Modulazione reversibile mediata dalla luce del percorso proteico di kinasi attivato da Mitogen durante la differenziazione cellulare e Xenopus Sviluppo embrionale

Sommario

Questo protocollo descrive una strategia optogenetica per modulare l'attivazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) durante la differenziazione cellulare e lo sviluppo embrionale di Xenopus . Questo metodo consente l'attivazione reversibile del percorso di segnalazione MAPK nella coltura di cellule di mammiferi e negli organismi vivi multicellulari, come gli embrioni di Xenopus , con elevata risoluzione spaziale e temporale.

Abstract

L'attività cinasi è fondamentale per una pletora di funzioni cellulari, tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la migrazione e l'apoptosi. Durante il primo sviluppo embrionale, l'attività della chinasi è altamente dinamica e diffusa nell'embrione. Gli approcci farmacologici e genetici sono comunemente usati per sondare le attività di chinasi. Purtroppo, è difficile raggiungere una risoluzione spaziale e temporale superiore utilizzando queste strategie. Inoltre, non è possibile controllare l'attività cinasi in modo reversibile in cellule vive e organismi multicellulari. Tale limitazione rimane un collo di bottiglia per ottenere una comprensione quantitativa dell'attività cinasi durante lo sviluppo e la differenziazione. Questo lavoro presenta una strategia optogenetica che sfrutta un sistema bicistronic contenente proteine fotoattivatabili Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) e il dominio N-terminale di citochrome-interazione di base elica-loop-elica (CIBN). ReversiL'attivazione del percorso di segnalazione della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) è ottenuta attraverso la traslocazione proteica mediata dalla luce in cellule vive. Questo approccio può essere applicato alle colture di cellule di mammiferi e agli embrioni di vertebrati vivi. Questo sistema bicistronic può essere generalizzato per controllare l'attività di altre chinasi con meccanismi di attivazione similari e può essere applicata ad altri sistemi di modello.

Introduzione

I fattori di crescita sono coinvolti in un ampio spettro di funzioni cellulari, tra cui la proliferazione, la differenziazione, la migrazione e l'apoptosi e svolgono ruoli chiave in molti eventi biologici, inclusi lo sviluppo embrionale, l'invecchiamento e la regolazione dello stato mentale ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Molti fattori di crescita segnano attraverso complesse cascate intracellulari di segnalazione. Questi eventi di segnalazione sono spesso gestiti da fosforilazione proteica reversibile in modo preciso regolato ^{6 , 7} . Pertanto, una comprensione dei risultati di segnalazione delle proteine ​​chinasi, che sono responsabili della fosforilazione proteica, è fondamentalmente importante.

Diversi fattori di crescita agiscono attraverso una rete di segnalazione intracellulare piuttosto comune, anche se stimolano distRisposte cellulari inct ^{8 , 9} . I mediatori intracellulari comuni delle chinasi di tirosinici del recettore includono Ras, Raf, chinasi extracellulare-regolata (ERK), proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) / ERK chinasi (MEK), fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), Akt e gamma fosfolipasi C (PLCγ) ^{10 , 11} . L'accumulo di prove suggerisce che la diversità di segnalazione e la specificità dipendono dalla regolazione spaziale e temporale dell'attività di segnalazione ¹² . Ad esempio, nelle cellule di phaocromocytoma di ratto (PC12), la stimolazione del fattore di crescita epidermico (EGF), che provoca la proliferazione cellulare, attiva temporaneamente il percorso ERK ⁹ . D'altra parte, la stimolazione con il fattore di crescita del nervo (NGF), che porta alla differenziazione cellulare, attiva il percorso ERK in modo sostenibile ^{9 , 13} . In colture rNei neuroni ippocampali, la segnalazione transitoria da un fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) favorisce la crescita primaria del neurite, mentre la segnalazione sostenuta porta ad una maggiore ramificazione del neurite ¹⁴ . Durante il primo sviluppo embrionale, l'attività ERK fosforilata è temporaneamente dinamica e diffusa nell'embrione ⁶ . Una recente schermata genetica durante l'embriogenesi iniziale di Xenopus ha mostrato che le cascate di segnalazione ERK e Akt, due percorsi di fattore di crescita primario a valle, mostrano i profili di attivazione specifici di fase ⁷ . Così, una comprensione dei risultati di segnalazione di chinasi richiede strumenti che possono sondare le caratteristiche spaziali e temporali dell'attività cinasi con una risoluzione sufficiente.

