L'obiettivo di questo protocollo è quello di delineare la raccolta e l'elaborazione di campioni chirurgici umani per molteplici applicazioni a valle nello schwannoma vestibolare e nella ricerca delle cellule di Schwann.
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Articolo metodologico
Un quadro metodologico unificato per la ricerca di Schwannoma Vestibolare
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli schwannomi vestibolari sono le neoplasie più comuni dell'angolo cerebellopotintico, che costituiscono il 6-8% per cento di tutte le crescite intracraniche. Sebbene questi tumori causino perdita uditiva sensa-neurale fino al 95% degli individui affetti, i meccanismi molecolari che sottendono questa perdita dell'udito rimangono inaspettati. Questo articolo delinea i passi stabiliti nel nostro laboratorio per facilitare la raccolta e l'elaborazione di vari campioni di tessuto umano primario per applicazioni di ricerca a valle integrate nello studio degli schwannomi vestibolari. In particolare, questo lavoro descrive un quadro metodologico unificato per la raccolta, l'elaborazione e la coltura di Schwann e schwannoma da campioni chirurgici. Questo è integrato con processi di elaborazione parallela ora considerati essenziali per la ricerca attuale: la raccolta di secrezioni tumorali e nervose, la conservazione dell'RNA e l'estrazione di proteine dai tessuti raccolti, la fissazione del tessuto per la preparazione di sezioni,D l'esposizione delle cellule umane primarie ai virus adeno-associati per l'applicazione alla terapia genica. Inoltre, questo lavoro mette in evidenza l'approccio chirurgico traslabellinoso per raccogliere questo tumore come un'occasione unica per ottenere l'epitelio umano sensoriale dall'orecchio e dalla periferia. Sono forniti suggerimenti per migliorare la qualità sperimentale e mettere in evidenza metodi comuni.
Introduzione
Gli schwannomi vestibolari (VSs) sono le neoplasie più comuni dell'angolo del cerebellopotina, diagnosticate in 1 ogni 100.000 individui. Anche se non metastatici, questi tumori influenzano gravemente la qualità della vita di un paziente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Gli individui affetti abitualmente vivono con perdita dell'udito, tinnito e una sensazione di pienezza ascoltale. I sintomi diventano sempre più debilitanti quando il tumore cresce, causando problemi di equ....
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Protocollo
Il consenso informato scritto per la raccolta di tutti i campioni è stato ottenuto prima dell'intervento e gli esperimenti sono stati eseguiti secondo il Codice Etico dell'Associazione Medica Mondiale (Dichiarazione di Helsinki). Tutte le sezioni del protocollo di studio sono state approvate dal consiglio di revisione istituzionale del Massachusetts Eye e Ear e Massachusetts General Hospital.
NOTA: Le sezioni 1-7 qui di seguito sono progettate per essere eseguite in sequenza sulla ricezione di un campione primario umano VS o GAN dalla sala operatoria. L'elaborazione dovrebbe iniziare sempre con la sezione 1. Quindi, in linea d....
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Risultati
Le cellule VS umane primarie nella cultura, come stabilito nella sezione 5, possono essere trattate come modelli informativi per i processi associati alle malattie in molte applicazioni di ricerca a valle ( Figura 1 ). Le cellule Schwann sane coltivate nella sezione 6 forniscono un punto di confronto diretto e istruttivo. Come descritto di seguito, i dati estesi dei VS e dei GAN elaborati in base a questo quadro metodologico unificato sono disponibili in più.......
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Discussione
Questo manoscritto descrive un quadro metodologico unificato per la ricerca VS, che descrive la lavorazione simultanea di esemplari di VS e GAN umani per applicazioni di ricerca a valle. Poiché la ricerca VS entra nell'epoca della medicina di precisione, preparando lo stesso campione in forme in grado di rispondere a numerose domande di ricerca, consentirà la scoperta di visioni molecolari, cellulari, genetiche e proteomiche specifiche per singoli pazienti.
La purezza della cellula umana.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Nazionale di Sordità e altri Disturbi della Comunicazione con sovvenzioni R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (sostenendo JES e SD), il Dipartimento della Difesa concede la W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fondazione Bertarelli (KMS) , La Fondazione di Nancy Sayles Day (KMS), il Centro di ricerca del tinnito di Lauer (KMS) e la Fondazione Barnes (KMS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BioCoat Poly-D-Lisina/Laminin 12 mm #1 Vetrino coprioggetti tedesco | Corning | 354087 | Oppure preparare i vetrini coprioggetti con Corning Laminin (CB-40232) e Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 mL Provette per centrifuga, fondo conico, graduazione, sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 mL Provette per centrifuga, fondo conico, graduazione, sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Piatto per colture cellulari CELLSTAR, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum, filtrato sterile | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Well Pool Plates, sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, glicemia alta, piruvato, senza glutammina, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Pinze, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prima dell'uso |
| Dumont #5 Pinze, punta standard, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prima dell'uso |
| Siero fetale bovino, qualificato, regioni approvate dall'USDA, 500 ml Thermo | Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquotare in provette da 50 ml e conservare in -20 gradi C congelatore |
| Ialuronidasi da testicoli bovini, tipo I-S, polvere liofilizzata | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP siringa unità filtro, 0,22 e micro; m, polietersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldeide, grado di reagente, cristallino | Sigma-Aldrich | P6148 | Prima dell'uso: Stabilire procedure operative standard basate sui protocolli disponibili online |
| PBS, pH 7,4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | prima dell'uso |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Compresse di inibitori della fosfatasi PhosSTOP | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Compresse di inibitori della proteasi | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipette e puntali per pipette, 5/10/25 mL | Pestello | ||
| da 1,5/2,0 mL E | & K Scientific | EK-10539 | |
| Aghi PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| tampone RIPA | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (soluzione di stabilizzazione dell'RNA) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Provette per microcentrifuga Safe-Lock, polipropilene, 0,5 mL | Eppendorf | 022363719 Autoclave prima dell'uso | |
| Provette per microcentrifuga Safe-Lock, polipropilene, 1,5 mL | Autoclave Eppendorf | 022363204 | prima dell'uso |
| Soluzione salina - Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, batteriostatica, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Lame per bisturi - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tubo di aspirazione Schuknecht calibro 24 | Bausch + Lomb | N1698 42 | Utile per l'approccio chirurgico (in aggiunta ai comuni strumenti chirurgici otologici) e ad es un marcatore chirurgico blu |
| Contenitore per campioni, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stereomicroscopio Stemi 2000-C | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Combinazione siringa/ago, punta Luer-Lok, 5 mL, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Solo siringa per tubercolina, punta a scorrimento, 1 mL | 309659 | ||
| solo siringa per tubercolina, punta a scorrimento, 3 mL | BD | 309656 | |
| Omogeneizzatore a ultrasuoni, serie 4710, sonda CV18 | Cole-Parmer | CP25013 |
Riferimenti
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and manage....
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Ristampe e permessi
