Induzione della differenziazione cellulare e dell'immagine delle cellule singole di Vibrio parahaemolyticus Nuotatore e cellule Swarmer

Summary

Questo protocollo consente la microscopia a cellule singole del nuotatore diverso Vibrio parahaemolyticus e delle cellule swarmer. Il metodo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili per l'analisi delle cellule singole e copre la preparazione delle colture cellulari, l'induzione della differenziazione swarmer, la preparazione del campione e l'analisi delle immagini.

Abstract

La capacità di studiare la localizzazione intracellulare delle proteine ​​è essenziale per la comprensione di molti processi cellulari. A sua volta, questo richiede la possibilità di ottenere singole celle per la microscopia a fluorescenza, che può essere particolarmente impegnativa quando le cellule di immagini che esistono all'interno delle comunità batteriche. Ad esempio, il patogeno umano Vibrio parahaemolyticus esiste come brevi cellule nuotatori a forma di bastoncino in condizioni liquide che, al contatto con la superficie, si differenziano in una sottopopolazione di cellule swarmer altamente allungate specializzate per la crescita su superfici solide. Questo articolo presenta un metodo per eseguire un'analisi microscopica di una singola cellula di V. parahaemolyticus nei suoi due stati differenziali. Questo protocollo produce molto riproducibilmente la differenziazione del V. parahaemolyticus in un ciclo vitale della cellula swarmer e facilita la loro proliferazione su superfici solide. Il metodo produce fasci di cellule swarmer differenziate che si estendono da tÈ il bordo della colonia. Notevolmente, alla punta delle bruciature di swarm, le cellule swarmer esistono in un unico strato di cellule, che consente loro facile trasferimento a una diapositiva del microscopio e successiva microscopia a fluorescenza di singole cellule. Inoltre, viene presentato il flusso di lavoro dell'analisi delle immagini per la rappresentazione demografica delle società batteriche. Come prova del principio, è descritta l'analisi della localizzazione intracellulare delle matrici di segnalazione chimotassie in nuotatori e cellule swarmer di V. parahaemolyticus.

Introduction

I batteri sperimentano costantemente cambiamenti nel loro ambiente esterno e hanno sviluppato diverse tecniche per modificare e adattare il loro comportamento di conseguenza. Uno di questi meccanismi comporta la differenziazione in tipi cellulari distinti che meglio integrano l'ambiente alterato. La differenziazione comporta spesso importanti cambiamenti nella regolazione del ciclo cellulare, nella morfologia delle cellule e nell'organizzazione spaziale delle cellule. Un organismo che può subire la differenziazione è Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartiene alla Vibrionaceae , che è una famiglia di proteobatteri che abitano abitualmente acqua fresca o salata. Vibrionaceae sono ampiamente distribuite nell'ambiente e includono diverse specie che causano infezioni del tratto intestinale nell'uomo, incluso anche Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus è un organismo dimorfico ed è in grado di differenziarsi in due distinti tipi di cellule come risposta per accogliere i cambiamentiAmbiente esterno. In ambienti acquosi, esiste come una breve cella da nuoto a forma di bastoncello con un singolo flagello polare posizionato all'antico palo di cella. A contatto con la superficie, viene attivata la differenziazione in una cellula swarmer. La differenziazione delle cellule swarmer comporta due importanti cambiamenti: la morfogenesi delle cellule swarmer attraverso l'inibizione della divisione cellulare e l'induzione di un secondo sistema flagella. Ciò determina la formazione di una cellula swarmer a forma di forma a forma di forma e molto allungata, che può continuare lo stile di vita swarmer, dove gli eventi di divisione producono cellule swarmer di progenie o alternativamente si differenziano in cellule nuotatori.

