Articolo metodologico

Un quadro metodologico unificato per la ricerca di Schwannoma Vestibolare

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DOI:

10.3791/55827

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20 giugno 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è quello di delineare la raccolta e l'elaborazione di campioni chirurgici umani per molteplici applicazioni a valle nello schwannoma vestibolare e nella ricerca delle cellule di Schwann.

Abstract

Gli schwannomi vestibolari sono le neoplasie più comuni dell'angolo cerebellopotintico, che costituiscono il 6-8% per cento di tutte le crescite intracraniche. Sebbene questi tumori causino perdita uditiva sensa-neurale fino al 95% degli individui affetti, i meccanismi molecolari che sottendono questa perdita dell'udito rimangono inaspettati. Questo articolo delinea i passi stabiliti nel nostro laboratorio per facilitare la raccolta e l'elaborazione di vari campioni di tessuto umano primario per applicazioni di ricerca a valle integrate nello studio degli schwannomi vestibolari. In particolare, questo lavoro descrive un quadro metodologico unificato per la raccolta, l'elaborazione e la coltura di Schwann e schwannoma da campioni chirurgici. Questo è integrato con processi di elaborazione parallela ora considerati essenziali per la ricerca attuale: la raccolta di secrezioni tumorali e nervose, la conservazione dell'RNA e l'estrazione di proteine ​​dai tessuti raccolti, la fissazione del tessuto per la preparazione di sezioni,D l'esposizione delle cellule umane primarie ai virus adeno-associati per l'applicazione alla terapia genica. Inoltre, questo lavoro mette in evidenza l'approccio chirurgico traslabellinoso per raccogliere questo tumore come un'occasione unica per ottenere l'epitelio umano sensoriale dall'orecchio e dalla periferia. Sono forniti suggerimenti per migliorare la qualità sperimentale e mettere in evidenza metodi comuni.

Introduzione

Gli schwannomi vestibolari (VSs) sono le neoplasie più comuni dell'angolo del cerebellopotina, diagnosticate in 1 ogni 100.000 individui. Anche se non metastatici, questi tumori influenzano gravemente la qualità della vita di un paziente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Gli individui affetti abitualmente vivono con perdita dell'udito, tinnito e una sensazione di pienezza ascoltale. I sintomi diventano sempre più debilitanti quando il tumore cresce, causando problemi di equilibrio, paralisi facciale e alterazioni delle altre funzioni del nervo cranico. Anche le complicazioni pericolose per la vita a causa della compressione del tronco cerebrale possono avere luogo 7 .

Le opzioni di gestione per VS sono essenzialmente limitate all'attesa vigile di tumori statici e terapia radioterapica stereotattica o resezione chirurgica per tumori in crescita 8. La rimozione chirurgica di questi tumori negli ospedali affiliati alla ricerca presenta l'opportunità di acquisire e analizzare i tessuti freschi del tumore raccolti durante interventi di pazienti. Un approccio chirurgico specifico alla VS, la resezione translabellinale, può anche offrire l'accesso a preziosi epitelio umano sensoriale dall'orecchio e dalla periferia.

Poiché VS provengono da un nervo sensoriale periferico ( vale a dire il nervo vestibolare), è importante confrontare le osservazioni associate a VS con quelle derivate da un appropriato nervo di controllo, come il grande nervo auricolare umano (GAN). GANs sani vengono sacrificati regolarmente durante le parotidectomie o le dissezioni del collo e possono essere utilizzate come modelli robusti per una fisiologia sana di Schwann 9 .

Poiché non esistono farmaci approvati dalla FDA per il trattamento o la prevenzione di VS sporadiche, è indispensabile che i ricercatori illustrano la mecha molecolare sottostanteGli effetti della malattia per identificare i bersagli terapeutici. Le proteine ​​che hanno dimostrato di avere un ruolo nella patogenesi della VS includono il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), la cicloossigenasi 2 (COX-2), il fattore nucleare kappa B (NF-κB), il fattore di necrosi tumorale (TNF-alfa) , Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e le relative molecole di segnalazione 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

