Articolo metodologico

Un metodo di isolamento di romanzo Clinical Grade per rene umano perivascolari cellule stromali

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DOI:

10.3791/55841

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7 agosto 2017

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1Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Centre

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un metodo di isolamento e coltura di romanzo grado clinico per rene perivascolare di cellule stromali (kPSCs) basato sulla perfusione d'organo intero con gli enzimi digestivi e arricchimento NG2-cella. Con questo metodo, è possibile acquisire il numero di celle sufficiente per una terapia cellulare.

Abstract

Cellule stromali mesenchimali (MSCs) sono omeostatici e immuni modulatoria cellule del tessuto che hanno dimostrato gli effetti benefici nel trapianto e malattie renali. Le cellule Stromal perivascolari (PSC) condividono caratteristiche con midollo osseo MSCs (bmMSCs). Tuttavia, possiedono anche, molto probabilmente a causa di locali imprinting, proprietà di tessuto-specifici e giocare un ruolo nell'omeostasi del tessuto locale. Questa specificità tissutale può provocare riparazione specifico del tessuto, anche all'interno del rene umano. Precedentemente abbiamo indicato che gli sportelli unici di rene umano (kPSCs) sono migliorati arrotolata epiteliale renale mentre bmMSCs non ha avuto questo potenziale di guarigione. Inoltre, kPSCs può migliorare di lesioni renali in vivo. Pertanto, kPSCs costituiscono una fonte interessante per la terapia cellulare, in particolare per malattie del rene e trapianto renale. Qui vi mostriamo il metodo di isolamento e coltura dettagliato per kPSCs dal grado di trapianto di reni umani basati su tutto-organo aspersione di enzimi digestivi tramite l'arteria renale e un arricchimento per il marcatore perivascolare NG2. In questo modo, può essere ottenuto quantità di grandi cellule che sono adatti per la terapia cellulare.

Introduzione

Cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule modulatore immuni che sono state originariamente isolate dal midollo osseo. Si distinguono per la loro morfologia, capacità di differenziarsi in grasso, osso e cartilagine e aderenza plastica fusiformi. MSCs esprimono i marcatori stromali CD73, CD90, CD105 pur essendo negativo per i marcatori CD31 e CD451,2,3. MSCs sono un candidato promettente per la terapia cellulare dovuto il loro tessuto omeostatico e capacità immunomodulatoria. bmMSCs sono attualmente allo studio in studi clinici per diverse malattie, tra cui malattie del rene e trapianto di rene come Recensito altrove4.

Precedentemente è stato dimostrato che cellule perivascolari da diversi organi solidi differenti, compreso il tessuto adiposo, placenta e muscolo scheletrico condividono caratteristiche con MSCs9. Tuttavia, queste cellule presentano anche funzioni di tessuto-specifici che possono provocare organotipiche riparazione10. Le cellule perivascolari del miocardio umano, ad esempio, ha stimolato risposte angiogeniche dopo ipossia e differenziano nei cardiomiociti, mentre cellule perivascolari isolate da altri tessuti non hanno mostrato questi potenziali11.

Cellule stromali perivascolare possono anche essere isolate dal mouse12,13,14 e rene umano15,16. Abbiamo ampiamente caratterizzata kPSCs e confrontato questi per bmMSCs. Abbiamo trovato che kPSCs, simile a bmMSCs, hanno capacità immunosoppressive e può supportare la formazione di plesso vascolare. Tuttavia, ci è tessuto specifiche differenze tra i tipi di cellule, come kPSCs ha mostrato una firma di espressione trascrizionale organotipiche, compresi i fattori di trascrizione nephrogenic HoxD10 e HoxD11. kPSCs, in contrasto con bmMSCs, non hanno subito la trasformazione dei miofibroblasti dopo stimolazione con TGF-β e sono stati in grado di differenziarsi in adipociti. Inoltre, kPSCs accelerato l'integrità epiteliale in un'analisi gratta e Vinci della ferita epiteliale tubolare renale, un fenomeno che non è stato osservato con bmMSCs. Questa ferita avanzata riparazione è stata mediata attraverso il rilascio di fattore di crescita dell'epatocita. Inoltre, kPSCs ha migliorato il danno renale in un modello murino di insufficienza renale acuta lesioni15. Pertanto, kPSCs sembrano avere la capacità di riparazione renale superiore e sono una fonte interessante di nuova per la terapia cellulare in patologie renali.

