La polvere di bambù è stata pretrattata con NaOH e idrolizzata enzimaticamente. L'idrolizzato di bambù è stato utilizzato come materia prima per la produzione di 2,3-butanediol, R -acetato, acido 2-ketogluconico e acido xilonico da Klebsiella pneumoniae .
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Articolo metodologico
Produzione di sostanze chimiche da parte di
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il bambù è una biomassa importante e l'idrolizzato di bambù viene utilizzato da Klebsiella pneumoniae come materia prima per la produzione chimica. Qui, la polvere di bambù è stata pretrattata con NaOH e lavata ad un pH neutro. Cellulasi è stata aggiunta alla polvere di bambù pretrattata per generare l'idrolizzato, che conteneva 30 g / L di glucosio e 15 g / l di xilosi ed è stato utilizzato come fonte di carbonio per preparare un mezzo per la produzione chimica. Durante la coltura in condizioni microaerobiche, 12,7 g / l di 2,3-butandiolo è stato prodotto dalla selvaggina K. pneumoniae . In condizioni aerobiche, 13,0 g / L di R- acetone è stato prodotto dal mutante budC di K. pneumoniae . Una miscela di acido 25,5 g / l di 2-ketogluconico e 13,6 g / l di acido xilonico è stata prodotta dal mutante budA di K. pneumoniae in una fermentazione a due stadi a pH controllata con elevata supplementazione d'aria. Nella prima fase della fermentazione, la coltura è stata mantenuta ad un pH neutro; Dopo la crescita cellulare, la fermentazioneN ha proceduto alla seconda fase, durante la quale la cultura è stata permessa di diventare acida.
Introduzione
Klebsiella pneumoniae è un batterio che cresce bene sia in condizioni aerobiche sia anaerobiche. K. pneumoniae è un importante microrganismo industriale utilizzato per produrre molte sostanze chimiche. 1,3-propandiolo è una preziosa sostanza chimica che viene utilizzata principalmente come monomero per sintetizzare polytrimetilene tereftalato. Polytrimetilene tereftalato è un poliestere biodegradabile che presenta proprietà migliori di quelle di 1,2-propandiolo, butanediolo o etilene glicole 1 . 1,3-propandiolo è prodotto da K. pneumoniae utilizzando glicerolo come substrato nelle condizioni limitate all'ossigeno 2 . 2,3-butanediol e suoi derivati hanno applicazioni nel settore della plastica, della produzione di solventi e della gomma sintetica e hanno il potenziale per essere utilizzati come biocarburanti 3 . Con il glucosio come substrato, il 2,3-butanediolo è il principale metabolita del ceppo 4 selvatico. 2,3-butandiolo è sintetizzatoDal piruvato. Innanzitutto, due molecole di piruvato si condensano per produrre α-acetolattato; Questa reazione è catalizzata da α-acetolattato sintetasi. L'α-acetolattato viene quindi convertito in acetone mediante α-acetolattato decarbossilasi. R- acetone può essere ulteriormente ridotto a 2,3-butandiolo quando catalizzato da butanediol deidrogenasi. È stato esplorato un metodo efficace di sostituzione del gene idoneo a K. pneumoniae e sono stati costruiti molti mutanti 5 , 6 , 7 . Un mutante budC , che ha perso la sua attività di 2,3-butanediol deidrogenasi, accumula elevati livelli di acetoina nel brodo di coltura. Acetoina viene utilizzato come additivo per migliorare il sapore del cibo 8 . Quando budA , che codifica α-acetolattato decarbossilasi, viene mutato, l'acido 2-ketogluconico si accumula nel brodo. L'acido 2-ketogluconico viene usato per la sintesi dell'acido eritorbico (acido isoascorbico), Un antiossidante utilizzato nell'industria alimentare 9 . L'acido 2-ketogluconico è un intermedio del percorso di ossidazione del glucosio; In questo percorso, localizzato nello spazio periplasmatico, il glucosio viene ossidato all'acido gluconico e successivamente ossidato all'acido 2-ketogluconico. L'acido gluconico e l'acido 2-ketogluconico prodotto nel periplasma possono essere trasportati al citoplasma per ulteriori metabolismo. L'accumulo di acido 2-ketogluconico dipende da condizioni acide e un'ulteriore integrazione dell'aria favorisce la produzione di acido 2-ketogluconico 10 . La deidrogenasi di gluconato, codificata da gad , Catalizza la conversione dell'acido gluconico nell'acido 2-ketolguconico. Il mutante di K. pneumoniae produsse alti livelli di acido gluconico anziché acido 2-ketogluconico, e questo processo dipende anche da condizioni acide. L'acido gluconico è un acido organico sfuso e viene utilizzato come additivo per aumentare le proprietà del cemento 11. L'ossidazione del glucosio all'acido gluconico è catalizzata dalla glucosio deidrogenasi. Xilosi è anche un substrato appropriato di glucosio deidrogenasi. Quando xilosi viene utilizzato come substrato, K. pneumoniae produce acido xilonico 12 .