I progressi recenti hanno ampliato e migliorato i protocolli per la raccolta, l'elaborazione, la cultura e l'analisi a valle degli schwannomi vestibolari umani primari e dei tessuti nervosi sani 18 , 19 . Tuttavia, la maggior parte dei protocolli esistenti sono progettati per ospitare la preparazioneZione di tali tessuti per un'unica applicazione di ricerca a valle ( vale a dire, solo la coltura cellulare). Questo articolo presenta un quadro metodologico unificato per l'elaborazione simultanea di un singolo campione primario umano VS o GAN per più applicazioni a valle: cultura specifica di tipo cellulare, estrazione proteica, conservazione RNA, raccolta della secrezione tumorale e fissazione tissutale. Questo lavoro illustra anche la raccolta chirurgica e l'elaborazione del fluido cerebrospinale umano (CSF) e della periliazione durante la resezione transcirculinata VS, in quanto questi tessuti strettamente correlati possono servire come fonti importanti di biomarcatori per VS. Infine, questo protocollo presenta passi per la trasduzione virale delle cellule VS umane primarie nella coltura come nuova applicazione di questo tessuto per l'uso nella terapia genica.

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Protocollo

Il consenso informato scritto per la raccolta di tutti i campioni è stato ottenuto prima dell'intervento e gli esperimenti sono stati eseguiti secondo il Codice Etico dell'Associazione Medica Mondiale (Dichiarazione di Helsinki). Tutte le sezioni del protocollo di studio sono state approvate dal consiglio di revisione istituzionale del Massachusetts Eye e Ear e Massachusetts General Hospital.

NOTA: Le sezioni 1-7 qui di seguito sono progettate per essere eseguite in sequenza sulla ricezione di un campione primario umano VS o GAN dalla sala operatoria. L'elaborazione dovrebbe iniziare sempre con la sezione 1. Quindi, in linea di principio, l'RNA deve essere conservata prima (sezione 2), seguita dalla preparazione del tessuto per la raccolta delle secrezioni (sezione 3) e l'estrazione delle proteine ​​(sezione 4). Il tessuto da coltivare (sezione 5 per VS, sezione 6 per GAN) può essere posizionato in mezzo di coltura integrato, mentre le sezioni 2, 3 e 4 vengono eseguite. La fissazione del tessuto per la sezione (sezione 7) è molto breve e cSia eseguito durante qualsiasi fase di centrifugazione. La sezione 8 (elaborazione di periferia) e la sezione 9 (elaborazione del CSF) possono essere eseguiti al momento della ricezione di perilymph o CSF ​​dalla sala operatoria durante una resezione VS translabellina. La sezione 10 (trasduzione virale) può essere eseguita sulle cellule VS o Schwann in crescita nella cultura.

1. Preparazione e ricezione di un campione chirurgico

NOTA: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in un ambiente sterile, ad esempio un cappuccio per la cultura tissutale o un cappuccio di flusso laminare. Si prevede la conoscenza della tecnica base sterile.

  1. Preparazione del mezzo per la coltura cellulare primaria umana VS o Schwann
    1. Sciogliere una aliquota di 50 ml di sangue fetale congelato secco (FBS) in un bagno d'acqua di 37 ° C.
    2. Aggiungere 5 ml di miscela di penicillina / streptomicina a una bottiglia da 500 mL di DMEM / F-12, con una diluizione finale di 1: 100.
    3. Aggiungere i 50 mL di FBS scongelati alla bottiglia da 500 mL di DMEM / F-12,Con conseguente diluizione finale di 1:10.
    4. Scrivere sulla bottiglia la data, le iniziali del ricercatore e le informazioni supplementari ( ad esempio, 1% P / S, 10% FBS).
    5. Inserire il nuovo mezzo di coltura in frigorifero (4 ° C).
  2. Ricezione e pulizia del campione VS o GAN
    1. Nella sala operatoria, posizionare il campione VS o GAN appena raccolto in salina sterile in un contenitore di campioni. Trasportare il campione sul ghiaccio dalla sala operatoria ad un cappuccio flusso laminare in laboratorio.
      NOTA: Le dimensioni e i pesi dei campioni variano in modo significativo tra i pazienti in base alla dimensione del tumore rilevante o alla quantità di nervo esaurito.
    2. Togliere le aliquote della soluzione stock-solution di ialuronidasi (25.000 U / mL) e collagenasi (3200 U / mL) dal congelatore e lasciare che gli enzimi scongelano a temperatura ambiente (necessaria per il passaggio 5.1.4 o 6.1.6, a seconda che il campione sia Un VS o un GAN).
      NOTA: la resuspensione degli enzimi liofilizzati iS descritta in dettaglio sulle schede informative sul prodotto. La collagenasi può essere risospesa in qualsiasi soluzione salina equilibrata libera da calcio e in ialuronidasi in una soluzione di 0,02 M tampone fosfato (pH 7,0), 77 mM NaCl e allo 0,01% di 1 mg / ml di albumina di siero bovino. L'attività specifica per ciascun enzima liofilizzato varia con il lotto e deve essere verificata prima della resuspensione.
    3. Usando una serie di tre tubi da 1,5 ml riempiti di 1,4 ml di 1x PBS sterile, lavare il campione VS o GAN tre volte. Trasferire con cautela il campione da tubo al tubo con pinze sterili. Chiudere ogni tubo una volta che contiene il campione e agitare dolcemente per lavare.
      NOTA: Per evitare l'inondazione dei tubi da 1,5 ml, è possibile utilizzare meno di 1,4 ml di PBS per tubo se il pezzo del tumore è grande.
    4. Mettere il campione in un piatto a secco 60 mm di Petri e utilizzare pinze per rimuovere tutti i tessuti morti ( cioè porzioni cauterizzate, di solito bianche o opache a colori) e aree con vasi sanguigni prominenti.
    5. Usare fOrceps o una lama di bisturi per dividere il campione in pezzi separati per la conservazione dell'RNA, l'estrazione di proteine, la raccolta delle secrezioni, la fissazione e la coltura cellulare (vedere paragrafi 2 - 6).
    6. Trasferire il pezzo del campione indicato per la coltura delle cellule (sezione 5/6) in un nuovo piatto di coltura da 60 mm contenente 5-8 ml di mezzo freddo DMEM / F-12 integrato (in alternativa, il coperchio del primo piatto di coltura può essere Utilizzato per questo passaggio).
      NOTA: La quantità di mezzo DMEM / F-12 necessario (a partire dal punto 1.1) dipenderà dalla dimensione del tumore o dal nervo, ma dovrebbe diminuire tra 5 e 8 ml. Questo pezzo può sedere nel mezzo di coltura mentre vengono eseguiti i passaggi successivi.