Per poter utilizzare kPSCs per scopi di terapia cellulare, kPSCs dovrebbe essere isolato in un modo di grado clinico con gli enzimi grado clinici e protocolli. Inoltre, per essere in grado di trattare parecchi pazienti con kPSCs da 1 donatore, sufficiente numeri di cell dovrebbero essere ottenuti. Qui vi mostriamo nel dettaglio, la procedura di isolamento clinico grado di kPSCs da reni di grado intero trapianto, producendo un numero sufficiente di cellule da utilizzare per cliniche di terapia cellulare.

Protocollo

Il comitato etico medico locale e il comitato consultivo etico del consorzio europeo (STELLAR) hanno approvato la ricerca e la raccolta di reni umani da trapianto scartati principalmente per motivi chirurgici. Il consenso alla ricerca è stato dato per tutti i reni.

1. Preparazioni per la coltura cellulare

  1. Preparare una pool di lisati piastrinici.
    1. Conservare le piastrine che sono scadute per meno di 2 giorni a -80 °C fino all'uso (per un massimo di 1 anno).
      NOTA: Le piastrine sono state originariamente acquistate da un fornitore commerciale. Sono state ottenute le eccedenze ospedaliere distribuite dalla banca del sangue locale.
    2. Scongelare le piastrine di almeno 5 donatori (preferibilmente 10) O/N a 4 °C.
    3. Raccogliere le piastrine in un grande flacone sterile, trasferirle in provette da centrifuga coniche e centrifugare per 10 minuti a 1.960 x g a 4 °C.
      NOTA: Il volume delle piastrine dipende dal numero di donatori e dalla quantità di materiale in eccesso dell'ospedale per donatore.
    4. Pipettare il surnatante nelle sacche di sangue (50 ml/sacca) attraverso il fusto di una siringa da 50 ml. Conservare a -80 °C.
  2. Preparazione del terreno di coltura cellulare.
    1. Scongelare una sacca di lisati piastrinici a bagnomaria a 37 °C.
    2. Aggiungere 1 L (cioè 2 flaconi) di Minimum Essential Medium - alpha modification (alphaMEM), 5 mL 200 mM di glutammina e 20 mL di penicillina (5.000 U/mL)/streptomicina (5.000 μg/mL) (penna/streptococco) alla sacca.
    3. Incubare per 3 ore a 37 °C.
    4. Agitare il sacchetto per il degelling picchiettando delicatamente sul sacchetto quando il sacchetto è appoggiato su una superficie piana.
    5. Filtrare il terreno di lisi piastrinico al 5% tirando i lisati attraverso il filtro del sistema trasfusionale con una siringa sterile da 50 ml.
    6. Aliquotare il terreno in provette da 50 mL e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.
      NOTA: Ogni nuovo lotto di lisati piastrinici viene testato in coltura cellulare e confrontato con il lotto precedente facendo crescere le cellule di interesse (bmMSC o kPSC) fino alla confluenza in entrambi i lotti. In termini di numero di cellule e vitalità, le kPSC o bmMC coltivate nel nuovo lotto non devono differire più del 10% e l'espressione dei marcatori di CD73, CD90, CD105 e CD31, CD34 e CD45 analizzati mediante citometria a flusso non deve differire. I metodi di coltura cellulare sono descritti nella sezione 6 del protocollo (Coltura di kPSC).