La produzione chimica che utilizza biomassa come materia prima è un argomento caldo in biotecnologia 13 . Le principali componenti della biomassa sono la cellulosa, l'emicellulosa e la lignina. Tuttavia, questi composti macromolecolari non possono essere catabolizzati direttamente dalla maggior parte dei microrganismi (inclusi K. pneumoniae ). La cellulosa e le emicellulosi nella biomassa devono essere idrolizzate a glucosio e xilosio e possono quindi essere utilizzate dai microrganismi. La presenza di lignina nelle lignocellulose crea una barriera protettiva che impedisce l'idrolizzazione della biomassa da parte degli enzimi. Pertanto, un processo di pretrattamento che elimina lignina e emicellulosi e riduce la cristallinità della cellulosa viene sempre effettuato durante l'utilizzo della biomassa tramite microorganisms. Sono stati sviluppati molti metodi di pretrattamento: acidi, alcalini, ammoniaca e pretratti di vapore sono comuni.
Il bambù è abbondante nelle regioni tropicali e subtropicali ed è un'importante risorsa di biomassa. Qui viene presentata la preparazione di idrolizzato di bambù e produzione chimica mediante idrolisi di bambù
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Protocollo
1. Preparazione dell'idrolizato di bambù
- Aggiungere 5 g di polvere di bambù a 40 ml di una soluzione di NaOH per ottenere una concentrazione finale del 10% (g / g) in un pallone da 250 ml. Utilizzare una serie di soluzioni NaOH che vanno da 0,05 M a 0,50 M in incrementi di 0,05 M.
- Incubare la miscela per 60 min a 60 ° C o 100 ° C in un bagno d'acqua. Incubare a 121 ° C in un autoclave.
- Dopo l'incubazione, lasciare la miscela per rimanere per 4 ore a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere il surnatante. Aggiungere 100 ml di acqua dolce e mescolare.
- Ripetere questo lavaggio 5-6 volte, finché il pH del supernatante non raggiunge il 6,8. Utilizzare il solido ottenuto per la prossima fase di idrolisi enzimatica.
- Per l'idrolisi, regolare 50 ml della miscela sopra al pH 5,0 utilizzando 98% di H 2 SO 4 . Quindi aggiungere 0,5 mL di 200 attività di carta filtrante (FPU) / mL cellulasi.
NOTA: Il rapporto finale di cellulosa a bambù shDovrebbero essere 20 FPU per 1 g di bambù. - Incubare la miscela a 50 ° C per 36 h in un agitatore.
NOTA: Dopo l'idrolisi, un certo solido rimarrà nella miscela. - Ottenere un idrolizzato chiaro centrifugando a 7.690 xg per 5 min.
- Quantificare il glucosio, la xilosa e altre sostanze chimiche con un sistema di cromatografia liquido ad alta pressione dotato di un rivelatore di indice di rifrazione e di un rivelatore di matrici a fotodiodo. Utilizzare una colonna HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) e una fase mobile di 5 mM H 2 SO 4 con una portata di 0,8 mL / min 12 .