2. RNA Conservazione del tessuto VS e GAN (valido anche per l'epitelio sensoriale umano)

  1. Sotto la cappa a flusso laminare, trasferire 1-1,2 ml di soluzione di stabilizzazione RNA a un nuovo tubo da 1,5 ml.
  2. Dopo aver lavato il campione con PBS (punto 1.2.3), infilare brevemente la piccola tortaCe di tessuto designato per la conservazione dell'RNA (circa 3 mm 3 di VS o una lunghezza di 5 mm di GAN) nella soluzione di stabilizzazione dell'RNA. Assicurarsi che il campione sia completamente immerso nella soluzione.
  3. Preparare ed etichettare un nuovo tubo da 1,5 ml. Recuperare il campione dalla soluzione di stabilizzazione RNA, trasferirlo al nuovo tubo e memorizzarlo in un congelatore -80 ° C.

3. Raccolta delle segrezioni VS e GAN

  1. Giorno 1
    1. Dopo aver lavato il campione con PBS (punto 1.2.3), posizionare il pezzo di VS o GAN designato per la raccolta delle secrezioni in un tubo vuoto da 1,5 ml.
    2. Preparare due ulteriori tubi da 1,5 ml e pipettare 500 μl di DMEM (non integrato con FBS) in ogni tubo.
      NOTA: Il primo tubo di DMEM verrà utilizzato per raccogliere le secrezioni tumorali e il secondo tubo di DMEM servirà come un controllo accoppiato. Le secrezioni possono essere raccolte in DMEM, qualsiasi altro mezzo di coltura tipico nonIntegrato con siero o PBS.
    3. Mettere uno dei tubi contenenti DMEM su una scala digitale calibrata. Tare la bilancia, in modo tale che quando il tubo si siede in cima alla scala, legge 0 mg.
    4. Rimuovere il tubo di DMEM dalla scala, posizionare il pezzo di campione indicato per la raccolta delle secrezioni nel tubo e pesarlo. Si noti il ​​risultato, che rappresenterà il peso del tessuto da solo.
    5. Sotto un cappuccio di flusso laminare, regolare il volume di DMEM nel tubo a 100 μL per 10 mg di campione.
    6. Posizionare il tubo contenente il campione di tessuto e il suo controllo corrispondente (solo DMEM) nell'incubatrice (37 ° C, 5% CO 2 ) per un periodo coerente con i piani per questo esperimento. Incubare il tessuto per almeno 72 h per raccogliere quantità biologicamente utili di secrezioni tumorali o nervose 15 .
  2. Giorno 4
    1. Dopo l'incubazione per 72 h, rimuovere il mezzo contenente la secrezione dalCampione ( vale a dire, media mediamente tessuto) usando una pipetta da 1 ml. Per evitare cicli di congelamento e disgelo ripetuti, aliquotare il mezzo in nuovi tubi secondo le analisi a valle pianificate (per esempio, per eseguire un ELISA con 4 pozzetti che richiedono 50 μL ciascuno, possono essere preparate aliquote di 210 μL).
    2. Se necessario, congelare il pezzo di tessuto rimasto nel tubo originale (già etichettato il giorno 1) a -80 ° C per ulteriori analisi, come l'estrazione del DNA, in una data successiva.
    3. Conservare il tessuto, le secrezioni e il controllo DMEM in un congelatore da -80 ° C fino a quando le applicazioni a valle non vengono avviate ( es. ELISA, LC-MS / MS, matrici di citochine, ecc .).