Approcci sperimentali convenzionali per sondare la natura dinamica della trasduzione del segnale durante lo sviluppo non hanno la desiderabile risoluzione spaziale e temporale. Ad esempio, gli approcci farmacologici utilizzano la piccola chemMolecole ical o biologiche per stimolare o sopprimere la trasduzione del segnale nelle cellule e nei tessuti. La natura diffusa di queste piccole molecole rende difficile limitare la loro azione ad una regione specifica di interesse. Gli approcci genetici ( ad esempio, transgenesi, il sistema Cre-Lox o mutagenesi) spesso portano all'attivazione o alla repressione irreversibili dell'espressione genica o dell'attività proteica ^{16 , 17 , 18} . Il sistema Tet-On / Tet-Off ¹⁹ offre un controllo temporale migliorato della trascrizione del gene, ma manca di un controllo spaziale rigoroso perché si basa sulla diffusione della tetraciclina. I recenti sviluppi nella dimerizzazione delle proteine ​​chimicamente indotti dalla chimica ²⁰ o nella foto-scoperta ^{21 , 22 , 23 , 24} hanno notevolmente miglioramentiEd il controllo temporale delle reti di segnalazione. Il controllo spaziale, tuttavia, rimane impegnativo a causa della diffusione dei prodotti chimici in gabbia.

Recenti approcci optogenetici emergenti, che sfruttano il potere di luce per controllare le interazioni proteine-proteine, consentono la modulazione di percorsi di segnalazione con elevata precisione spatiotemporale e reversibilità. Poco dopo il suo successo iniziale nel controllo del cervello neuronale ^{25 , 26 , 27} , l'ottogenetica è stata estesa per controllare altri processi cellulari, come la trascrizione di geni, la traduzione, la migrazione cellulare, la differenziazione e l'apoptosi ^{28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34} . Una strategia che utilizza il pProteina hotoattivatabile La proteina cripto- cromica 2 (CRY2) di Arabidopsis thaliana e il dominio N-terminale dell'elica a base di elicoidale (CIBN) che interagiscono con citochrome è stato recentemente sviluppato per controllare l'attività di Raf1-chinasi nelle cellule di mammiferi e negli embrioni Xenopus ³⁵ . CRY2 si lega a CIBN su stimolazione azzurra-luce e il complesso proteico CRY2 / CIBN dissociata spontaneamente nel buio ³⁴ . La luce blu eccita il cofattore CRY2, il dinucleotide di flavin adenina (FAD), che porta ad un cambiamento conformazionale in CRY2 e successivamente legato a CIBN. I mutanti costituenti attivamente attivi (W374A) e flavin-deficienti (D387A) di CRY2 possono essere prodotti attraverso mutazioni nella tasca di legame FAD: il mutante CRY2 ^W374A si lega a CIBN indipendente dalla luce, mentre il mutante CRY2 ^D387A non si lega a CIBN sotto l'azzurro Stimolazione luminosa ^{36 , 37} . Il sistema ottogenetico descritto iN questo protocollo utilizza il tipo di wild-type CRY2 e CIBN per indurre l'attivazione Raf1 mediata dalla traslocazione proteica in cellule vive. È noto che il reclutamento della membrana di Raf1 aumenta la sua attività ³⁸ . In questo sistema, un modulo CIBN tandem è ancorato alla membrana plasmatica e CRY2-mCherry è fuso al terminale N di Raf1 ³⁵ . In assenza di luce blu, CRY2-mCherry-Raf1 rimane nel citoplasma, e Raf1 è inattivo. La stimolazione della luce blu induce il legame CRY2-CIBN e recluta Raf1 alla membrana plasmatica, in cui viene attivata Raf1. L'attivazione Raf stimola una cascata di segnalazione Raf / MEK / ERK. Entrambe le proteine ​​di fusione CRY2 e CIBN sono codificate in un sistema genetico bicistronico. Questa strategia può essere generalizzata per controllare altre chinasi, come Akt, il cui stato di attivazione può essere attivato anche dalla traslocazione proteica nelle cellule ³⁹ . Questo lavoro presenta protocolli dettagliati per l'implementazione di questa strategia optogenetica in cultu cellule di mammiferiRes e organismi multicellulari.

Protocollo

La ricerca sugli animali è stata condotta in conformità con le linee guida stabilite dall'Istituto per l'Assicurazione e l'Utilizzazione degli Animali Istituzionali (IACUC) e dall'Università dell'Illinois Dipartimento di Risorse Animali (DAR).