2. Preparativi per la raccolta di cellule

  1. Preparazione delle soluzioni.
    1. Preparare il terreno semplice aggiungendo 10 ml di penna/strep a 500 ml (1 flacone) di Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12.
    2. Preparare il terreno di lavaggio aggiungendo 50 ml di siero umano normale (NHS) e 10 ml di penna/streptococco a 1 flacone di DMEM-F12.
    3. Preparare il tampone enzima-stock aggiungendo 2,9 mL di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES), 1,2 mL di NaHCO3 2,5% [p/v] e 160 μL di CaCl2 (1 M) a 160 mL di soluzione University of Wisconsin.
    4. Preparare la soluzione di collagenasi aggiungendo lentamente 20 ml di tampone enzimatico al flacone di collagenasi di grado GMP contenente >2.000 U/flacone di collagenasi. Sciogliere a 4 °C per circa 40 min. Agitare delicatamente più volte durante il periodo di dissoluzione.
    5. Preparare il terreno di congelamento aggiungendo 5 mL di dimetilsolfossido (DMSO) a 45 mL di NHS.
  2. Preparazione del vassoio di perfusione (Figura 1A).
    1. Pulire la cabina di flusso e coprirla con teli chirurgici. Riscaldare un bagnomaria a circa 40 - 45 °C per riscaldare la vaschetta di perfusione a 37 °C. Indossare camici e guanti chirurgici.
    2. Collegare una vaschetta di perfusione sterilizzata al bagnomaria per preriscaldare la vaschetta di perfusione con acqua tiepida. Assicurarsi che non ci sia aria nella vaschetta di perfusione iniziando con la vaschetta di perfusione in posizione verticale. Se necessario, aggiungere altra acqua al bagnomaria per evitare l'infusione di aria nella vaschetta di perfusione.
    3. Posizionare il tubo LS25 nella pompa. Lasciare entrambe le estremità sterili del tubo nella cabina di flusso. Posizionare una pinza di Kocher su un'estremità del tubo e lasciarla riposare sul fondo del vassoio di perfusione. Posizionare una garza sterile sopra il tubo per evitare ostruzioni. Collegare un connettore Luer all'altra estremità del tubo.
    4. Aggiungere circa 100 mL di terreno semplice nel vassoio di perfusione e iniziare a lavare la provetta a una velocità della pompa di 100 mL/min.

3. Isolamento delle cellule renali

  1. Preparazione del rene.
    1. Rimuovere il rene dalle sacche sterili doppie e posizionarlo sul vassoio di perfusione sterile (Figura 1B). Rimuovere il tessuto adiposo perirenale e la capsula renale con le forbici e una leggera lacrimazione (Figura 1C) e identificare l'arteria renale sul cerotto aortico come mostrato in Figura 1D.
    2. Incannulare l'arteria renale con la punta accessoria, fissarla con un tirante sterilizzato e fissarla all'estremità del tubo della pompa con il connettore Luer mentre la pompa è accesa. Se i tubi non sono completamente riempiti, aggiungere prima altro fluido al vassoio e lavare i tubi avviando la pompa (Figura 1E - F). Lavare il rene con terreno semplice tramite la pompa con un flusso di 100 ml/min.
  2. Trattamento con collagenasi e isolamento delle cellule renali.
    1. Aggiungere la collagenasi (20 mL, >2.000 U) e la DNasi (2,5 mL, 1 mg/mL) al vassoio di perfusione (Figura 1G). Girare delicatamente il rene di tanto in tanto a mano. Attendere che il rene diventi morbido e il liquido di perfusione diventi meno trasparente (circa 30 - 40 minuti).
    2. Massaggiare delicatamente il rene (Figura 1H) fino ad ottenere una sospensione cellulare (Figura 1I). Rimuovere il materiale non digerito e la punta nell'arteria renale.
  3. Lavaggio e raccolta di cellule renali.
    1. Aggiungere 50 mL di NHS alla sospensione cellulare. Drenare la sospensione cellulare dal vassoio di perfusione mettendo la pompa a basso flusso e posizionando la provetta prima collegata al rene sopra le provette da 50 mL (Figura 1J).
    2. Centrifugare a 300 x g per 7 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Lavare i pellet con un terreno di lavaggio contenente il 10% di NHS e centrifugare nuovamente a 300 x g per 7 min. Ripetere il lavaggio ancora una volta. Misurare il volume dei pellet cellulari e aggiungere un volume uguale di terreno di coltura cellulare.
    3. Crioconservare le cellule da qui aggiungendo un mezzo di congelamento 1:1 alla sospensione cellulare e conservarle in fiale criogeniche secondo i protocolli standard, oppure continuare a coltivare le cellule (sezione 4).
      NOTA: La sospensione cellulare contiene grumi cellulari e richiede passaggi aggiuntivi per ottenere singole cellule, il che si traduce in un aumento della morte cellulare. Pertanto, le cellule vengono mantenute in sospensione e non vengono conteggiate in questa fase.