4. Estrazione di proteine ​​da tessuto VS o GAN

  1. Preparazione del tampone RIPA fortificato
    1. Aggiungere una compressa di inibitore della fosfatasi e una compressa di inibitori della proteasi a 10 mL di tampone RIPA in un tubo da 15 mL; Questo è fortificatoBuffer RIPA.
      NOTA: conservare il tampone RIPA a 4 ° C e aggiungere le compresse appena prima dell'uso.
  2. Estrazione della proteina
    1. Trasferire 210 μL di tampone RIPA fortificato (punto 4.1.1) in un nuovo tubo da 1,5 mL.
    2. Dopo aver lavato il campione con PBS (punto 1.2.3), trasferire il piccolo pezzo di tessuto designato per l'estrazione proteica (circa 3 mm 3 di VS o una lunghezza di 5 mm di GAN) al tubo contenente tampone RIPA e metterlo su ghiaccio Per almeno 10 min. Se studiando forme fosforilate di proteine, aggiungere il tampone RIPA con inibitori della proteasi e della fosfatasi 14 . Nel frattempo, i passi per altri componenti della lavorazione del tessuto, come la fissazione (sezione 7), possono essere eseguiti.
    3. Pre-raffreddare la centrifuga a 4 ° C.
    4. Utilizzando un pestello di plastica, omogeneizzare il tessuto nel tubo contenente tampone RIPA. Sonicare il tessuto per 10-15 s con ampiezza del 20%. Assicurarsi che il campioneRimane sul ghiaccio, anche durante la sonicazione.
    5. Centrifugare per 10 minuti a 15.000 xg e 4 ° C.
    6. Aliquota il supernatante in incrementi di 50 μL in nuovi tubi da 0.5 mL (a seconda delle applicazioni a valle desiderate, è possibile scegliere qualsiasi dimensione di incremento).
    7. Conservare le aliquote di proteina lisata in un congelatore da -80 ° C fino a quando le applicazioni a valle non vengono avviate ( es. ELISA o blots occidentali) 20 , 21 .

