiante e direttamente correlare l'emissione di fluorescenza con il numero di batteri presenti nella soluzione. Una rappresentazione schematica di questo meccanismo è rappresentata nella Figura 1.

Questa piattaforma di MFnS è stata progettata con lo screening di point-of-care nella mente, con conseguente caratteristiche portatile e a basso costo. MFnS sono stabili a temperatura ambiente e sono necessarie solo in concentrazioni molto basse per accuratezza nel rilevamento di contaminanti batterici. Inoltre, dopo la sintesi, uso del MFnS è semplice e non richiede l'utilizzo di professionisti qualificati nel settore. Infine, questa piattaforma diagnostica permette per il targeting altamente personalizzabile, fornendo un mezzo da cui questa una piattaforma può essere utilizzata per rilevare gli agenti patogeni di tutti i tipi, in molti contesti diversi.

Protocol

1. sintesi e funzionalizzazione di multi-parametrico Magneto-fluorescente nanosensori (MFnS).

1. Sintesi di ossido di ferro superparamagnetico nanoparticelle (IONPs)
   1. per preparare per la sintesi IONP, preparare le seguenti 3 soluzioni: soluzione 1: FeCl ₃ (0,70 g) e FeCl ₂ H ₂ O (2 mL), soluzione 2: NH ₄ OH (2,0 mL, 13,4 M) in H ₂ O (15 mL) e soluzione 3: acido poliacrilico (0,855 g) H ₂ O (5ml).
   2. µ L 90 di 2 M di acido cloridrico (HCl) alla soluzione 1 e quindi miscelare immediatamente con soluzione 2 mentre nel Vortex a 875 giri/min. Quindi aggiungere la soluzione 3. Continuare su vortex per 60 min.
   3. Centrifugare per 20 min a 1.620 x g. Centrifugare il surnatante per 20 min a 2.880 x g.
   4. Purificare il surnatante finale tramite dialisi. Aggiungere il surnatante di un sacchetto di dialisi (MWCO 6 − 8 K) e posizionarlo in un becher contenente tamponato fosfato salino (PBS) (pH = 7.4) e spin bar. Lasciare in ammollo per 12 h, sostituendo con tampone fresco ogni 2-3 h.
2. Coniugazione degli anticorpi specifici per la destinazione alla superficie del IONPs
   1. preparare le seguenti quattro soluzioni: soluzione a: 5 mg di 1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimide cloridrato (EDC) in 250 µ l MES [2-(N- buffer di morpholino) ethanesulfonic acido] (0,1 M, pH = 6,8), soluzione b: 3 mg di N-Idrossisuccinimide (NHS) a 250 µ l di tampone MES (0,1 M, pH = 6,8), soluzione c: 5 µ g di IgG1, il mAb di e. coli, in 225 µ l di tampone fosfato salino (PBS) (pH 7.4) e soluzione d: 4 mL di IONP (5,0 mmol) in 1 mL di PBS (pH 7,4).
   2. Aggiungere 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (MES) del buffer alla soluzione A, quindi immediatamente aggiungere soluzione alla soluzione D in piccoli incrementi entro 15 s, invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta per la miscelazione.
   3. Immediatamente iniziare ad aggiungere soluzione B alla soluzione D in piccoli incrementi per un periodo di tre minuti. Mix invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta.
   4. Aggiungere soluzione C soluzione con incrementi di 5 µ l, invertendo la soluzione dopo ogni aggiunta per la miscelazione.
   5. Consentire reazione continuare per 3 ore a temperatura ambiente e poi continuare l'incubazione a 4 ° C durante la notte.
   6. Purificare il IONPs Ab-coniugato risultante tramite colonna magnetica utilizzando PBS (pH = 7,4, finale [Fe] = 3,5 mmol) per rimuovere eventuali anticorpi non coniugate.
      1. Lavare la colonna magnetica con PBS (1 mL). Fissare la colonna alla piastra magnetica ed aggiungere la soluzione IONP.
      2. Lavare nuovamente la colonna magnetica con PBS (1 mL). Rimuovere la colonna magnetica dalla piastra magnetica. Aggiungere la colonna di PBS e raccogliere la soluzione. Conservare a 4 ° C
3. incapsulamento di 1,1 fluorescente ' - Diottadecilbis - 3,3,3 ', 3 '-colorante Tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI) nel rivestimento (PAA) l'acido poliacrilico dell'anticorpo coniugato IONPs utilizzando un Metodo di diffusione di solvente.
   1. A 4 mL della IONPs, aggiungere goccia a goccia 2.0 µ l di colorante DiI (2 mmol) in 100 µ l di DMSO con miscelazione continua a 1100 giri/min.
   2. Dializzare la soluzione risultante (MWCO 6-8 KDa, 12h) contro PBS, creando una soluzione di MFnS finale con una concentrazione di ferro finale di [Fe] = 2 mmol.
4. Caratterizzazione di MFnS
   1. per l'analisi spettrofotometrica, utilizzare un lettore di piastre per rilevare incapsulato DiI tintura con l'emissione di fluorescenza a 595 nM.
   2. Dynamic Light Scattering
      1. inserire un esempio della soluzione MFnS in un zetasizer per determinare la dimensione media e la carica superficiale della MFnS.
         Nota: Qui, la dimensione media e la carica superficiale di MFnS funzionale sono stati trovati per essere 77.09 nm e -22,3 mV, rispettivamente.

