Vivere-cella misura di Odorant recettore attivazione mediante un'analisi di campo in tempo reale

Sommario

Che caratterizzano la funzione dei recettori odorant serve una parte indispensabile nel processo di deorphanization. Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di recettori di odorizzante in tempo reale usando un'analisi di campo.

Abstract

Le enormi dimensioni delle famiglie dei mammiferi odorant receptor (OR) presentano difficoltà per trovare loro ligandi affine fra numerosi prodotti chimici volatili. Per efficientemente ed esattamente deorphanize ORs, uniamo l'uso di una linea cellulare eterologo di esprimere dei mammiferi ORs e un plasmide biosensore geneticamente per misurare la produzione di cAMP a valle dell'attivazione di OR in tempo reale. Questa analisi può essere usata per schermo odoranti contro ORs e viceversa. Interazioni positive odorant-recettore degli schermi possono essere successivamente confermate dalla prova contro varie concentrazioni di odore, generando curve concentrazione-risposta. Qui abbiamo usato questo metodo per eseguire uno screening di alto-rendimento di un composto odoroso contro una libreria OR umana espressa in cellule Hana3A e confermato che il recettore risponde positivamente il recettore affine per il composto di interesse. Abbiamo trovato questo metodo di rilevamento ad alta velocità per essere efficiente e affidabile nel valutare l'attivazione OR e i nostri dati forniscono un esempio del suo uso potenziale negli studi funzionali OR.

Introduzione

L'odorato svolge un ruolo importante nella sopravvivenza degli animali come si basano sulla loro capacità olfattive per procurarsi il cibo, evitare i predatori e pericolo, distinguere specie e selezionare mate^1,2. La realizzazione di queste funzioni dipende i recettori odorant (ORs), che individualmente sono espressi sulla superficie ciliare dei neuroni sensoriali olfattivi (OSNs) situato nell'epitelio olfattivo (OE). RUP costituiscono la più grande famiglia della superfamiglia del recettore (GPCR) accoppiati a proteine G con circa 400 e 1200 diversi OR geni nell'uomo e topo, rispettivamente^3....

Protocollo

1. Culturing e manutenzione di celle Hana3A

1. mantenere le cellule in 10 mL di medium essenziale minimo (MEM) con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 µ g/mL di penicillina-streptomicina e 1.25 µ g/mL amfotericina B in un 100-mm piastra di coltura di cellule in un'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C con 5% CO ₂. Con ogni altro passaggio, aggiungere 1 con puromicina µ g/mL per mantenere la trasfezione stabile di plasmidi (Vedi Introduzione).
   Nota: Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono la coltura delle cellule in una cappa di sicurezza biologica di II classe per garantire ambiente sterile.
2. Sottocultura ad un....

Risultati

Muscone è il principale componente aromatico da muschio naturale. Recenti studi OR5AN1 identificato come un recettore umano per muscone e altri composti di muschio macrociclici basati su omologia con il mouse o, MOR215-1, clonato da glomeruli muscone-sensible a reagire a comportarsi topi^37,38. Per il repertorio umano OR, il nostro gruppo e il gruppo Touhara di screening anche identificati OR5AN1 come un ricevitore importante per c.......

Discussione

Misurare accuratamente l'attivazione di un OR sopra l'esposizione ad una certa odorant è il primo passo nel decifrare la codificazione delle informazioni olfattive. Gli esperimenti dimostrato in questo studio rappresentano che un esempio di come uno può identificare, mediante uno in vitro sistema di espressione OR, ORs reattivo tra il repertorio umano OR per l'industria chimica odorosa di interesse e successivamente che caratterizzano il recettore farmacologia utilizzando varie concentrazioni della sostanza chim.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Amfotericina B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
Reagente GloSensor cAMP	Promega	E1290
pGloSensor-20F plasmide cAMP	Promega	E1171
Cellule			disponibili presso gli autori su richiesta
HBSS, senza calcio o magnesio	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
M3R plasmide			clonato in un vettore di espressione di mammifero come pCI
MEM, con EBSS e L-glutammina	Hyclone	SH30024
Muscone	Santa Cruz	sc-200528
Musk tibetene	Sigma-Aldrich S359165
plasmidi			clonati con un Rho-tag in un vettore di espressione di mammifero come pCI
PBS, senza calcio o magnesio	Cellgro	21-040-CV
Penicillina-streptomicina	Hyclone	SV30010
Plasmide miniprep kit	Tiangen	DP103-03
Puromicina	Sigma	P8833
RTP1S plasmide			clonato in un vettore di espressione di mammifero come pCI
Trypsin-EDTA	Hyclone	SH30236
provetta PCR da 0,2 mL	Axygen	PCR-02-C
provetta Eppendorf da 1,5 mL	Eppendorf
15 mL provetta conica da 17 mm x 120 mm	Pipettatore	Falcon 352096
8 pozzetti e/o 12 pozzetti	Eppendorf
Piastra per coltura cellulare bianca a fondo piatto a 96 pozzetti	Greiner	655098
Piastra per coltura cellulare da 100 mm x 20 mm	Cabina di sicurezza biologica BD Falcon	353003
Classe II con flusso
laminareIncubatore per colture cellulari, con CO2
con rotore a secchiello oscillante per provette
Lettore di piastre Infinite F200	Microscopio a
con obiettivi
Spettrofotometro
Serbatoi di reagenti sterili per la distribuzione
Asciugamano

Hana3A OR multicanale BD centrifuga al 5%, coniche da 15 ml contrasto di fase Tecan x10 e x20multicanale di carta sterile