1. Induzione ottogenetica della localizzazione della proteina nella cultura cellulare delle cellule BHK21

NOTA: i passaggi 1.1-1.3 forniscono un metodo per assemblare una camera di coltura cellulare per l'imaging con obiettivi di ingrandimento elevato ( ad es., 63X o 100X), che presentano tipicamente brevi distanze di lavoro. Questi obiettivi richiedono una copertura in vetro sottile ( ad esempio, spessore 1,5 mm, 170 μm) come substrato di imaging. In alternativa, può essere utilizzato un piatto / diapositiva di coltura a cellule in vetro. In questo caso, i passi 1.1-1.3 possono essere ignorati.

1. Pulizia dei vetri in vetro
   1. Posizionare 30 coperchio di vetro in un supporto per copertina.
   2. In un bicchiere di plastica da 600 ml, aggiungere 20 g di detersivo e 400 ml di acqua calda del rubinetto. PlacIl bicchiere su un agitatore magnetico e mescolare fino a quando tutto il detergente è sciolto. Rimuovere la schiuma usando carta tissue.
   3. Utilizzare il fondo di un piatto di Petri di 100 mm x 15 mm come distanziatore dalla barra di stirata e come superficie per il supporto del coperchio. Per mantenere un adeguato flusso durante il processo di pulizia, fare 3-4 fori di drenaggio nel piatto Petri.
   4. Per fare i fori di drenaggio, scaldare un ferro saldato e bruciare la plastica in un cappuccio ventilato.
      ATTENZIONE: non toccare il ferro saldato riscaldato con le mani nude.
   5. Posizionare il portacoperta sul piatto Petri nel bicchiere. Mescolare per 2 ore fino a notte a temperatura ambiente.
   6. Lavare tre volte con 500 ml di acqua DI in un becher da 1.000 ml. La soluzione detergente può essere riutilizzata.
   7. Raccogli le copertine individuali usando le pinze. Immergere le copertine in etanolo a prova di 190% (95%) per 1 minuto.
   8. Asciugare le copertine all'interno di un cappuccio sterile. Conservare le copertine in un contenitore di plastica sterile fino all'uso.
2. Realizzazione di coperchi rivestiti in poli-L-lisina (PLL)
   1. Creare un tampone di borato di 0,1 M sciogliendo 1,24 g di acido borico e 1,9 g di tetraborato di sodio in 400 ml di acqua. Regolare il pH a 8,5 con 10 M NaOH.
   2. Sciogliere PLL nel tampone di borato fino ad una concentrazione finale di 1 mg / mL. Aliquot la soluzione PLL in tubi sterilizzatori sterili da 50 ml.
   3. Aggiungere 50 ml di soluzione di rivestimento PLL a un piatto da 10 cm di coltura tissutale. Posizionare il piatto in un incubatore a 37 ° C per riscaldare la soluzione PLL.
   4. Aprire il contenitore del coperchio (passo 1.1.8) in un cappuccio sterile.
   5. Immersione dei coperchi puliti uno alla volta nella soluzione PLL pre-riscaldata nel piatto di coltura tissutale. Evitare la formazione di bolle per immergere tutte le superfici.
   6. Posizionare il piatto con la copertura in un incubatore di CO ₂ a 37 ° C durante la notte. Togliere ogni coperchio e collocarlo in un portacandele sterile. Sciacquare tre volte con acqua ultrapure autoclavata (18,2 MΩ & #183; cm resistivity) in un becher da 1000 ml in un cappuccio sterile.
   7. Asciugare le copertine nel supporto del coperchio nel cappuccio sterile. Conservare le copertine in un contenitore di plastica sterile fino all'uso.
3. Assemblaggio di camere di coltura cellulare polidimetilsilossano (PDMS)
   1. In un contenitore di plastica, pesare 40 g di base di PDMS e aggiungere 4 g di agente di tintura per ottenere un rapporto 10: 1 w / w di PDMS e agente di tintura. Mescolare l'agente PDMS / agente mescolando con una punta pipetta per 2 min. In alternativa, utilizzare un miscelatore centrifugo.
   2. Utilizzare un bicchiere con un diametro di 4 pollici come modello per realizzare un supporto con un foglio di alluminio. Posizionare il supporto di alluminio in un piatto di Petri da 15 cm. Posizionare un wafer di silicio da 4 pollici all'interno di questo portafoto in alluminio.
   3. Versare la soluzione mista PDMS nel supporto. Utilizzare una barra di vetro sottile per toccare delicatamente il bordo della wafer. Rimuovere tutte le bolle d'aria intrappolate sotto il wafer.
   4. Inserire il piatto di Petri da 15 cm in un camino a vuotoR per degas la soluzione PDMS. Continuare a degassare per circa 20 minuti, finché non si generano bolle. Nel frattempo, preriscaldare un forno a convezione a 65 ° C.
   5. Posizionare con cura il piatto di Petri da 15 cm nel forno. Incubare per 2 ore.
   6. Rimuovere la piastra dal forno. Utilizzare una barra di vetro per toccare delicatamente il bordo del PDMS e assicurare un collegamento reticolato completo. In caso contrario, incubare più a lungo, finché il PDMS non è solido e non appiccicoso.
   7. Rimuovere il foglio di alluminio dalla piastra e scollegarlo dal wafer di silicio. A partire dal bordo, scorri attentamente il PDMS curato dal wafer di silicio.
      ATTENZIONE: Evitare di applicare troppa forza, in quanto può rompere il wafer.
   8. Tagliare il PDMS in pezzi rettangolari da 20 mm x 30 mm per montare il coperchio da 24 mm x 40 mm con una lama di rasoio.
   9. Utilizzare una lama a scalpello per tagliare un'apertura rettangolare di 10 mm x 20 mm dal centro di ogni pezzo PDMS.
   10. Pulire le camere PDMS utilizzando il protocollo detergente descritto nel punto 1.1.
   11. Asciugare le camere PDMS in un cappuccio pulito. Posizionare le camere asciutte in un contenitore autoclavabile ricoperto di foglio di alluminio.