2. Batterica Culturing e preparazione di soluzione Stock

1. coltura batterica
   1. idratare un pellet liofilizzato (e. coli O157: H7) in 1 mL di brodo nutritivo e quindi aggiungere un ulteriore 5 mL di brodo.
   2. Applicare 100 µ l di questa soluzione a una piastra di agar e striscia utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, seguito da incubazione a 37 ° C per 24 h.
   3. Dopo 24 h, selezionare una colonia isolata dalla piastra di agar e aggiungerlo a un 15 mL di brodo di coltura. Incubare a 37 ° C per 4-6 h, mentre si controlla il valore di densità ottica (assorbanza a 600 nm).
   4. Una volta ottenuto un valore di densità ottica di 0,1, interrompere la coltura ed eseguire diluizioni seriali.
2. Diluizioni seriali
   1. aggiungere 900 µ l di brodo nutritivo per otto microcentrifuga sterile.
   2. Aggiungere 100 µ l della sospensione batterica al primo tubo (diluizione 10 ^-1).
   3. Prendere 100 µ l dalla prima provetta e aggiungerlo al secondo, per ottenere una diluizione di 10 ^-2. Proseguire in questo modo per i rimanenti tubi, terminando con una diluizione finale di 10 ^-8.
   4. Trasferire 100 µ l da ciascuna provetta per separare le piastre di agar e incubare per 24 h a 37 ° C.
   5. Il giorno successivo, contare la Colonia formando unità (CFUs) su ogni piatto. Selezionare il piatto con CFUs ~ 100. Utilizzare le diluizioni corrispondente per ulteriori esperimenti (100 µ l = ~ 100 CFUs).
      Nota: Qui era la diluizione di 10 ^-6 che ha provocato CFUs ~ 100.

3. Rapido rilevamento di E. coli O157: H7 utilizzando MFnS

1. Spike varie soluzioni di PBS (1 X, pH 7.4, 300 µ l) con quantità crescenti di stock batterici 10 ^-6, conseguente CFU varia da 1-100. Aggiungere una quantità costante di MFnS (100 µ l) di queste soluzioni.
2. Creare una soluzione di base che contiene solo PBS (1 X, pH 7.4, 300 µ l) e MFnS (100 µ l).
3. Incubare soluzioni a 37 ° C per 30 minuti e poi lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.
4. Trasferimento soluzioni individuali per la relaxometer magnetica (0,47 Tesla) e registrare le modifiche in tempi di rilassamento (T2) riguardante il CFUs in ogni soluzione.
   1. Per registrare le modifiche nei valori di T2, iniziare misurando il valore di T2 della soluzione di base che contiene solo PBS e MFnS. Relaxometer
      1. posto la soluzione in magnetico. Aprire il rispettivo software, selezionare il " rilassamento T2 " impostazione e premere " misura. "
   2. dopo la raccolta della linea di base T2, misurare i valori di T2 delle soluzioni aggiuntive che sono stati diluiti con vari concentrazioni di batteri.
      Nota: Il cambiamento in T2 è equivalente al basale T2 sottratto dal T2 spiked.
5. Rimuovere i campioni dalla relaxometer magnetica e centrifugare le provette a 2880 x g per 10 min.
6. Decantare il supernatante e risospendere il pellet batterico in 100 µ l di PBS (1 X, pH 7.4).
7. Aggiungere 80 µ l di ogni risospensione di una piastra a 96 pozzetti e intensità di fluorescenza record a 595 nM.
   Nota: Test può essere ripetuto utilizzando solventi vari, tra cui Lago di acqua, latte e altri come descritto nella sezione risultati

Results

Nella Figura 1è rappresentato il meccanismo di azione di MFnS. Il clustering di MFnS intorno alla superficie di contaminanti batterici interferisce con le interazioni tra i nuclei del MFnS e i nuclei di idrogeno circostante. A seguito di questo rilassamento clustering, magnetico i valori aumentano. Man mano che aumenta la concentrazione di contaminanti batterici, clustering riduce, e il cambiamento nei valori di T2 diminuisce. Pertanto, l'aggiunta di una modalità fluorescente è fondamentale....

Discussion

Questo protocollo è stato progettato per produrre completamente funzionale MFnS semplicemente come possibile. Tuttavia, ci sono molti punti chiave in cui alterazione del protocollo può essere utile, a seconda dell'obiettivo finale dell'utente. Ad esempio, l'uso di anticorpi differenti consentirebbe per il targeting di molti altri agenti patogeni. Inoltre, questo protocollo non è limitato all'uso di anticorpi come molecole di targeting. Qualsiasi molecola che ha affinità di legame specific...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro ferroso tetraidrato	Fisher Scientific	I90-500
Cloruro ferrico esaidrato	Fisher Scientific	I88-500
Idrossido di ammonio	Fisher Scientific	A669S-500
Acido cloridrico	Fisher Scientific	A144S-500
Acido poliacrilico	Sigma-Aldrich	323667-100G
EDC	Thermofisher Scientific	22980
NHS	Fisher Scientific AC157270250
Anticorpo anti-E. coli O111	sera care	5310-0352
Anticorpo anti-E. coli O157:H7 [P3C6]	Abcam	ab75244
DiI Stain	Fisher Scientific	D282
Brodo nutriente	Difco	233000
Liofilizzato E. coli O157:H7 pellet	ATCC	700728
Magnetic Relaxomteter	Bruker	mq20
Zetasizer	Malvern	NANO-ZS90
Lettore di piastre	Tecan	Infinite M200 PRO
	QuadroMACS	130-090-976
Centrifuga	Eppendorf		5804
(accuSpin Micro 17)	Fisher Scientific	13-100-676
Modello da pavimento Incubatore a scuotimento	SHEL LAB	SSI5
Bilancia analitica	Metler Toledo	ME104E
Miscelatore a vortice digitale	Fisher Scientific	02-215-370
Agitatore a dondolo all'aperto	Fisher Scientific	02-217-765