5. Cultura primaria di VS umana

  1. Giorno 1
    1. Separare il tessuto VS indicato per la coltura cellulare (che è stato seduto nel supporto di coltura, come descritto al punto 1.2.6) in circa 1 mm 3 pezzi utilizzando una coppia di pinze in ogni mano.
    2. Aspirare il mezzo contenente il tumore con una pipetta da 10 ml di siero e trasferire tutto il contenuto in un tubo conico da 15 ml.
    3. Centrifugare per 3 minuti a1.000 xg e 25 ° C.
    4. Preparare il terreno di disintegrazione in un nuovo piatto di coltura da 60 mm combinando 4,7 ml di supposto DMEM / F-12 con 250 μl di collagenasi (concentrazione finale: 160 U / ml) e 50 μL di ialuronidasi (concentrazione finale: 250 U / ml) , Per un volume finale di 5 ml.
      NOTA: Entrambi gli enzimi devono essere conservati in un congelatore da -20 ° C ma scongelati prima della preparazione di questo supporto (punto 1.2.2).
    5. Dopo la centrifugazione, i pezzi del tumore formano un pellet nella parte inferiore del tubo conico. Pipettare con attenzione e scartare il surnatante.
    6. Aggiungere 2 ml del mezzo di disintegrazione contenente enzimi freschi (fase 5.1.4) al pellet tumorale. Pipette su e giù diverse volte per mobilitare il tessuto e trasferire il tumore contenente il mezzo al piatto di coltura da 60 mm.
    7. Posizionare il piatto di coltura nell'incubatore (37 ° C, 5% CO 2 ) per 18 h.
  2. Giorno 2
    1. Caldo DMEM / F-12, integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina (preparato al punto 1.1) in un bagno d'acqua di 37 ° C.
    2. Rimuovere il piatto di Petri contenente la coltura VS dall'incubatrice (passo 5.1.7). Usando un ago da 22 G attaccato ad una siringa da 6 ml, aspirare il mezzo contenente la coltura e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 15 ml.
    3. Centrifugare per 5 min a 1.000 xg e 37 ° C.
    4. Nel frattempo, utilizzare pinze sterili per inserire il numero di copertine di vetro in poli-D-lisina e lamina rivestiti in una piastra di coltura da 24 pozzetti.
      NOTA: il numero di pozzetti da coltivare dipende dalla dimensione del campione; Circa 24-32 pozzetti possono essere coltivati ​​da un tumore di 1 cm 3 , quindi per la maggior parte dei tumori più piccoli, è opportuno progettare 8-16 pozzetti di cellule colte.
    5. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante ( cioè il mezzo arricchito di enzima) e risospendere il pellet di cellule residui in mezzo fresco e complemento di DMEM / F-12, pre-caldoNel punto 5.2.1.
      NOTA: Il volume in cui risospendere il pellet è determinato dal numero di pozzetti previsti nella fase 5.2.4, stimando 1 ml di mezzo per pozzetto previsto.
    6. Aspirare 2 ml del mezzo di cellule risospese (fase 5.2.5) usando una pipetta da 5 ml. Depositare 1 ml del mezzo contenente la cellula tumorale in ogni pozzetto preparato della piastra a 24 pozzetti.
    7. Continuare l'aspirazione e il deposito di terreno contenente cellule tumorali (aspirazione in incrementi di 2 mL, da cui 1 mL viene depositato in ogni pozzetto previsto) fino a quando la sospensione della cellula tumorale è equamente suddivisa tra tutti i pozzetti preparati.
    8. Posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore a 37 ° C durante la notte.
  3. Giorno 3
    1. Se sul fondo dei pozzetti sono notati detriti significativi, cambiare attentamente il mezzo in ciascun pozzetto nel nuovo supporto di coltura DMEM / F-12 integrato, facendo attenzione a non dispiegare le cellule aderenti. In caso contrario, riportare la piastra all'incubatore e cambiare la tE per la prima volta il 5 ° giorno.
  4. Giorni 5-7 e successivamente
    1. Cambiare il supporto ogni 3 giorni.
      NOTA: Le cellule VS e GAN umane primarie sono generalmente mantenute in coltura fino al loro utilizzo nelle applicazioni a valle, a circa 14 giorni di età. La purezza della cultura diminuisce dopo questo 19 .

6. Cultura primaria di GAN umana

  1. Giorno 1
    1. Sotto un microscopio di dissezione, isolare i fascicoli dal tessuto designato per la cultura GAN (che è stata seduta in terreno di coltura, come descritto nel punto 1.2.6).
      1. Isolare i fascicoli dall'epineurium e dalla guaina fibrosa tirando sul perineuro usando no. 5 pinze mentre si aggrappa l'epineurium con no. 3 pinze.
    2. Una volta che i fascicoli sono sufficientemente isolati dall'epineurio circostante, trasferirli in un nuovo piatto di coltura contenente 2 ml di supMedio.
    3. Tagliare i fascicoli in segmenti da 1 a 2 mm utilizzando la lama del bisturi.
    4. Pipettate i piccoli pezzi di fascia e il mezzo circostante in un tubo da 15 ml contenente 3 ml di terreno di coltura fresco supplementare, in modo tale che il volume totale nel tubo da 15 ml diventa 5 ml.
    5. Centrifugare il campione per 3 minuti a 1.000 xg e 25 ° C.
    6. Nel frattempo, creare un mezzo di coltura di cellule Schwann in un nuovo piatto da 60 mm di Petri combinando 4,7 ml di supposto DMEM / F-12, 250 μl di collagenasi e 50 μL di ialuronidasi, per un volume finale di 5 ml.
      NOTA: conservare entrambi gli enzimi a -20 ° C; Scongelarli a temperatura ambiente prima di preparare questo mezzo (punto 1.2.2).
    7. Dopo la centrifugazione del campione, i fascicoli si condenseranno in un piccolo pallone nel tubo conico. Scartare il surnatante.
    8. Aggiungere 2 ml del mezzo di disintegrazione contenente enzimi freschi (fase 6.1.6) al pellet nervoso. Pipetta e dPossiedono diverse volte per mobilitare il tessuto e trasferirlo in un nuovo piatto di coltura da 60 mm.
    9. Portare il piatto nell'incubatrice (37 ° C, 5% CO 2 ) per 20-22 h.
      NOTA: questa è un'incubazione più lunga di quella necessaria per i campioni VS (passo 5.1.7).
  2. Giorno 2
    1. Supporto caldo DMEM / F-12 in un bagno d'acqua di 37 ° C.
    2. Usando un ago da 22 G attaccato ad una siringa da 6 ml, aspirare il mezzo contenente la coltura cellulare e trasferirlo in un nuovo tubo conico da 15 ml.
    3. Centrifugare per 5 min a 1.000 xg e 37 ° C.
    4. Scartare il surnatante e risospendere il campione in un nuovo mezzo di coltura DMEM / F-12 integrato, pre-riscaldato.
    5. Utilizzare pinze sterili per inserire il numero di copertine rivestite nel pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti.
      NOTA: il calcolo di due pozzetti di cellule colte per un campione di nervo da 1 cm promuove una crescita culturale robusta.
    6. Aggiungere 1 ml del mezzo contenente la coltura a ciascunoBen indicato nella piastra a 24 pozzetti.
    7. Posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 .
  3. Giorno 3
    1. Se i pozzetti sono rilevati nei pozzetti, sostituire attentamente il mezzo con un nuovo supporto di coltura DMEM / F-12, facendo attenzione a non dispiegare le cellule aderenti. In caso contrario, riportare la piastra all'incubatore e cambiare il mezzo per la prima volta il giorno 5.
  4. Giorni 5-7 e successivamente
    1. Cambiare il supporto ogni 3 giorni.