   12. Autoclave il contenitore con gravità (121 ° C, 15 psi) per 30 minuti e conservare il contenitore a temperatura ambiente.
4. Coltura e transfezione di cellule BHK21
   1. Preparare 500 mL di terreno per la coltura di cellule BHK21 mescolando 445 mL di DMEM con 50 mL di FBS e 5 mL di 100x Penn-Strep-Glutamine (10.000 U / mL penicillina, 10 mg / mL streptomicina e 29.2 mg / mL L -Glutammina). Assicurarsi che la concentrazione finale di FBS sia del 10%.
   2. Aliquot 10 ml di mezzo indipendente di CO ₂ non HEPES per l'imaging a cellule vive.
      NOTA: il supporto indipendente di CO ₂ supporta la crescita cellulare senza un incubatore di CO ₂ ed è ideale per le cellule di imaging in condizioni atmosferiche. Per informazioni dettagliate, fare riferimento all'elenco Materiali. Oltre alla linea cellulare BHK21, anche altri tipi di cellule di mammiferi dovrebbero dareRisultati simili.
   3. Assemblare un dispositivo di coltura di cellule posizionando una camera di PDMS sterilizzata autoclavata (punto 1.3) su una copertura di copertura sterile PLL (fase 1.2) in un cappuccio sterile.
   4. Posizionare ogni dispositivo in un piatto di Petri sterile da 60 mm.
   5. Utilizzare 0,5 mL di 0,25% di trypsina per staccare le cellule da un pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 12 pozzetti. Conta la densità cellulare con un emocitometro. Piastra 20.000 cellule BHK21 nella camera (circa 10.000 cellule / cm ² ) con 200 μL di terreno di coltura cellulare.
   6. Preparare il plasmide DNA con un kit di preparazione del plasmide (vedere l'elenco dei materiali).
      NOTA: Il disegno e la funzionalità del CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX sono mostrati nella Figura 1A - 1B .
   7. Ventiquattro (24) h dopo la placcatura cellulare, trasfettano le cellule con 50-100 ng di plasmide CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX, secondo il protocollo del produttore.
   8. Tre (3) ore dopo la trasfezione, cambiare la mFino a 200 μl di mezzo di coltura fresco (punto 1.4.1) e consentire alle cellule di recuperare durante la notte incubando la coltura in un incubatore di CO ₂ a 37 ° C.
5. Imaging a cellule vive a fluorescenza
   1. Accendere un computer, una sorgente luminosa, un microscopio e una fotocamera. Utilizzare un microscopio confocale a fluorescenza (dotato di un obiettivo di immersione a olio 100X) per il resto del protocollo.
      NOTA: può anche essere utilizzato un microscopio in epifluorescenza invertito.
   2. Sostituire il mezzo di coltura cellulare con 200 μL di mezzo indipendente dal CO ₂ .
   3. Impostare il protocollo di acquisizione dati prima di posizionare le celle sul microscopio. Usare un canale FITC di eccitazione 488 nm per la stimolazione ottogenetica. Utilizzare il canale TRITC di eccitazione di 561 nm per individuare le cellule trasfettate e monitorare la localizzazione cellulare della proteina con etichetta mCherry.
   4. Impostare il guadagno dei canali FITC e TRITC rispettivamente come 120 e 200. Utilizzare un tempo di dimensione pixel di 2,21 e la dimensione di 512 x 512 pixel.
   5. Misurare la potenza della luce di 488 nm mettendo un misuratore di potenza vicino alla finestra obiettivo. Un potere totale di 2 μW (circa 10.000 W / cm ² al fuoco) è sufficiente per indurre l'associazione CIBN-CRY2PHR.
   6. Impostare un'acquisizione timestamp con un intervallo di 5 s e un tempo totale di acquisizione di 2 min.
   7. Applicare il materiale corrispondente dell'indice (olio di immersione) sulla finestra obiettiva. Utilizzare la modalità di contrasto di fase per concentrarsi sulle celle sulla superficie del coperchio.
   8. Individuare una cella trasfettata sotto la luce di 561 nm spostando lo stadio del microscopio.
      ATTENZIONE: Evitare di utilizzare la luce blu durante questo passaggio poiché attiverà l'associazione tra le proteine ​​fotoattivatabili.
   9. Una volta localizzata una cella trasfettata, avviare l'acquisizione di dati.
      NOTA: Le cellule trasfettate con successo devono mostrare fluorescenza in entrambi i canali FITC (da 2CIBN-GFP-CaaX) e TRITC (da CRY2-mCherry-Raf1) ( Figura 1C-D
   10. Registrare una serie di immagini timbrate in entrambi i canali FITC e TRITC ( Figura 1D ).
   11. Per sondare la disintegrazione spontanea del complesso proteico CRY2-CIBN, registrare un altro timestamp con il canale Txred da solo per 20 minuti, con un intervallo di 30 s.
   12. Salvare l'immagine stampata in tempo per l'analisi dei dati.
6. Analisi delle immagini
   1. Aprire le immagini con un software di analisi delle immagini che può estrarre l'intensità da un'immagine ⁴⁰ .
   2. Selezionare due istantanee rappresentative: una prima dell'esposizione azzurra e l'altra esposizione post-blu-luce.
   3. Disegnare una linea attraverso la cella che attraversa lo sfondo, la membrana plasmatica e il citoplasma. Proietta l'intensità lungo questa linea. Salvare i valori e tracciarli per confrontare la differenza prima e dopo l'esposizione alla luce ( Figura 1D ).
   4. Per analizzare la cinetica dell'associazione proteica, selecUna regione rappresentativa di interesse (ROI) nella membrana plasmatica, un ROI nel citoplasma e un ROI in background.
   5. Acquisisci le intensità medie della membrana plasmatica (I _PM ), il citoplasma (I _CYT ) e lo sfondo (I _BKD ) per lo stack di immagini.
   6. Calcolare il rapporto di intensità membrana / citosolica per ogni immagine utilizzando la seguente equazione:
      