- Per un grande volume di preparazione di idrolisi, mescolare 2 kg di polvere di bambù e 18 L di 0,25 M NaOH in un serbatoio in acciaio inox da 30 L.
- Incubare il serbatoio a 121 ° C in un autoclave per 60 min. Dopo l'incubazione, lavare la miscela con 40 L di acqua in un serbatoio di plastica da 60 L. Ripetere questo lavaggio 5 volte.
- Utilizzare acqua per regolare il totale di bambù lavato ad un volume di 20 L.Regolare il pH della miscela a 5,0 usando 98% di H 2 SO 4 .
- Idrolizza enzimaticamente la miscela in un bagno ad acqua di scossa modificata, dotato di un agitatore meccanico per assicurare che la miscela sia ben distribuita. Aggiungere 200 mL di 200 FPU / mL cellulasi e incubare la miscela a 50 ° C per 36 ore.
- Dopo l'idrolisi, centrifugare la miscela a 4.700 xg per 10 min.
2. Produzione di 2,3-butanediol da Wildtype K. pneumoniae
- Utilizzare 3 l di idrolizzato di bambù come solvente per la preparazione media.
- Preparare un mezzo di fermentazione contenente 4 g / l di liquore ripieno di mais, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 6 g / LK 2 HPO 4 , 3 g / L KH 2 PO 4 e 0,2 g / L MgSO4. Regolare il pH del mezzo in neutro utilizzando 2,5 M NaOH. Utilizzare un bioreattore da 5 L contenente 3 L di fermentazione autoclavata per la fermentazione.
- Usa K. pneumoniaeCelle immagazzinate in un frigorifero a bassa temperatura a -80 ° C.
- Per la coltura del seme, incubare un pallone da 250 mL contenente 50 ml di mezzo di Luria-Bertani (LB) per una notte a 37 ° C, agitando a 200 giri / min. Usare un mezzo LB contenente 10 g / L di tryptone, estratto di lievito da 5 g / l e 10 g / litro di NaCl.
NOTA: La densità delle cellule della coltura del seme dovrebbe raggiungere OD 2 (densità ottica a 600 nm). - Inoculare una fiala di 50 ml della coltura del seme nel bioreattore. Mantenere la coltura a pH 6,0 e 37 ° C. Utilizzare una velocità di integrazione di 2 L / min e una velocità di agitazione di 250 giri / min, creando una condizione microaerobica.
- Raccogliere campioni di 5 mL ogni 2 ore durante la fermentazione e analizzarli con cromatografia liquida ad alta pressione per determinare le concentrazioni chimiche nel brodo 4 .
- Monitorare l'alcali aggiunto al bioreattore online utilizzando MFCS / DA.
NOTA: Acidi organici vengono prodotti nel processo di fermentazione, aSi aggiunge NaOH per mantenere stabile la pH della coltura. Il volume di alcali aggiunto rappresenta la quantità di acido prodotto. Quando gli alti di linea con alcali aggiunti, il processo è terminato, sia a causa dell'esaurimento della sorgente di carbonio o della morte cellulare.
- Monitorare l'alcali aggiunto al bioreattore online utilizzando MFCS / DA.
3. R- acetoin Produzione dal BudC Mutant di K. pneumoniae
- Preparare un mezzo per la produzione di acetoina contenente 4 g / l di liquore ripieno di mais, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 g / l acetato di sodio, 0,4 g / L KCl e 0,1 g / L MgSO4.
- Utilizzare K. pneumoniae-ΔbudC per la produzione di R- acetato. Ripetere i passaggi 2.4-2.5.
NOTA: BudC codifica 2,3-butandiol deidrogenasi. K. pneumoniae-ΔbudC perde l'attività di 2,3-butanediol deidrogenasi e produce R- acetone invece di 2,3-butandiolo. - Mantenere la coltura a pH 6,0 e 37 ° C. Utilizzare un tasso di integrazione dell'aria di 4 L / min e un'agitazioneN velocità di 450 giri / min, una condizione aerobica.