7. Fissazione del tessuto VS & GAN

  1. Pipettare 1-1,2 ml di 4% di paraformaldeide (PFA, ATTENZIONE) in un nuovo tubo da 1,5 ml.
  2. Dopo aver lavato il tumore o il nervo con PBS (punto 1.2.3), trasferire un piccolo pezzo di tessuto (circa 3 mm 3 di VS o una lunghezza di 5 mm di GAN) in 4% PFA e mettere il tubo su un agitatore a 4 ° C. Assicurarsi che il campione sia completamente immerso in tLui soluzione.
  3. Dopo almeno 2 ore di fissazione, prelevare il tubo dallo scuotitore e procedere con ulteriore lavorazione ( ad es. Incorporazione in paraffina o composto ottimale della temperatura di taglio (OCT) per la successiva immunohistochemistry o immunofluorescenza) 22 , 23 , 24 . In alternativa, il tessuto può essere congelato, come descritto in precedenza 25 , 26 .

8. Raccolta e conservazione della perilemia umana durante la resezione VS Translabyrinthine

  1. Collocare tre tubi sterili da 1,5 ml sul ghiaccio.
    NOTA: Un tubo sarà conservato come sostegno in caso di contaminazione.
  2. Riempire un tubo da 1,5 ml con circa 1,2 ml di soluzione PBS che è stato filtrato due volte utilizzando un filtro da 0,22 μm.
    NOTA: per raccogliere perilymph durante una resezione VS translabellina, il chirurgo deve prima assicurare che il surgiIl campo di calcio è privo di polvere ossea, sangue o salina. Il chirurgo può utilizzare un tubo di aspirazione Schuknecht 21 o 24 G nella mano non dominante per questo scopo.
    Un luogo tipico da cui estrarre perilymph è il canale semicircolare laterale (tuttavia, è possibile accedere anche al canale semicircolare posteriore oa una finestra rotonda, a seconda della preferenza del chirurgo). Il chirurgo deve rimuovere accuratamente l'osso labirintico con un burbero diamantato (utilizzando l'irrigazione continua di aspirazione) per identificare la linea blu ( cioè il labirinto membrano) del canale semicircolare. Il canale semicircolare viene penetrato attraverso la linea blu usando un ago lungo 27 G attaccato ad una siringa tubercolina da 1 ml.
  3. Chiedere al chirurgo di aspirare delicatamente una piccola quantità di perilymph e poi passare la siringa e l'ago allegato all'infermiera chirurgica.
    NOTA: In genere, viene raccolta una goccia di perilymph o meno. Se il volume osservato è maggiore, il campione è probabilmente contaminato con altri fLUID.
  4. Aprire il tubo di 1,5 ml preparato e il tubo riempito con PBS direttamente prima dell'uso. Fare attenzione a non toccare l'interno dei coperchi del tubo durante l'apertura.
  5. Ricevere la siringa e l'ago collegato dall'infermiera chirurgica e spazzare completamente il fluido nel tubo vuoto, facendo attenzione a non toccare il tubo stesso con l'ago.
  6. Staccare con cura l'ago dalla siringa. Non contaminare la punta dell'ago e continuare a tenerla in una sola mano.
    NOTA: È stato raccolto un piccolo volume di perilemia, per cui alcuni liquidi possono rimanere nella punta lunga dell'ago.
  7. Con l'altro, utilizzare la siringa stessa (senza ago) per succhiare 0,2 mL di soluzione filtrata PBS dal tubo preparato nel corpo della siringa.
  8. Ricollegare l'ago alla siringa. Completa l'evacuazione della siringa nel tubo contenente perilymph, utilizzando il PBS sterile per sciacquare la punta dell'ago.
  9. Chiudere il tubo contenente perilymph e PBS Su ghiaccio.
  10. Smaltire l'ago in un contenitore di scalpelli.
  11. Posizionare il tubo contenente perilymph nel congelatore -80 ° C il più presto possibile.