   7. Trama il rapporto rispetto al tempo e determina la cinetica di legame o dissociazione di CRY2-CIBN ( Figura 1E- F ).

2. Costruzione di un array LED per la stimolazione luminosa a lungo termine in un incubatore di CO ₂

NOTA: Lo schema generale della configurazione sperimentale è mostrato in Figura 2A .

1. Effettuare l'array LED inserendo 12 LED blu in due barriereDs e resistenze limitanti di corrente di collegamento.
   NOTA: con un alimentatore a 30 V, quattro LED possono essere collegati in serie e la loro luminosità può essere controllata da una resistenza di limitazione di corrente.
2. Posizionare i pannelli in una scatola di alluminio.
   NOTA: L'altezza della scatola di alluminio dovrebbe essere di 2 pollici. Questa altezza è ottimale per illuminare una piastra di coltura dei tessuti a 12 pozzetti, poiché la dimensione del punto di luce divergente è la stessa di quella di un singolo pozzetto.
3. Usare due fili metallici per collegarsi all'alimentatore. Assicurarsi che la lunghezza del filo sia sufficiente quando la scatola luminosa è posta all'interno di un incubatore di CO ₂ .
4. Utilizzare un diffusore di luce trasparente come coperchio della scatola luminosa ( figura 2C ).
5. Calibrare l'uscita di potenza di ciascun LED ad una gamma di ingressi di tensione. Utilizzare un potere di 0,2 mW / cm ² per il saggio di differenziazione delle cellule PC12 a 24 ore. Utilizzate un potere di 5 mW / cm ² per embrioni o esplosioni Xenopus dal vivosaggi.

