Qui presentiamo un protocollo per descrivere sistemicamente e direttamente l'uso della neurotrofina 4 (NTF4) per rimodellare i muscoli laringei dell'invecchiamento del ratto.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Infusione sottocutanea di neurotrofina 4 usando le pompe osmotiche o l'iniezione muscolare diretta migliora i muscoli del laringe del ratto di invecchiamento
In questo articolo
Sommario
Abstract
La disfunzione della laringe negli anziani è una delle principali cause di disabilità, dai disturbi vocali alla disfagia e dalla perdita di riflessi protettivi delle vie aeree. Pochi, se esistono, esistono terapie che mirano a disfunzione muscolare laringea legata all'età. Le neurotrofine sono coinvolte nell'innervazione muscolare e nella differenziazione delle giunzioni neuromuscolari (NMJs). Si pensa che le neurotrofine aumentino la trasmissione neuromuscolare aumentando il rilascio del neurotrasmettitore. Le giunzioni neuromuscolari (NMJ) diventano più piccole e meno abbondanti nei muscoli laringei del ratto di invecchiamento, con prove di denervazione funzionale. Abbiamo esplorato gli effetti di NTF4 per l'uso clinico futuro come terapeutico per migliorare la funzione nei muscoli laringei umani di invecchiamento. Qui forniamo il protocollo dettagliato per l'applicazione sistemica e l'iniezione diretta di NTF4 per esaminare la capacità del muscolo laringeo ratto di invecchiare di rimodellare in risposta all'applicazione NTF4. In questo metodo, i ratti ricevevano NTF4 sistematicamente via oPompa smotica o mediante iniezione diretta attraverso le pieghe vocali. I muscoli della laringe furono poi disseccati e utilizzati per l'esame istologico della morfologia e della denervazione legata all'età.
Introduzione
I muscoli laringei contratti rapidamente e costantemente e sono vulnerabili agli effetti negativi dell'invecchiamento. Questa attività costante è pensata per contribuire a problemi vocali o disfagia osservati in persone di età superiore ai 65 anni 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Molti meccanismi molecolari e patofisiologici contribuiscono a questa disfunzione legata all'età. Questi meccanismi possono includere il rimodellamento della mucosa laringea, l'atrofia muscolare o la perdita, la mancanza di rigenerazione delle fibre muscolari o atrofia che provoca l'arricciamento delle pieghe vocali e l'incapacità della chiusura glottica 8 , 9 , 10 , 11 . Non esiste una sperimentata terapia medica in questo momento che può comPrevenire completamente o riabilitare questi cambiamenti legati all'età in questi muscoli.
La modulazione dell'efficacia della trasmissione neuromuscolare può influenzare notevolmente la prestazione neuromotoria. La famiglia delle neurotrofine comprende il fattore di crescita del nervo (NGF), il fattore di crescita del nervo derivato dal cervello (BDNF), la neurotrofina 3 (NTF3) e la NTF4 12 , 13 . Le neurotrofine hanno dimostrato di modulare l'efficacia sinaptica 1 , 4 . Il fattore di crescita dell'epatocyte, il fattore di crescita trasformante beta e il fattore di crescita dei fibroblasti sono stati recentemente impiegati negli esseri umani per il trattamento delle cicatrici vocali 15 - 17 . NTF4 regola anche l'efficacia della NMJ; I topi che mancano di NTF4 mostrano NMJ disassemblati 11 , 18 , 19 . Questi studi portano ad effetti promettenti dei trattamentiT dei disturbi muscolari linfatici e denervazione con fattori di crescita.
