Articolo metodologico

Vivere-cella misura di Odorant recettore attivazione mediante un'analisi di campo in tempo reale

DOI:

10.3791/55831

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2 ottobre 2017

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1Department of Pathophysiology, Key Laboratory of Cell Differentiation and Apoptosis of National Ministry of Education, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 3Department of Neurobiology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center, 4Institute of Health Science, Chinese Academy of Science/Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Che caratterizzano la funzione dei recettori odorant serve una parte indispensabile nel processo di deorphanization. Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di recettori di odorizzante in tempo reale usando un'analisi di campo.

Abstract

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Le enormi dimensioni delle famiglie dei mammiferi odorant receptor (OR) presentano difficoltà per trovare loro ligandi affine fra numerosi prodotti chimici volatili. Per efficientemente ed esattamente deorphanize ORs, uniamo l'uso di una linea cellulare eterologo di esprimere dei mammiferi ORs e un plasmide biosensore geneticamente per misurare la produzione di cAMP a valle dell'attivazione di OR in tempo reale. Questa analisi può essere usata per schermo odoranti contro ORs e viceversa. Interazioni positive odorant-recettore degli schermi possono essere successivamente confermate dalla prova contro varie concentrazioni di odore, generando curve concentrazione-risposta. Qui abbiamo usato questo metodo per eseguire uno screening di alto-rendimento di un composto odoroso contro una libreria OR umana espressa in cellule Hana3A e confermato che il recettore risponde positivamente il recettore affine per il composto di interesse. Abbiamo trovato questo metodo di rilevamento ad alta velocità per essere efficiente e affidabile nel valutare l'attivazione OR e i nostri dati forniscono un esempio del suo uso potenziale negli studi funzionali OR.

Introduzione

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L'odorato svolge un ruolo importante nella sopravvivenza degli animali come si basano sulla loro capacità olfattive per procurarsi il cibo, evitare i predatori e pericolo, distinguere specie e selezionare mate1,2. La realizzazione di queste funzioni dipende i recettori odorant (ORs), che individualmente sono espressi sulla superficie ciliare dei neuroni sensoriali olfattivi (OSNs) situato nell'epitelio olfattivo (OE). RUP costituiscono la più grande famiglia della superfamiglia del recettore (GPCR) accoppiati a proteine G con circa 400 e 1200 diversi OR geni nell'uomo e topo, rispettivamente3....

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Protocollo

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1. Culturing e manutenzione di celle Hana3A

  1. mantenere le cellule in 10 mL di medium essenziale minimo (MEM) con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 µ g/mL di penicillina-streptomicina e 1.25 µ g/mL amfotericina B in un 100-mm piastra di coltura di cellule in un'incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C con 5% CO 2. Con ogni altro passaggio, aggiungere 1 con puromicina µ g/mL per mantenere la trasfezione stabile di plasmidi (Vedi Introduzione).
    Nota: Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono la coltura delle cellule in una cappa di sicurezza biologica di II classe per garantire ambiente sterile.
  2. Sottocultura ad un....

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Risultati

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Muscone è il principale componente aromatico da muschio naturale. Recenti studi OR5AN1 identificato come un recettore umano per muscone e altri composti di muschio macrociclici basati su omologia con il mouse o, MOR215-1, clonato da glomeruli muscone-sensible a reagire a comportarsi topi37,38. Per il repertorio umano OR, il nostro gruppo e il gruppo Touhara di screening anche identificati OR5AN1 come un ricevitore importante per c.......

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Discussione

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Misurare accuratamente l'attivazione di un OR sopra l'esposizione ad una certa odorant è il primo passo nel decifrare la codificazione delle informazioni olfattive. Gli esperimenti dimostrato in questo studio rappresentano che un esempio di come uno può identificare, mediante uno in vitro sistema di espressione OR, ORs reattivo tra il repertorio umano OR per l'industria chimica odorosa di interesse e successivamente che caratterizzano il recettore farmacologia utilizzando varie concentrazioni della sostanza chim.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Il lavoro è stato supportato dal Chinese National Science Foundation (31070972), scienza e tecnologia della Commissione della municipalità di Shanghai (16ZR1418300), il programma per Innovative Research Team di Shanghai Municipal Education Commission, orientale di Shanghai Programma di studioso (J50201) e il programma di ricerca di base nazionale della Cina (2012CB910401).

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Amfotericina BSigmaA2942
DMSOSigmaD2650
FBSGibco10099-141
Reagente GloSensor cAMPPromegaE1290
pGloSensor-20F plasmide cAMPPromegaE1171
Celluledisponibili presso gli autori su richiesta
HBSS, senza calcio o magnesioGIBCO14175095
HEPESHycloneSH30237
Lipofectamine2000Invitrogen11668-019
M3R plasmideclonato in un vettore di espressione di mammifero come pCI
MEM, con EBSS e L-glutamminaHycloneSH30024
MusconeSanta Cruzsc-200528
Musk tibeteneSigma-Aldrich S359165
plasmidiclonati con un Rho-tag in un vettore di espressione di mammifero come pCI
PBS, senza calcio o magnesioCellgro21-040-CV
Penicillina-streptomicinaHycloneSV30010
Plasmide miniprep kitTiangenDP103-03
PuromicinaSigmaP8833
RTP1S plasmideclonato in un vettore di espressione di mammifero come pCI
Trypsin-EDTAHycloneSH30236
provetta PCR da 0,2 mLAxygenPCR-02-C
provetta Eppendorf da 1,5 mLEppendorf
15 mL provetta conica da 17 mm x 120 mmPipettatoreFalcon 352096
8 pozzetti e/o 12 pozzettiEppendorf
Piastra per coltura cellulare bianca a fondo piatto a 96 pozzettiGreiner655098
Piastra per coltura cellulare da 100 mm x 20 mmCabina di sicurezza biologica BD Falcon353003
Classe II con flusso
laminareIncubatore per colture cellulari, con CO2
con rotore a secchiello oscillante per provette
Lettore di piastre Infinite F200Microscopio a
con obiettivi
Spettrofotometro
Serbatoi di reagenti sterili per la distribuzione
Asciugamano
Hana3A OR multicanale BD centrifuga al 5%, coniche da 15 ml contrasto di fase Tecan x10 e x20multicanale di carta sterile

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286 (5440), 704-705 (1999).
  2. Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
  3. Dryer, L., Berghard, A.

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Espressione cellulare eterologaBiosensore dell AMP ciclicoScreening ad alta efficienzaCellule Hana3AMisurazione della luminescenzaCurva di risposta alla concentrazioneRilevazione del musconeRecettore OR5AN1

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