3. Induzione ottogenetica della differenziazione cellulare PC12

1. Coltura e transfezione cellulare
   1. Preparare 500 ml di mezzo per una coltura di cellule di phaocromocytoma di ratto (PC12) mescolando 407,5 ml di F12K con 75 ml di siero di cavallo + 12,5 ml di FBS + 5 ml di 100 × Penn-Strep-Glutamine (concentrazioni finali del siero di cavallo e FBS : Rispettivamente del 15% e del 2,5%). Realizzare un substrato a basso tenore di sangue mescolando 1 volume di mezzo completo in 99 volumi di media F12K.
   2. Piastre PC12 in una piastra a 12 pozzetti ad una densità di 300.000 cellule / pozzetto o 75.000 cellule / cm ² .
   3. Trasfettare le cellule con CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 ore dopo la placcatura cellulare (simile al passaggio 1.4.7). Utilizzare 1,2 μg di DNA per ogni pozzetto. Lasciare le cellule recuperare durante la notte in terreno di coltura in un incubatore a 37 ° C completato con 5% di CO ₂ . Controllare l'efficienza della trasfezione 16 h dopo la trasfezione.
      NOTA: una trasfezione 30-50% effSi dovrebbe ottenere un'accurata necessità per garantire un numero sufficiente di cellule.
   4. Cambiare il mezzo medio a basso contenuto di siero 24 h dopo la trasfezione. Utilizzare 1 ml di media per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
2. Differenziazione delle cellule PC12 indotta dalla luce
   1. Posizionare l'array LED in un incubatore CO ₂ . Collegarlo all'alimentatore utilizzando un paio di fili. Impostare la potenza del LED a 0,2 mW / cm ² . Posizionare la lastra a 12 pozzetti contenenti le cellule PC12 trasfettate (fase 3.1.3) sulla finestra dell'array LED. Applicare l'illuminazione continua della luce per 24 h in un incubatore a 37 ° C completato con 5% di CO ₂ .
3. Imaging di cellule vive in fluorescenza
   1. Seguire i punti 1.5.1-1.5.4 per il microscopio e la preparazione del campione.
   2. Impostare l'acquisizione di dati singola snapshot. Utilizza 200 ms per il canale GFP e Txred.
   3. Cattura immagini delle cellule trasfuse in entrambi i canali GFP e Txred. Registra circa 200 celLs per ogni condizione. Salvare i file per l'analisi dei dati.
4. Analisi delle immagini
   1. Contare la percentuale di cellule differenziate sul numero totale di cellule trasfettate.
   2. Utilizzare qualsiasi modulo di conteggio delle celle nel software di analisi delle immagini per contare le celle.
   3. Contare manualmente le celle differenziate.
      NOTA: le cellule differenziate sono definite come quelle in cui almeno un neurite è discernibilmente più lungo del corpo cellulare ( Figura 3A - 3B ).
   4. Ripetere il passaggio 3.4.3 con le cellule indifferenziate.
   5. Calcola il rapporto di differenziazione utilizzando la seguente equazione:
      