9. Raccolta e conservazione del CSF umano

  1. Posizionare tre (o più) tubi sterili da 1,5 ml sul ghiaccio.
    NOTA: Un tubo sarà un backup in caso di contaminazione o un volume di campione che è più grande del previsto.
  2. Dopo aver aperto il duro mater, chiedere al chirurgo di raccogliere CSF con una siringa da 3 ml (senza ago attaccato).
    NOTA: Per evitare la contaminazione, la raccolta CSF dovrebbe avvenire immediatamente dopo l'apertura del dura mater.
  3. Chiedere al chirurgo di consegnare la siringa all'infermiera chirurgica.
  4. Ricevere la siringa dall'infermiera chirurgica e completamente evacuare il volume richiesto di CSF nel tubo.
  5. Chiudere i tubi e posizionarli sul ghiaccio.
  6. Posizionare il tubo (i) nel congelatore -80 ° C il più presto possibile.
E "> 10. Esperimenti di trasduzione virale per le cellule VS primarie

  1. Utilizzando la concentrazione delle concentrazioni virali come riferimento, calcolare il numero di conteggio del genoma desiderato (gc) e la molteplicità di infezione (MOI) necessari per l'esperimento proposto di trasduzione; Lo stock di virus può essere diluito direttamente nel mezzo di coltura integrato.
    NOTA: può essere utilizzato qualsiasi vettore virale adatto alla trasduzione cellulare primaria; Vedere Landegger et al. (2017) per un confronto dettagliato di sei diversi serotipi virus adeno-associati 27 . Inoltre, quando si coltivano le cellule umane primarie, i conteggi di cellule non vengono tipicamente determinati prima di plasmare su copertine. Le cellule VS primarie non rispondono bene alla tripsinizzazione e al passaggio, quindi per un calcolo affidabile MOI, il numero di cellule aderenti per pozzo può essere stimato utilizzando un microscopio a contrasto di fase. In alternativa, se le cellule sono vicine alla confluenza, i loro numeri possono essere stimati in modo affidabile utilizzando i valori standard di densità delle cellule perUna piastra a 24 pozzetti ( ad esempio, 5 x 10 4 cellule per pozzetto).
  2. Sotto un cappuccio di flusso laminare, preparare il supporto integrato contenente la quantità desiderata di virus in un tubo di laboratorio conico da 15 ml, in modo tale che 1 ml di mezzo contenente virus venga preparato per ciascun pozzetto delle cellule da trasduzione. Pipettare il mezzo contenente virus in su e in basso per mescolare delicatamente ma completamente.
  3. Utilizzando pinze sterili, trasferire le copertine contenenti le cellule VS primarie (passo 5.2.8) dalla piastra originale a 24 pozzetti a una nuova piastra a 24 pozzetti. Dopo il trasferimento di ciascuna copertina individuale, aggiungere 1 ml di mezzo contenente virus. Girare la piastra ogni volta che si aggiunge un mezzo per assicurare che le cellule siano uniformemente rivestite con il virus.
  4. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per la durata dell'esperimento previsto.
    NOTA: le incubazioni che vanno da 48 a 120 h hanno mostrato risultati promettenti di trasduzione 27 .

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Risultati

Le cellule VS umane primarie nella cultura, come stabilito nella sezione 5, possono essere trattate come modelli informativi per i processi associati alle malattie in molte applicazioni di ricerca a valle ( Figura 1 ). Le cellule Schwann sane coltivate nella sezione 6 forniscono un punto di confronto diretto e istruttivo. Come descritto di seguito, i dati estesi dei VS e dei GAN elaborati in base a questo quadro metodologico unificato sono disponibili in più...