Le terapie di iniezione diretta ai tessuti delle pieghe vocali non sono senza precedenti negli esseri umani. Ad esempio, le iniezioni locali della tossina botulinica sono attualmente utilizzate come un trattamento efficace per i disturbi neurologici che influenzano i muscoli della laringa, come la disfonia spasmodica e la paralisi nervosa laringe ricorrente bilaterale 20 , 21 . L'idrogel acido ialuronico è un altro iniettabile, usato per trattare la scocciatura vocale e l'insufficienza glottale 22 , 23 . La laringoscopia d'iniezione può essere usata per trattare una serie di disturbi della comunicazione 24 . Questi metodi di iniezione diretta sono promettenti per migliorare la funzione vocale e deglutire nelle popolazioni che invecchiano.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Usa i topi maschi Fischer 344-Brown Norvegia a 6 e 30 mesi di età per questo protocollo. I ratti sono stati ottenuti dall'Istituto Nazionale di Colonia di Roditore di Aging. Abbiamo utilizzato i ratti per questo studio perché la struttura della laringa del ratto è simile a quella dell'uomo, funzionalmente funzionale alla protezione delle vie aeree e alle vocalizzazioni specifiche per specie. Questo studio è stato eseguito in conformità con la politica PHS sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio, La Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e la legge sulla protezione degli animali (7 USC et seq.); Il protocollo sull'utilizzo degli animali è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Kentucky.
1. Anestesia dei ratti
- Preparare l'anestetico mescolando la cloridrato di ketamine (anestetico dissociativo) e cloridrato xilazine (sedativo e analgesico) in soluzione salina tamponata. Le concentrazioni di ketamina e xilazina nella soluzione finale sono 100 mg / 8 mg per kgPeso corporeo rispettivamente.
- Iniettare le anestetiche nel ratto mediante somministrazione intraperitoneale usando una siringa con un ago da 25 G.
- Determinare che il ratto è sufficientemente anestetizzato pinzando la punta o il piede con pinze. Se il topo non reagisce al pizzico, allora la chirurgia può iniziare. Se il topo reagisce al pizzico della punta con riflessi o contrazioni muscolari, attendere 1-2 minuti e ripetere il test di pizzicotto. Se il ratto reagisce di nuovo, sostituire il ratto con una nuova animale e ripetere la procedura a partire dal punto 1.2.
- Applicare unguento oculare agli occhi del ratto, dopo che il ratto è immobile, per evitare che le cornee si asciugano.
2. Impianto osmotico della pompa
- Posizionare il ventrale del ratto sulla zona chirurgica asettica. Amministrare meloxicam come farmaco preanestetico. Amministrare intraperitonealmente ad un dosaggio di 1-4 mg / kg di peso corporeo usando una siringa con un ago da 25 G.
- Utilizzare le taglierine per rimuovere un approssimaCon uno spessore di 1 "x 1" di pelliccia dalla parte posteriore del collo e circa 1 "caudale di spalla tra le spalle. Rasare il più vicino possibile alla pelle.
- Bagnare la schiena e il collo con l'etanolo disinfettante (70%).
- Dopo la rasatura, strofinare l'aspetto dorsale del collo con 3 scrubs in successione di alcool iodio-alcool finitura con alcool.
- Mantenere la temperatura corporea del ratto inserendola su un pannello di riscaldamento impostato a 34 ° C.
- Riempire pompe osmotiche preparate asetticamente con 50 μL di NTF4 o salina per il trattamento sistemico di NTF4 ( Figura 1 ).
- Utilizzare un bisturi per realizzare un'incisione orizzontale di circa 2 cm di larghezza attraverso la pelle, solo cranica nello spazio tra la scapola. Sollevare il bordo posteriore dell'incisione con le pinze con una mano mentre inserisci la punta degli emostatici e spingete delicatamente alla parte posteriore all'incisione.
- Dopo che la punta degli hemostats è di circa 2 cm cRaniale all'incisione, aprire le maniglie sugli emostatici, espandendo le punte per formare una "tasca" vuota sottocutanea al sito di incisione. Questo sarà il sito di posizionamento per la pompa.
- Orientare il portale di erogazione della pompa prima sull'inserimento per ridurre al minimo l'interazione del NTF4 e la guarigione del sito di incisione della tasca.
- Consegnare 50 μL di soluzione salina NTF4 per 7-14 giorni. Il gruppo di 7 giorni ha ricevuto 6,72 mg / die di NTF4 per una dose totale di 47,04 mg. Il gruppo di 14 giorni ha ricevuto 6,72 mg / die per una dose totale di 94,08 mg di NTF4 25 .
- Usare filo di sutura da 5-0 nylon, hemostati e pinze per chiudere l'incisione fatta per il posizionamento della pompa.