Sono stati riportati diversi fattori per indurre o influenzare la differenziazione del swarmer. Lo stimolo primario sembra essere guidato da meccanosensing dove V. parahaemolyticus utilizza il flagello polare come un sensore tattile che rileva l'inibizione della rotazione sul contatto di superficie, ma sono coinvolti diversi altri fattoriBene ¹ . Nel laboratorio, la rotazione del flagello polare può essere inibita artificialmente mediante l'aggiunta di fenamil, che blocca la rotazione flagellare guidata dal canale sodico, inducendo così la differenziazione swarmer ² . Inoltre, in uno studio precedente , Vibrio alginolyticus è stato indotto a sciogliersi su supporti solidi quando le cellule sono state propagate su un mezzo di crescita in un piatto di Petri sigillato con chiaro nastro di plastica. La carta filtrante satura alcalina impediva lo swarming in queste condizioni, suggerendo pertanto che uno o più acidi volatili potrebbero essere coinvolti nell'induzione dello swarming. Così, sigillare il piatto di Petri con nastro di plastica probabilmente consentito per l'accumulo di acidi volatili, formati come sottoprodotti di metabolismo cellulare, all'interno dello spazio testa della piastra. Lo stesso effetto è stato raggiunto quando H2O2 è stato aggiunto al mezzo di crescita in piatti Petri non sigillati per produrre artificialmente acidi volatili idrolizzando i componenti mediali 3 ^{, 4 , 5} . Tuttavia, l'identità di tali acidi volatili rimane sconosciuta. Inoltre, è stato dimostrato che l'eccesso di disponibilità del calcio ⁶ e della limitazione di ferro ⁷ aumentano entrambe la differenziazione e la proliferazione di swarmer sulle superfici solide. Le cellule possono essere affamate per il ferro aggiungendo il composto 2,2'-Bipyridyl al mezzo di crescita, che ha dimostrato di influenzare la differenziazione del swarmer ⁸ . I fattori noti per la regolazione della differenziazione sono ora implementati nella progettazione di un protocollo che riproducibilmente induce la differenziazione di V. parahaemolyticus in cellule swarmer e la loro proliferazione sulle superfici agariche solide.

V. la differenziazione del parahaemolyticus comporta grandi cambiamenti nella regolazione della divisione cellulare, nella morfologia cellulare e nel posizionamento di macchine macromolecolari come flagellA e chemiotassi - processi che richiedono la localizzazione specifica delle proteine ​​secondo il ciclo cellulare. Così, la capacità di studiare la localizzazione intracellulare di tali proteine ​​è essenziale per la comprensione dei suddetti processi cellulari. Per eseguire tali studi è necessaria la microscopia a fluorescenza sulle singole cellule. Ciò può essere particolarmente impegnativo quando le cellule di immagini che esistono all'interno di popolazioni batteriche densi, come avviene per le cellule swarmer. Ci sono stati tentativi di indurre una differenziazione di swarmer in supporti liquidi, che potenzialmente potrebbero generare singole cellule per studi di microscopia. E sebbene su un livello trascrizionale queste cellule hanno in parte indotto il programma di differenziazione swarmer, non subiscono gli stessi cambiamenti morfologici distinti, come le cellule swarmer completamente differenziate coltivate su un mezzo solido ⁸ . Questo documento offre un protocollo robusto e riproducibile di un metodo per indurre swarmer ceLl differenziazione su una superficie di agar. Il protocollo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili prontamente disponibili per la microscopia a cellule singole e successive analisi. Inoltre, il protocollo consente di localizzare studi di proteine ​​etichettate con fluorescenza in entrambi i tipi di nuoto e swarmer (sezioni 1, 2, 3, 4). Inoltre, il protocollo descrive il flusso di lavoro successivo su come elaborare e analizzare i dati generati dagli esperimenti di microscopia a fluorescenza, che consente l'analisi demografica delle società batteriche (sezione 5).

Protocol

1. Preparazione delle cellule V. parahaemolyticus elettrocompatibili e elettroporazione del DNA plasmidico nelle cellule nuotatori

NOTA: La seguente sezione del protocollo consente la preparazione di celle elettro-competenti e la successiva elettroporazione del plasmide DNA in cellule nuotatori. Questo passo è importante se le proteine ​​fluorescenti vengono espresse ectopicamente da un plasmide.