4. Coltura cellulare di cellule renali grezze

  1. Aggiungere circa 1 mL di sospensione cellulare a 24 mL di lisati piastrinici alphaMEM 5% (terreno di coltura cellulare) in un pallone di coltura cellulare T175 (Figura 1K) e coltura a 37 °C, 5% CO2. Rimuovere il terreno e i detriti cellulari dopo 2 giorni dalle cellule aderenti e rinfrescare il terreno con 25 mL di terreno di coltura cellulare.
  2. Rinfrescare il terreno di coltura due volte alla settimana rimuovendo metà del terreno (12,5 ml) e aggiungendo terreno fresco (12,5 ml) utilizzando tecniche asettiche.
  3. Coltura fino a confluente (di solito 5 - 7 d) (Figura 1L). Rimuovere il terreno, lavare due volte con PBS e tripsinizzare le cellule aggiungendo 5 mL di tripsina a ciascun pallone T175 per 5 minuti a 37 °C. Lavare nel terreno di coltura e centrifugare a 490 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.

5. Arricchimento cellulare per NG2 mediante separazione cellulare magnetica (Figura 1M)

  1. Preparare il tampone di separazione cellulare secondo il protocollo del produttore.
  2. Risospendere le kPSC tripsinizzate in un tampone di separazione cellulare da 10 mL. Centrifugare a 490 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in un tampone di separazione cellulare da 300 μl.
  3. Aggiungere 100 μL di reagen bloccante FcR/5 x 107 cellule, aggiungere 100 μL di perle anti-melanoma (NG2) per 5 x 107 cellule e incubare per 30 minuti a 4 °C. Separare la frazione NG2-positiva secondo il protocollo del produttore. Aggiungere 10 mL di terreno e centrifugare le celle per 5 minuti a 490 x g.
  4. Contare le celle utilizzando una camera di conteggio Bürker secondo il protocollo del produttore. Seminare le cellule in un pallone di coltura (circa 4 x 103 cellule/cm2) e incubare.
    NOTA: Seminare le cellule nelle seguenti concentrazioni: <250.000 in un pallone T25, 250.000 - 500.000 in un pallone T75 e 700.000 - 800.000 in un pallone T175. Dopo l'arricchimento delle celle magnetiche, viene isolata una frazione positiva di circa l'1 - 2%. Tuttavia, poiché questa fase è l'arricchimento cellulare e non lo smistamento cellulare, altri tipi di cellule saranno presenti nella coltura (Figura 1N). Dopo diversi passaggi (di solito intorno a 4 - 5), è presente solo una popolazione omogenea di kPSC (Figura 1P).

6. Cultura delle kPSC

  1. Rinfrescare il terreno due volte alla settimana rimuovendo metà del terreno e sostituirlo con un terreno di coltura appena scongelato (Figura 1N).
    NOTA: Le kPSC tendono ad essere più vitali e proliferative quando solo la metà del mezzo viene aggiornata.
  2. Superamento della media dei kPSCs.
    NOTA: Passare le kPSC al 90 - 100% di confluenza, o quando compaiono strutture 3D (vedi Figura 1O), o quando non c'è stata crescita cellulare per più di una settimana. Gli ultimi due in particolare potrebbero verificarsi nei primi passaggi dopo l'arricchimento cellulare. In questo caso, dopo il passaggio, le cellule di solito ricominciano a crescere in coltura monostrato (Figura 1P).
    1. Rimuovere il terreno dalle celle confluenti al 90 - 100% (conservare il terreno per un uso successivo). Lavare il matraccio due volte con PBS (1 mL in T25, 5 mL in T75, 10 mL in T175). Aggiungere la tripsina (0,5 mL in T25, 2 mL in T75, 5 mL in T175) e incubare per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere il vecchio terreno nel pallone e risospendere delicatamente.
    2. Trasferire in una provetta da 15 o 50 ml (a seconda del volume) e centrifugare a 490 x g per 5 minuti. Contare le cellule vitali e la piastra <250.000 in un T25, 250.000 - 500.000 in un T75 o 700.000 - 800.000 in un T175 (circa 4 x 103 cellule/cm2).
  3. Testare le kPSC al passaggio 5 o 6 (ad esempio, test di graffio, sezione 7).
    NOTA: Caratterizzare le cellule propagate mediante citometria a flusso utilizzando protocolli standard. L'espressione dei marcatori di NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC dovrebbe essere positiva e CD31, CD34, CD45 e HLA-DR dovrebbero essere negativi. Test per micoplasmi, batteri e funghi nel terreno di coltura secondo i protocolli standard del laboratorio di microbiologia clinica. Testare funzionalmente le kPSC in un test di graffio della ferita epiteliale renale. Gli esperimenti vengono solitamente eseguiti con popolazioni di kPSC sterili, confermate dalla citometria a flusso, con capacità di guarigione della ferita tra il passaggio 6-8.
  4. Crioconservare le kPSC aggiungendo 0,5 mL di terreno di crioconservazione a 0,5 mL di sospensione cellulare (2 milioni di cellule per mL di terreno di coltura) utilizzando protocolli standard.
    NOTA: Dopo lo scongelamento, seminare le kPSC a una densità maggiore (106 celle in un T175).