4. Controllo ottogenetico dell'attività kinasi negli embrioni Xenopus

1. Preparazione dei tamponi
   1. Preparare 1 L di 1x Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mMNaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 e 5 mM HEPES; PH 7,5.
2. Preparazione di mRNA
   1. Digestare il DNA plasmidico CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX (2 μg) con 1 μl di ApaI (50 unità) a 37 ° C per 2 ore.
   2. Precipitare il DNA linearizzato in 60 μl di etanolo al 100%. Spinare a 12.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per pelletare il DNA. Rimuovere con cautela il surnatante e lavare il pellet con 60 μl di etanolo al 70%. Spin a 12.000 × g per altri 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet di DNA in 6 μl di H ₂ O senza RNasi.
   3. Eseguire la trascrizione in vitro mediante incubazione di 1 μg di DNA linearizzato con 2 μl di polimerasi SP6 RNA in dotazione, una miscela ribonucleotide (10 mM ATP, CTP e UTP, 2 mM GTP e 8 mM cap analogo) e 20 μL di nucleasi nucleasi- Libera acqua a temperatura ambiente per 1 h.
   4. Rimuovere il DNA mediante digestione di DNasi I a 37 ° C per almeno 15 minuti e purificare l'RNA sintetizzato usando una colonna di spin di membrana di silice.
   5. Arrestare la reazione e precipitare l'RNA aggiungendo 30 μL di acqua priva di nucleasi e 30 μL di soluzione di precipitazione LiCl. Mescolare bene e raffreddare per 30 minuti a -20 ° C.
   6. Centrifugare a 4 ° C per 15 minuti a 12.000 × g per far pelliccare l'RNA.
   7. Rimuovere con cautela il surnatante. Lavare l'RNA una volta con 1 ml di etanolo al 70% e risospendere in 40 μL di acqua priva di nucleasi.
   8. Caricare 40 μL di RNA in una colonna di rotazione. Centrifugare a 4 ° C per 1 min a 12.000 × g per rimuovere i nucleotidi e le protezioni non incorporati.
3. Harvest Xenopus embrioni
   1. Seguire il protocollo descritto da Sive et al. ⁴¹ per ottenere gli embrioni Xenopus .
4. Microinjection di mRNA
   1. FabbricareGli aghi per la microinezione tirando i capillari di vetro con un tirante capillare. Impostare il programma di tiro su: calore = 355, forza di trazione = 80, velocità = 50 e tempo = 100.
   2. Rimuovere il cappotto di gelatina dagli embrioni trattandoli con 3% di cisteina (diluito in 0.2x MMR).
   3. Trasferire gli embrioni a 3% di polisolfuro e 0.5x di soluzione MMR per la microinezione. Iniettare 500 pg a 1 ng di CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA in ogni embrione.
      NOTA: L'iniezione di una dose superiore a 1 ng produce un'attivazione indipendente dalla luce blu della segnalazione MAPK.
5. Stimolazione ottogenetica dell'attività di chinasi
   1. Coltivare embrioni microinjected in 3% polysucrose, 0,5x soluzione MMR a temperatura ambiente fino a raggiungere la metà gastrula fase (fase 12). Quindi, coltivate gli embrioni in soluzione MMR 0,2 x.
   2. Trasferite gli embrioni o gli esplanti a una piastra a 12 pozzetti. Posizionare la piastra a 12 pozzetti sulla matrice LED a casa (passo 2.5) per il colore bluT (475 nm).
   3. Posizionare uno specchio sulla parte superiore della piastra a 12 pozzetti per assicurare un'illuminazione a pieno azzurro degli embrioni o delle esplosioni.
   4. Regolare la potenza della luce blu a 5 mW / cm ² .
      NOTA: Il trattamento con luce blu può essere eseguito in qualsiasi momento desiderato, sia in polisolfuro al 3%, in soluzione MMR da 0.5x, o in soluzione 0.2x MMR.
   5. Raccogli gli embrioni in qualsiasi momento desiderato. Usalo per un'analisi istologica, Western blot o di espressione genica.

Risultati

Espressione ratiometrica di coppie di proteine ​​fotoattivatabili: la figura 1A mostra la progettazione di un costrutto ottogenetico bicistronico, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (denominato CRY2-2A-2CIBN), basato sulla teschovirum- 1 2A (P2A), che mostra la più alta efficacia di riduzione dei ribosomi tra le linee cellulari mammiferi ⁴² . Nel lavoro precedente, è stato stabilito che il rapporto ottimale per CIBN-GFP-CaaX: CR...