1. Sradicare le cellule V. parahaemolyticus da una riserva di glicerolo da -80 ° C su una piastra di LB agar fresca contenente 100 μg / mL di ampicillina e incubare per una notte a 37 ° C.
2. Il giorno seguente, inoculare 200 ml di mezzo LB con una singola colonia di V. parahaemolyticus e incubare a 37 ° C in condizioni di agitazione fino a raggiungere un OD ₆₀₀ di 1,0. Richiede solitamente 5-6 h di incubazione per la coltura cellulare per raggiungere la densità ottica desiderata.
3. Trasferire immediatamente le celle su ghiaccio e perfTutte le ulteriori tappe su ghiaccio e in centrifughe pre-raffreddate a 4 ° C.
4. Raccogliere le cellule a 4 ° C per 10 minuti a 2.000 x g.
5. Scartare il surnatante decantando e ri-sospendere il pellet cellulare in 25 ml di soluzione fredda di saccarosio 273 mM (pH 7.4, tamponata con KOH).
6. Raccogli le cellule di nuovo a 4 ° C per 10 minuti a 2000 x g. Ripetere due ulteriori volte.
7. Riassemblare il pellet di cellule lavate in 400 μl di soluzione fredda di 273 mM di saccarosio. Successivamente aggiungere il glicerolo ad una concentrazione finale del 15% vol / vol. Le cellule sono pronte per l'elettroporazione, ma possono anche essere congelate in aliquote di 70 μl a -80 ° C per un uso successivo.
8. Per l'elettroporazione, mescolare una aliquota di elettrocompatibili da 70 μl con 100-1000 ng di DNA plasmidico e trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione ghiacciata (intervallo di elettrodo 0,2 cm). Effettuare l'elettroporazione con le seguenti impostazioni: 25 μF, 2400 V e 200 Ω.
9. Sospendi laLe cellule nella cuvetta di elettroporazione in 600 μL di brodo LB, trasferire in un tubo da 2 ml e incubare agitando a 37 ° C per 3 ore.
10. Spin giù le cellule a 2.000 xg per 5 min e ri-sospendere il pellet in 100 μL di brodo LB. Distribuire la sospensione cellulare su piastrine selettive di agar LB contenenti gli antibiotici necessari e incubare a 37 ° C per una notte.
11. Il giorno seguente, controllare le piastre per la formazione della colonia. Le colonie che crescono portano il gene di resistenza antibiotica corretta codificato sul plasmide e ora può essere utilizzato per ulteriori esperimenti.

2. Induzione della differenziazione delle cellule Swarmer

NOTA: Le seguenti fasi descrivono come indurre la differenziazione del V. parahaemolyticus nel suo ciclo vitale della cellula swarmer e come stimolare la proliferazione sulle superfici solide.

1. Sospendere 4 g di agar cuore infusione (HI) in 100 mL ddH ₂ O per preparare le piastre di swarming.
2. Mescolare accuratamente la soluzione agar HI nel forno a microonde e scuotere la bottiglia di tanto in tanto finché la polvere non viene sciolta. Autoclave a 121 ° C per 20 min.
3. Dopo l'autoclave, raffreddare l'agar HI a 60-65 ° C. Aggiungere 2,2'-Bipyridyl ad una concentrazione finale di 50 μM (soluzione di riserva di 50 mM in etanolo al 100%). Aggiungere CaCl ₂ ad una concentrazione finale di 4 mM (soluzione di riserva di 4 M in ddH2O). Se necessario, aggiungete gli antibiotici nella soluzione per mantenere i plasmidi.
   NOTA: Se si prevede di utilizzare un plasmide inducibile, aggiungere agente induttivo alla sua concentrazione finale.
   ATTENZIONE: 2,2'-Bipyridyl: tossicità acuta (orale, dermico, inalazione). Usare guanti e occhiali di protezione durante la manipolazione di questa sostanza chimica.
4. Versare 30 - 35 ml della soluzione finale agar HI in un piatto rotondo da 150 mm di Petri e lasciare che l'agar si solidifichi.
5. Prima di individuare la coltura cellulare, asciugare la piastra agar a 37 ° C per almeno 10 minuti (o fino a quando nessun residuo liquidoSi avvicinò, ma non più) a destra con un coperchio aperto.
   NOTA: I tempi di essiccazione dipendono fortemente dall'incubatrice utilizzata e le piastre asciutte non consentono lo scoramento di V. parahaemolyticus . (Questo passo è molto importante!) Le piastre devono essere utilizzate fresche e non devono essere più vecchie di 2 - 3 ore. Le vecchie lastre saranno troppo asciutte per stimolare lo swarming.
6. Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo LB. Incubare la coltura agitando a 37 ° C fino a raggiungere OD ₆₀₀ = 0.8, richiede solitamente circa 2-3 ore. Successivamente, le cellule sono pronte per essere individuate sulle piastre agar HI swarming.
7. Posizionare 1 μl di coltura cellulare al centro di una piastra di brigatura agar HI ( Figura 1A ).
8. Lasciare asciugare il punto ( Figura 1B ).
9. Sigillare la piastra con un nastro di plastica trasparente e assicurarsi che sia saldamente attaccato, altrimenti potrebbe staccarsi durante l'incubazione durante la notte ( Figura 1C ).
   NOTA: ÈMolto importante che il sigillo sia perfetto. Evitare la formazione di bolle d'aria e pieghe al nastro quando viene applicata.
10. Incubare la piastra a 24 ° C per una notte. Ciò comporterà la formazione di una colonia di V. parahaemolyticus con fasci di razza che si estendono dalla periferia della colonia ( Figura 2 ).