7. Test funzionale delle kPSC: Saggio di graffio della ferita epiteliale renale

  1. Coltura delle kPSC in una piastra a 6 pozzetti a una densità di 200.000 cellule/pozzetto in terreno di coltura da 2 mL. Dopo 48 ore di coltura a 37 °C, 5% CO2, raccogliere il surnatante. Questo è il mezzo condizionato.
  2. Seminare l'HK-2 (cellule epiteliali tubulari prossimali)17 in 2 mL di terreno di cellule epiteliali tubulari prossimali (PTEC) costituito da un rapporto 1:1 di DMEM-F12 integrato con insulina (5 mg/mL), transferrina (5 mg/mL), selenio (5 ng/mL), idrocortisone (36 ng/mL), triiodotirinina (40 pg/mL), fattore di crescita epidermico (10 ng/mL) e penna/streptococco, in una densità di 500.000 cellule per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti.
  3. Coltura per 48 ore a 37 °C, 5% CO2. Rimuovere il terreno di coltura cellulare degli HK-2 e creare una ferita da graffio nel monostrato degli HK-2 facendo un graffio con la punta di una pipetta gialla dall'alto verso il basso del pozzetto. Lavare gli HK-2 con PBS e aggiungere il mezzo condizionato dei kPSC o del mezzo di controllo. Segnare sul fondo della lastra l'area da fotografare.
    NOTA: Gli HK-2 devono essere confluenti. Immagina due aree per pozzetto.
  4. Visualizzare il graffio a 4, 8, 12 e 24 ore nella stessa posizione contrassegnata con un microscopio a campo chiaro invertito.
  5. Misura l'area di graffio nell'immagine J utilizzando lo strumento di selezione poligono per determinare la percentuale di chiusura.

Risultati

Il metodo di isolamento kPSCs grado clinico è riassunto nella Figura 1. Cellule di rene di greggio sono isolate dal trapianto umano reni di grado tramite aspersione di collagenasi. La sospensione cellulare risultante è coltivata fino al confluente nel 5% delle piastrine lisati. Quindi la frazione di cellule stromali perivascolare è isolata basato sull'espressione di NG2.

kPSCs sono cellule fusiformi aderenti in plastica (Figura 2A) e sono positivi per gli indicatori di stromal marcatori CD73, CD90, CD105 e perivascolare NG2, PDGFR-B e CD146, mentre negativo per CD31, CD34, CD45 e HLA-DR (Figura 2B). In genere, una popolazione omogenea di kPSCs può essere raggiunto al passaggio 4 e kPSCs raggiungere senescenza intorno passaggio 9-10 (Figura 2C). Consigliamo quindi di eseguire esperimenti tra passaggio 5-8.

Per valutare la capacità funzionale del kPSCs isolato, eseguiamo un'analisi gratta e Vinci in vitro rene epiteliale ferita su ogni nuovo lotto di kPSCs, come abbiamo dimostrato in precedenza che il medium condizionato di kPSCs può accelerare la guarigione arrotolata epiteliale in questo dosaggio zero15. Il medium condizionato kPSC fatta di coltura kPSCs per 48 h in alphaMEM 5% della piastrina lisati e raccogliere il surnatante. Successivamente, il rene umano immortalato tubulo prossimale cellule epiteliali (HK-2)17 sono coltivate fino a confluenza e quindi viene effettuata una ferita gratta e Vinci. Quindi sia il medium condizionato di mezzo kPSCs o controllo viene aggiunto ai pozzetti e viene misurata la velocità di guarigione delle ferite. Quando viene aggiunto il medium condizionato di kPSCs, la ferita si chiude significativamente più veloce (Figura 2D).