- Osservare i ratti per almeno 30 minuti mentre recuperano da anestesia. I criteri per il completamento del monitoraggio includono l'animale che diventa attivo, muove in giro per la gabbia, l'acqua potabile, e inizia altre attività normali come la cura.
- Monitorare gli animali quotidianamentePer la prima settimana osservando la guarigione del sito chirurgico, il consumo normale dell'alimentazione e dell'acqua e il passaggio di urine / feci e qualsiasi segno abnormale comportamentale di stress, dolore o altre complicazioni postoperatorie.
- Se il ratto sembra essere in dolore o disturbo, fornire al ratto una iniezione sottocutanea di carprofen da 5 mg / kg ogni 24 ore per un massimo di 5 giorni per alleviare il dolore.
- Se sembra che ci sia un'infezione, consultare un veterinario per far sì che la ferita si guari correttamente.
- A seconda di quale gruppo sperimentale il ratto è dentro, rimuove la sutura in nylon da 5-0 7-10 giorni dopo la chirurgia per evitare irritazioni dal filo.
3. Anestesia di ratti per iniezione diretta
- Disattiva il cibo dai ratti la notte prima della procedura. Ciò assicura che non ci sia cibo per bloccare l'endoscopio o l'ago di iniezione.
- Pesare i ratti e preparare acepromazina 1-2 mg / kg di peso corporeo. Iniettare in modo intramuscolare (la posizione IM è laSinistra il muscolo tiroarytenoide).
- Posizionare il ratto nella scatola di induzione. Indurre l'anestesia nella scatola di induzione con 5% isoflurano e 1 LO 2 .
- Spostare il ratto in un cono a naso con 2% isoflurano e 600 ml O 2 .
- Determinare che il ratto è sufficientemente anestetizzato pinzando la punta o il piede con pinze. Se il topo non reagisce al pizzico, il protocollo di iniezione può iniziare. Se il topo reagisce al pizzico della punta con riflessi o contrazioni muscolari, attendere 1-2 minuti e ripetere il test di pizzicotto. Se il ratto reagisce di nuovo, sostituire il ratto con una nuova animale e ripetere la procedura a partire dal punto 3.4.
4. Iniezione diretta e visualizzazione
- Posizionare i dosaggi di 50 μl preparati asetticamente contenenti NTF4 o saline in un bagno di H 2 O impostati a 25 ° C per 30 minuti prima dell'iniezione.
- Posizionare il ratto in posizione supina e reclinata su una piattaforma di plexiglass ( figura 2 ). SusPend il ratto nella posizione reclinata dai loro incisivi frontali superiore attraverso un filo di guida strinse sulla parte superiore della piattaforma.
- Fissare una siringa da 50 μm, 30 gauge, da 100 μL ad un endoscopio sinusale da 1,9 mm, 30 ° ( figura 3 ).
NOTA: L'assieme della siringa è collegato tramite un jig che tiene saldamente la cannula alla parete esterna dell'endoscopio. L'endoscopio consente la visualizzazione delle pieghe vocali e la guida della siringa intraorale. La posizione della punta della cannula viene regolata prima di ogni animale per assicurare che la punta sia completamente visibile attraverso la vista endoscopica ( Figura 4 ). - Utilizzare un paio di pinze in gomma per estendere la linguetta e spostarla lateralmente. Successivamente, inserire un speculum di plastica per mantenere la penetrazione orale. Fai speculum da un barile da 5 ml di siringa in plastica tagliato a una lunghezza di 1,5 a 2 cm, con i bordi tagliati sbiaditi e lucidati lisci.
- Spegnere le luci nel vanoM e collegare una sorgente di luce alogena all'endoscopio. Accendere il videoregistratore per catturare la procedura.
- Immergere l'estremità distale dell'endoscopio in acqua calda per alcuni secondi per ridurre al minimo lo sviluppo della condensa sulla punta di vetro quando viene inserito nella bocca del ratto.
- Usando feedback visivo dal monitor, guidare con cura l'ago nella zona della piega vocale sinistra.
- Tempo l'iniezione della soluzione con la fase inspiratoria del ciclo respiratorio degli animali per accedere completamente alla piega vocale. Durante la fase inspiratoria della respirazione, la piega vocale è completamente esposta.