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Discussione

Questo manoscritto descrive un quadro metodologico unificato per la ricerca VS, che descrive la lavorazione simultanea di esemplari di VS e GAN umani per applicazioni di ricerca a valle. Poiché la ricerca VS entra nell'epoca della medicina di precisione, preparando lo stesso campione in forme in grado di rispondere a numerose domande di ricerca, consentirà la scoperta di visioni molecolari, cellulari, genetiche e proteomiche specifiche per singoli pazienti.

La purezza della cellula umana...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Nazionale di Sordità e altri Disturbi della Comunicazione con sovvenzioni R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (sostenendo JES e SD), il Dipartimento della Difesa concede la W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fondazione Bertarelli (KMS) , La Fondazione di Nancy Sayles Day (KMS), il Centro di ricerca del tinnito di Lauer (KMS) e la Fondazione Barnes (KMS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BioCoat Poly-D-Lisina/Laminin 12 mm #1 Vetrino coprioggetti tedescoCorning354087Oppure preparare i vetrini coprioggetti con Corning Laminin (CB-40232) e Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 mL Provette per centrifuga, fondo conico, graduazione, sterileGreiner Bio-One188161
CELLSTAR 50 mL Provette per centrifuga, fondo conico, graduazione, sterileGreiner Bio-One227261
Piatto per colture cellulari CELLSTAR, 60 mmGreiner Bio-One628160
Collagenasi da Clostridium histolyticum, filtrato sterileSigma-AldrichC1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Well Pool Plates, sterileCorning3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM, glicemia alta, piruvato, senza glutammina, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12, 500 mLThermo Fisher Scientific11320-033
Dumont #3 Pinze, DumoxelFine Science Tools11231-30Autoclave prima dell'uso
Dumont #5 Pinze, punta standard, InoxFine Science Tools11251-20Autoclave prima dell'uso
Siero fetale bovino, qualificato, regioni approvate dall'USDA, 500 ml ThermoFisher Scientific10437-028Aliquotare in provette da 50 ml e conservare in -20 gradi C congelatore
Ialuronidasi da testicoli bovini, tipo I-S, polvere liofilizzataSigma-AldrichH3506
Millex-GP siringa unità filtro, 0,22 e micro; m, polietersulfone, 33 mm, sterileEMD MilliporeSLGP033RS
Paraformaldeide, grado di reagente, cristallinoSigma-AldrichP6148Prima dell'uso: Stabilire procedure operative standard basate sui protocolli disponibili online
PBS, pH 7,4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023prima dell'uso
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL), 100 mLThermo Fisher Scientific15140-122
Compresse di inibitori della fosfatasi PhosSTOPRoche04906845001
Pierce Compresse di inibitori della proteasiThermo Fisher Scientific88666
Pipette e puntali per pipette, 5/10/25 mLPestello
da 1,5/2,0 mL E& K ScientificEK-10539
Aghi PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 inBD301629
tampone RIPABoston BioProductsBP-115
RNAlater (soluzione di stabilizzazione dell'RNA)Thermo Fisher ScientificAM7021
Provette per microcentrifuga Safe-Lock, polipropilene, 0,5 mLEppendorf022363719 Autoclave prima dell'uso
Provette per microcentrifuga Safe-Lock, polipropilene, 1,5 mLAutoclave Eppendorf022363204prima dell'uso
Soluzione salina - Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, batteriostatica, 20 mLHospira0409-1966-05
Lame per bisturi - #15Fine Science Tools10015-00
Tubo di aspirazione Schuknecht calibro 24Bausch + LombN1698 42Utile per l'approccio chirurgico (in aggiunta ai comuni strumenti chirurgici otologici) e ad es un marcatore chirurgico blu
Contenitore per campioni, OR sterile, 4OZMedlineDYND30331H
Stereomicroscopio Stemi 2000-CZeiss000000-1106-133
Combinazione siringa/ago, punta Luer-Lok, 5 mL, 22 G x 1 in.BD309630
Solo siringa per tubercolina, punta a scorrimento, 1 mL309659
solo siringa per tubercolina, punta a scorrimento, 3 mLBD309656
Omogeneizzatore a ultrasuoni, serie 4710, sonda CV18Cole-ParmerCP25013
Autoclave per omogeneizzazione in plastica variabile variabile

Riferimenti

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