figure-results-1
Figura 1 : Grado clinico metodo di isolamento di umana kPSCs. Trapianto di reni di grado sono cannulati e irrorati con collagenasi via l'arteria renale (A - G) e la sospensione cellulare risultante viene lavata e sia crioconservato o messi in coltura (H - K). Dopo che le cellule raggiungono la confluenza (L), NG2 arricchimento delle cellule è effettuato (M). Le cellule vengono tripsinizzate quando entrambi sono confluenti, hanno smesso di proliferazione o quando strutture 3D appaiono (N - P). I criteri di rilascio per kPSCs sono sterilità, espressione del marcatore e la capacità di migliorare la guarigione arrotolata epiteliale tubolare (Q). Freccia: dell'arteria renale. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: kPSCs caratterizzazione dei diritti dell'uomo. Un) kPSCs sono fusiformi, plastica cellule aderenti. B) kPSCs sono positivi per gli indicatori mesenchymal CD73, CD90, CD105, perivascolare marcatori NG2, PDGFR-β e CD146, mentre negativo per CD31, CD34 e CD45. kPSCs express MHC di classe I (HLA-ABC) ma non di classe II (HLA-DR). C) caratteristiche di crescita di tre differenti kPSC donatori da citometria a flusso ha confermato popolazioni positivi NG2 omogenee (al passaggio 4). kPSCs raggiungere senescenza intorno passaggio 9-10. D) kPSCs sono in grado di esaltare il riparazione epiteliale renale in un'analisi di gratta e Vinci di ferita. Immagini rappresentative di controllo medio e medio kPSC condizionata a t = 0, 4, 8 e 12 h sono mostrati. Barra della scala nel A) = 200 µm, d) = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Cellule perivascolari sono state isolate da molti diversi organi solidi umani, tra cui pancreas, grasso, cartilagine e il rene9,15,16. Maggior parte dei metodi, tuttavia, sono basata su piccoli campioni di tessuto, che vengono sezionati e successivamente trattati con gli enzimi digestivi. Inoltre, questo solitamente non viene eseguito con prodotti grado clinico. Questo rende queste strategie meno adatto per traduzione clinica diretta dove sono necessarie grandi quantità di cellule di uso clinico.

Qui vi mostriamo un metodo di isolamento romanzo di kPSCs umana per organi interi basato su aspersione con enzimi di grado clinico e materiali. Il protocollo è adattato dal protocollo di isolamento clinico isolotti di Langerhans attualmente in uso per l'applicazione clinica nel nostro centro18.

Questo è il primo metodo di grado clinico in cui è possibile ottenere grandi quantità di kPSCs. La variabilità nel rendimento delle celle è in gran parte dipendente da donatore. Tuttavia, quando il rendimento delle celle che attualmente otteniamo da una frazione della sospensione delle cellule grezza di tre diversi donatori è estrapolato, in teoria, potrebbe conseguire un rendimento medio di 2,7 x 1012 kPSCs per donatore. Come terapia MSC è in genere costituito da 2 infusioni delle cellule con 1-2 x 106 cellule/kg corpo peso4, questi numeri di cellulare sono sufficienti per il trattamento allogenico di parecchi pazienti.

Un passaggio critico nella procedura di isolamento è la durata della digestione della collagenosi. Quando il periodo di digestione è troppo breve, grandi ciuffi di tessuto rimarrà, che sarà più difficile alla cultura. Quando il periodo di perfusione è troppo lungo, si può osservare aumentata delle cellule morte. Pertanto, non appena il rene inizia a diventare morbida e i fluidi meno trasparenti, il rene deve essere massaggiato delicatamente e il collagenosi trattamento deve essere interrotto.

Un altro punto critico è la cultura delle cellule dopo arricchimento cella NG2. A volte dopo l'arricchimento di cella NG2, le cellule perivascolari non iniziare a proliferare o iniziano a crescere in strutture 3D. In questo caso, quando le cellule vengono tripsinizzate e reinizializzate, le cellule di solito inizia a crescere in coltura dello strato monomolecolare.