Discussione

Quando si costruisce la scatola luminosa, è necessario misurare la potenza dei singoli LED. Sulla base dell'esperienza precedente, l'uscita di potenza può variare tra i singoli LED a causa della varianza di produzione. Selezionare un gruppo di LED che hanno una potenza entro il 10% dell'altro. Il numero di LED, la resistenza di limitazione corrente e l'ingresso di potenza possono essere modificati per diversi tipi di contenitori per la coltura cellulare ( ad esempio, una piastra a 6 oa un pozzet...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrino coprioggetti	VWR	48393 230	Substrato per l'imaging di cellule vive
Supporto per vetrino coprioggetti	Newcomer Supply	6817B	Supporto per vetrini coprioggetti
Detersivo	ThermoFisher	16 000 104	Per la pulizia dei vetrini coprioggetti
Acido borico	Sigma-Aldrich	B6768-500G	Per la produzione di tampone PLL
Tetraborato disodico	Sigma-Aldrich	71996-250G	Per la produzione  Tampone PLL
Becher in plastica	Nalgene	1201-1000	Per la pulizia dei vetrini coprioggetti
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	221465-2.5KG	Per regolare il pH
Bromidrato di Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P1274-500MG	Per il rivestimento di vetrini coprioggetti
Acqua trattata con dietilpirocarbonato (DEPC)	ThermoFisher Scientific	750024	Per la preparazione del DNA
Copertura Pinze in vetro	Ted Pella	5645	Copertura in vetro per la manipolazione
Piatto per posate in tessuto	Thermofisher	12565321	Piatto per colture cellulari
Provette da centrifuga sterili	ThermoFisher	12-565-271	Conservazione tampone
Reagente di trasfezione	ThermoFisher	R0534	Trasfezione
Terreno indipendente da CO2 ThermoFisher		18045088	Per l'imaging di cellule vive
Polidimetilsilossano (PDMS)	Adesivi Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit	Qiagen	12965	Preparazione plasmidi
DMEM medium	ThermoFisher	11965-084	Componente del terreno di coltura cellulare
F12K medium	ThermoFisher	21127022	Componente del terreno di coltura cellulare
Siero di cavallo	ThermoFisher	16050122	Componente del terreno di coltura cellulare
Siero fetale bovino	Signa-Aldrich	12303C-500 mL	Componente del terreno per coltura cellulare
Penicillina-Streptomicina-Glutammina	ThermoFisher	10378016	Componente del terreno per la coltura cellulare
Tripsina (0,25%), rosso fenolo	ThermoFisher Scientific	15050065	Per la dissociazione di cellule di mammifero
Agarosio	Fisher Scientific	BP1356-100	Per la preparazione del DNA
Ficoll PM400	GE Heathcare Life Sciences	17-5442-02	Per tampone embrionale
L-Cisteina cloridrato monoidrato	Sigma-Aldrich	1.02839.0025	Preparazione di ovociti
ApaI	ThermoFisher	FD1414	Per la linearizzazione dei plasmidi
Dnase I	ThermoFisher	AM2222	Per la rimozione del modello di DNA nel test di trascrizione in vitro
Materiali di corrispondenza dell'indice (olio da immersione)	Thorlabs	MOIL-20LN	Per la corrispondenza dell'indice tra il substrato del campione e l'obiettivo
LED blu	Adafruit	301	Sorgente luminosa per stimolazione optogenetica
Kit resistore	Amazon	EPC-103	Resistore limitatore di corrente
Scatole in alluminio	BUD Industries	AC-401	light box
BreadBoard	Jekewin	837654333686	Per la realizzazione di array di LED
Collegare il cavo	Electronix Express	27WK22SLD25	Per la realizzazione di array di LED
Modulo relè	Jbtek	SRD-05VDC-SL-C	Per il controllo intermittente
della luce Alimentazione CC	TMS	DCPowerSupply-LW-(PS-305D)	Alimentatore per LED
Silicio  Potenza  Testa	Thorlabs	S121C	Per la misurazione dell'intensità luminosa
Misuratore di potenza	Thorlabs	PM100D	Per la misurazione dell'intensità luminosa
Microscopio	Leica Biosystems	DMI8	Per l'imaging di cellule vive
Armadio di sicurezza biologica	ThermoFisher	1300 Serie A2	Per la manipolazione di cellule di mammifero
Incubatrice CO2	ThermoFisher	Isotemp	Per la coltura di cellule di mammifero
Stereomicroscopio	Leica	M60	Per la micromanipolazione degli embrioni
Microiniettore	Narishige	IM300	Per microiniezione di embrioni
Estrattore per micropipette	Sutter Instruments	P87	Estrattore per ago
in vitro kit di trascrizione	ThermoFisher	AM1340	Per in vitro trascrizione. Il kit include acqua priva di nucleasi, RNA SP6 Polimerasi, miscela di ribonucleotidi, analogo del tappo, soluzione di precipitazione del coride di litio e colonna di spin.
Kit per la purificazione dell'RNA	Qiagen	74104	Colonna rotante con membrana in silice per la purificazione dell'RNA sintetizzato
Forno a convezione	MTI corporation	EQ-DHG-9015	Miscelatore centrifugo per polimerizzazione PDMS
e contenitore in teflon	THINKY	AR310	Per la miscelazione di wafer di
silicio	PDMS UniversityWafer	452	Base per la realizzazione di dispositivi PDMS
Blade	Techni Edge	01-801	Per il taglio
PDMS Vetro capillare	Sutter Instruments	BF100-58-10	Per la fabbricazione di aghi per iniezione. nbsp;