- Una volta che la piega vocale è completamente visibile, inserire l'ago nel tireoarotenoide sinistro, trovato lateralmente al bordo bianco mediale della piega vocale. Con l'ago posto, trasportare l'iniettore attraverso la depressione della siringa.
- Spegnere la sorgente di luce alogena sull'endoscopio e sul lettore video e tornare indietro sul roLuci om.
- Rimettere il ratto alla sua gabbia di casa e mettere su un tappetino di riscaldamento.
- Lasciare recuperare il ratto prima di rimuovere dal tampone di riscaldamento. Sostituire il cibo e l'acqua nella gabbia.
- Monitorare i ratti per 7 giorni dopo l'iniezione e poi eutanizzare. Rimuovere le laringe per la criocondutturazione 24 .
5. Eutanizzazione dei ratti
- Anestetizzare i ratti con cloridrato di ketamina e cloridrato di xilazina (100 mg / 8 mg per kg di iniezione intraperitoneale iniettabile).
- Eutanizzare da exsanguination dopo una toracotomia mediale.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
I ratti sono stati eutanizzati dopo 2 settimane di infusione osmotica o una settimana dopo l'iniezione diretta di NTF4. Le laringe sono state raccolte, poste in cryoprotectant (30% saccarosio e 70% saline fosfato tamponato) e poi sezionate in serie in larghezza 10 μm con un criostato. L'invecchiamento dei muscoli laringei è influenzato dalla somministrazione di NTF4 25 . Oltre al ratto giovane e vecchio, abbiamo confrontato il lato iniettato e non iniettat...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
I muscoli della laringe sono vulnerabili agli effetti sfavorevoli dell'invecchiamento. Studi precedenti hanno dimostrato variazioni nei muscoli linfari che prevedono cambiamenti nella dimensione della fibra, nel numero totale di fibre, nella capacità rigenerativa, nella dimensione e nella modifica della quantità di NMJ, oltre alle variazioni della funzione contrattile e dei cambi di isoenzima di miosina 4 , 11 , 27 ,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Istituto Nazionale sulla Sordità e altri disturbi della comunicazione (R21DC010806 per CAM e JCS e R01DC011285 a CAM).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Neurotrofina 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200 ng in 50 μ L |
| Pompa osmotica Alzet | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30 gradi endoscopio | Stoltz | 61029D | |
| 50 mm 30 calibro 100-μ L siringa | Hamilton | 84850 e soluzione salina 201812 | |
| (soluzione di cloruro di sodio) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamina cloridrato | Henry Schein | 56344 | |
| xilazina cloridrato | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 ago | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 mL siringa | Becton-Dickinson | ||
| unguento oftalmico | Henry Schein | 8897 | |
| tosatrici | Oster | 44-018 | |
| etanolo | Decon | 2716 | |
| iodio (Betadine) | Purdue Pharma LP | ||
| termoforo | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 filo di sutura in nylon | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile emostatico | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicata pinza per legatura di sutura | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofene | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| unguento antibiotico | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizina Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurano Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| scatola di induzione (scatola di anestesia) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| serbatoio di ossigeno compresso | Scott Gross | Piattaforma in plexiglas UN1072 | |
| Small Parts Inc (Amazon) | |||
| pinze con punta in gomma | Gomma per strumenti di scienza fine | 11075-00 | |
| gomma liquida per pinze sopra | 42518 | Lowe | |
| (siringa BD tagliata a misura) | Becton-Dickinson | ||
| rino-laringea stroboscopio | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| videoregistratore | Kay-Pentax | ||
| saccarosio | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| criostato Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 ematossilina | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcolico | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-canale del sodio Nav1.5 anticorpo prodotto nel coniglio | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X falloidina | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alfa-bungarotossina alexa fluor 488 coniugato | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Anestesia per piccoli animali macchina | Smiths Medical | CDS 9000 |
Riferimenti
- Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
- Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
- Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
- Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
- Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
- Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
- Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
- Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
- Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
- Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
- Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
- Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
- Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
- Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
- Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
- Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
- Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
- Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
- Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
- Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. Anatomy and dissection of the rat. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).
- Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
- Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798(2016).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
- Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
- Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , Columbus, OH. (1980).
- Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
- Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