3. Preparazione delle cellule Swarmer V. parahaemolyticus per la microscopia a fluorescenza

NOTA: Il seguente protocollo descrive come preparare le diapositive di agarosio a microscopia e la successiva imprinting di flaresci di swarming su un tampone di agarosio per ottenere singole cellule swarmer per la microscopia.

1. Per preparare le diapositive agarose per microscopia aggiungere 1 g di agarosio a 100 ml di un 20% vol / vol PBS e 10% vol / vol LB broth solution. Mescolare accuratamente la soluzione nel forno a microonde per sciogliere l'agarosio e lasciarlo raffreddare a 65-70 ° C mentre si mescola con un agitatore magnetico.
2. Luogo acScivolare il microscopio magro su una sezione perfettamente livellata di una panchina di lavoro. Coprire entrambe le estremità dello scivolo con due strati di nastro adesivo di laboratorio di uso generale, fissando la slitta alla panca di lavoro. La distanza tra i due pezzi di nastro dovrebbe essere di circa 3 cm.
   NOTA: i due strati di nastro creano una elevazione molto piccola, che determinerà l'altezza del rilievo agarosio. È importante che lo spazio di lavoro sia livello per assicurarsi che le celle saranno nello stesso piano per l'analisi microscopica.
3. Pipettare ~ 250 μL della soluzione di agarosio preparata in precedenza sulla superficie di vetro non coperta.
4. Ora posizionare una seconda scivola a microscopio nello stesso orientamento del fondo in alto e premere leggermente verso il basso in modo che l'agarosio residuo possa scorrere verso i lati.
5. Lasciare che l'agarosio si solidifichi per 1-2 min e poi tirare lentamente la scaletta di vetro superiore dal basso in un movimento orizzontale.
6. Utilizzando un bisturi, tagliare qualsiasi agarosio residuo che è attaccato alI lati dello scivolo del microscopio e rimuovere lentamente il nastro dalle estremità del vetrino del microscopio.
   NOTA: La scocca di agarosso è pronta e deve essere utilizzata il più presto possibile in quanto si inizia lentamente a seccare.
7. Per eseguire la microscopia su cellule swarmer, tagliare un pezzo di agarro da 3 mm x 10 mm dal bordo più esterno di una colonia di scorrimento ( Figura 1D ). E 'molto importante non rompere la guarnizione a nastro della piastra a scoppio fino immediatamente prima del trasferimento di cellule swarmer al vetrino del microscopio. Una volta che il nastro viene rimosso, le cellule V. parahaemolyticus innescano la differenziazione in cellule nuotatori.
   NOTA: Assicurarsi di indirizzare i tagli dall'esterno del bordo della colonia di scorrimento verso l'interno della colonia ( Figura 1D ). In questo modo è possibile impedire la "contaminazione del nuotatore" nel bordo della colonia di swarming.
8. Trasferire il pezzo di agar di scorrimento su un microscopio scivolo agaroso con le cellule affacciate sul agarosio paD ( figura 1E ). Questo imprime le cellule swarming sul tampone agarosio.
9. Dopo aver aspettato ~ 30 s, rimuovere attentamente il pezzo agar dal tampone agarosio ( Figura 1F ).
10. Mettere un coperchio di vetro sul tampone di agarosio dove le cellule sono state imprintate. Le cellule sono pronte per la microscopia.
    NOTA: è importante immaginare immediatamente le cellule swarmer, poiché le cellule swarmer iniziano lentamente la differenziazione allo stato nuotatore.

4. Preparazione di V. parahaemolyticus Swimmer Cell-cultures per microscopia a fluorescenza

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive come preparare una coltura di V. parahaemolyticus per eseguire la microscopia a fluorescenza sul tipo di nuotatore.

1. Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo LB. Incubare la coltura agitando a 37 ° C per 1 ora o fino a quando la leggera crescita cellulare diventa visibile.
2. AQuesta fase, se necessario, aggiungerà agente induttivo per l'espressione di proteine ​​di interesse. In questo esempio, L-arabinosi è stata aggiunta ad una concentrazione finale dello 0,2% (w / vol) per indurre l'espressione di YFP-CheW ⁹ .
3. Incubare la coltura agitando per altri 2 h a 37 ° C.
4. Seguire le fasi 3.1-3.7 per preparare le diapositive a microscopio agarosio.
5. Spot 1 μL di coltura cellulare al centro del tampone agarosio e lasciare incubare il punto fino a secco.
6. Posizionare una copertura in vetro sul rilievo di agarosio dove le cellule sono state individuate. Le cellule sono ora pronte per essere riprese sotto il microscopio a fluorescenza.