Come materiale di partenza, trapianto umano reni di grado scartati principalmente per motivi chirurgici sono stati usati. Questi sono organi funzionali senza fibrosi principale. Riconosciamo che questo potrebbe essere una limitazione come questo è una malattia relativamente rara e difficile da ottenere organo sorgente. Reni espiantati potrebbero essere un'altra fonte; Tuttavia, a seconda del motivo dell'espianto di rene, questi reni potrebbero contenere più fibrosi e così myofibroblasts e pertanto si dovrebbe prestare attenzione poiché myofibroblasts potrebbe essere isolati e coltivati invece di cellule perivascolari.

Come il kPSCs isolato con questo spettacolo di protocollo organo-typic proprietà con rene epiteliale ferita guarigione capacità15, terapia cellulare con kPSCs in malattie del rene e trapianto sarebbe un'interessante applicazione futura. Per questo scopo, ci sono diverse strategie cellula/cellula della consegna del prodotto. La prima strategia è infusione IV di kPSCs, come attualmente utilizzati negli studi clinici bmMSC. Un'altra applicazione interessante è l'uso di kPSCs o fattori kPSC-escreto nell'aspersione di macchina prima di trapianto. In questo modo, la qualità del rene espiantato potrebbe migliorare che potrebbe portare ad una migliore funzionalità renale dopo trapianto. Per entrambe le strategie, i kPSCs sono un'interessante fonte cellulare nuovo di esplorare ulteriormente per scopi clinici.

Dichiarazioni

D.G.L., M.A.E., e T.J.R. sono associati con una domanda di brevetto per quanto riguarda questa ricerca. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca ha ricevuto un finanziamento dalla settimo programma Comunità europea quadro (FP7/2007-2013) sotto la concessione numero di contratto 305436 STELLAR.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sacche BaxterFenwalR4R-7004
Piastrine umaneSanquinospedale materiale in eccesso scaduto per meno di 2 d viene utilizzato
lisatosu misura
Flaconi sterili monousoCorning09-761-11
500 mL PP provette da centrifugaCorning431123
a-MEM mediumLonzaBE12-169F
glutamaxthermo fisher35050038
pen/streptococcoSistemadi 15070063
Codan455609
DMEM-F12life technologies11320-074
Siero umano normale (NHS)Sanquin
Hepes 1 MLonzaBE-17-737E
NaHCO3 7,5%LonzaBE17-613E
CaCl< sub>2 1 MSigma-Aldrich10043-52-4
UWPonte alla vita32911
EparinaLeo Pharma
collagenasi NB1 GMP gradoSERVA17455.03
DMSOSigma AldrichD2650-100ml
teli chirurgici3M NederlandDH999969404
pompa di perfusionemetrohmx007528300
testa della pompametrohmx077202600
vassoiosu misura
tubi masterflex LS25MasterflexHV-96410-25
punta accessoriaGambro DASCO6038020
pulmozymefiasche di
cm2greiner690175
pallone di coltura 75 cm2greiner658170
pallone di coltura 175 cm2greiner661160
Tripsinasigmat4174
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaA2153
EDTASigma-AldrichE5134-500g
Reagente bloccante FcRmiltenyi130-059-901
perle anti melanoma (NG2)miltenyi130-090-452
colino cellulare 70 &; mCorning352350
colonne LSMiltenyi130-042-401
magnete MACSmiltenyi130-090-976
CD34 FITCBD 
CD45 APCBD 
CD146 PEBD 
NG2 APCR& DFAB2585A
CD90 PEBD 
HLA ABC APCBD 
CD105 FITCAncell326-040
HLA DR APCBD
CD56 PEBD 
CD73 PEBD 
CD31 FITC BD 
CD133 PEmiltenyi130-090-853
PDGF-r R& Dmab 1263
topo IgG1 FITCBD 
mouse IgG1 PEBD 
mouse IgG1 APCBD 
IgG2b PEBD 
capra anti topo PEDakoR0480
sodio azideMerck822335
DMEM Ham' s F12Gibco31331-028
ITS (insulina, transferrina, selenio)SigmaI1884
idrocortisoneSigmaH0135
triiodottirininaSigmaT5516
Fattore di crescita epidermico (EGF)sigmaE9644
Immortalized human renal PTEC (HK2)courtesey di M. Ryan, collegio universitario Dublino
piastrinico trasfusionale Invitrogen di perfusione coltura 25 555821555485550315555596555555559866555516550257555445345815345816345818555743

Riferimenti

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