NOTA: L'integrazione di ossigeno è superiore a quella della produzione di 2,3-butanediol. - Assaggiare i campioni come nel punto 2.6.
4. Produzione di acido 2-Ketogluconico dal BudA Mutante di K. pneumoniae
- Per la produzione di acido 2-ketogluconico, utilizzare lo stesso supporto come per la produzione di R- acetoina.
- Utilizzare K. pneumoniae-ΔbudA per la produzione di acido 2-ketogluconico. Ripetere i passaggi 2.4-2.5.
NOTA: budA codifica α-acetolattato decarbossilasi. K. pneumoniae-ΔbudA perde l'attività di α-acetolattato decarbossilasi e produce acido 2-ketogluconico, utilizzando glucosio come substrato.
NOTA: la sintesi dell'acido 2-ketogluconico è un processo acido condizionato. È stata sviluppata una fermentazione a due stadi per la produzione di acido 2-ketogluconico 10 ; Nella prima fase la coltura del seme viene inoculata nel bioreattore. - mantenere la coltura a pH 7,0 e 37 ° C. Utilizzare una velocità di integrazione dell'aria di 4 L / min e una velocità di agitazione di 500 giri / min.
NOTA: in queste condizioni, le cellule crescono molto velocemente (la densità cellulare raggiunge OD 7 in circa 4 h). Poi la fermentazione procede alla seconda fase, durante la quale il pH della coltura diminuisce a 5,0. Non è aggiunto acido; Gli acidi organici prodotti nella coltura portano naturalmente alla diminuzione del pH. In queste condizioni acide, la crescita cellulare si ferma, ma l'acido 2-ketogluconico viene sintetizzato e si accumula nel brodo. - Assaggiare i campioni come nel punto 2.6. Uso dell'idrolizato di bambù come fonte di carbonio.
NOTA: Il glucosio nel mezzo viene convertito in acido 2-ketogluconico, e la xilosa viene convertita in acido xilonico. Così si ottiene una miscela di acido 2-ketogluconico e acido xilonico.
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Risultati
In questo protocollo, il bambù è stato pretrattato con alcali. I parametri ottimali di incubazione, una temperatura di 121 ° C e 0,25 M NaOH, sono stati determinati nelle figure 1 e 2 . Il bambù pretrattato è stato idrolizzato enzimatico e sono state misurate le concentrazioni di glucosio e xilosi ottenute nell'idrolizato. Le temperature più alte favoriscono la produzione di zucchero, quindi 121 ° C è stata scelta come temperatura ottimale. Il glucos...
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Discussione
K. pneumoniae appartiene al genere Klebsiella nella famiglia Enterobacteriaceae . K. pneumoniae è ampiamente distribuito in ambienti naturali quali il suolo, la vegetazione e l'acqua 14 . Il ceppo tipo K. pneumoniae utilizzato in questa ricerca è stato isolato dal suolo e viene utilizzato per la produzione di 1,3-propandiolo 15 . K. pneumoniae e mutanti di questa specie producono molte sostanze chimiche in condizion...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (n. 21576279, 20906076) e nel programma di iniziativa di ricerca KRIBB (KGM2211531).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| autoclave | SANYO | 3780 | |
| bioreattore | Sartorius stedim biotech | Bostat Aplus | |
| agitatore | IKA | RW 20 | |
| agitatore a bagnomaria | Zhicheng | ZWY-110X50 | |
| sistema di cromatografo liquido ad alte prestazioni | Shimadzu Corp | 20AVP | |
| centrifuga | Hitachi | CR22G III | |
| Polvere di bambù | acquistata dalla provincia di Zhejiang, Cina | numero di maglia, 50 | |
| cellulasi | Youtell Biochemical, Shandong, Cina | 200 PFU/mL |
Riferimenti
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