5. Analisi delle immagini

Questa parte del protocollo descrive un flusso di lavoro per l'analisi delle immagini, in particolare come estrarre i dati di fluorescenza delle singole celle per l'analisi demografica.

1. Prima di iniziare l'analisi delle immagini assicurarsi che tutte le immagini di microscopia vengano salvate in formato TIF a 16 bit.
2. Caricare il DIC (o il contrasto di fase) e le corrispondenti immagini del canale fluorescente nel software.
3. Genera un'immagine di sovrapposizione di entrambi i canali selezionando "Mostra / Sovrapposizione immagini". Impostare il numero di immagini ("# Immagini:") a due e selezionare l'immagine DIC nel primo canale e l'immagine fluorescente nel secondo canale.
4. Selezionare lo strumento "Multi-Line" dalla barra degli strumenti e contrassegnare le celle da un polo all'altro attraverso la metà della cella. Per ottenere un elenco di tutte le linee generate (oggetti di linea), aprire "Measure / Region Measurements". Configurare le misure della regione per visualizzare solo l'etichetta della regione, la distanza e l'intensità media.
5. Calibrare la dimensione dei pixel sotto "Misura / calibrazione delle distanze" alla dimensione del pixel specificata per la configurazione del microscopio e fare clic su "Applica a tutte le immagini aperte".
6. Trasferisci tutte le regioni (oggetti di linea) all'immagine del canale fluorescente. Sotto "Regioni / TrasfEr Regions "selezionare l'immagine di origine (l'immagine di sovrapposizione) e l'immagine di destinazione (l'immagine del canale fluorescente). Selezionare" Tutte le regioni "e premere" OK ".
   NOTA: Per riuscire a riprodurre le righe esatte (oggetti di linea, regioni, ROI), aprire "Regioni / Salva regioni" e salvare le regioni.
7. Esportare le misurazioni di tutte le regioni in un foglio di calcolo aprendo "Measure / Measurements Region" e premendo "Open Log". Confermare di aprire ed esportare i dati. Una volta aperto il foglio di calcolo in background, esportare i dati premendo "F9: Log Data".
8. Per determinare la posizione dei foci fluorescenti lungo la cella, aprire "Measure / Linescan". Impostare "Linescan Width" in un valore in modo che l'intera larghezza di una cella sia coperta dalla regione creata in precedenza. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico di scansione di linea e selezionare "Mostra dati grafico". Cliccando con il tasto sinistro e trascinando il cursore del mouse lungo la linea di scansione sullo schermoPunto di interesse, la finestra "Grafico dati" visualizzerà la corrispondente pixel / distanza tra i due punti. Selezionare la riga evidenziata blu e quindi copiare il contenuto.
   NOTA: L'intero profilo di intensità della scansione di linea può essere registrato in un foglio di calcolo premendo "Log Data" nella finestra "Linescan". I dati estratti possono ora essere utilizzati per la visualizzazione in grafici o ulteriori analisi statistiche. I modelli di localizzazione del ciclo cellulare possono essere facilmente visualizzati in una rappresentazione demografica della lunghezza delle cellule e delle intensità fluorescenti lungo il corpo cellulare. Queste rappresentazioni possono essere ottenute utilizzando lo stesso ROI precedentemente selezionato. Le seguenti fasi forniranno un esempio di come generare demografia simile a quelle riportate nelle figure 3C e 4C .
   1. Nelle mappe di regione di caricamento di Figi / ImageJ (.rgn) precedentemente create nel software (passo 5.6) utilizzando il "importatore di file Metamorph nd & ROI";. In alternativa, le regioni di interesse (ROI) delle cellule da analizzare possono essere create direttamente in Figi / ImageJ utilizzando lo strumento "Segmented Line".
   2. Apri "Analizza / Strumenti / Gestione ROI" e segnala tutte le voci di elenco attivo ".
   3. Successivamente, fare clic su "Altro / Multiplot" e selezionare "Elenco" nella nuova finestra "Multi Plot". Fare clic su una voce di tabella, quindi selezionare e "copiare tutto". Successivamente, incollare in un nuovo foglio di lavoro.
      NOTA: Assicurarsi che i dati della cella più lunga (due colonne X e Y corrispondenti con il maggior numero di righe) siano l'ultima a destra nel foglio di calcolo.
   4. Salva il foglio di calcolo come "CSV (delimitato da virgole) (* .csv)".
   5. Scaricare gli script R qui da "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" ^10. Gli script gestiscono le celle per lunghezza e normalizzano i profili di intensità fluorescenti di tutte le celle come una media della fluorescenza di ciascuna cellae.
   6. Esegui l'intero script "profili di cella function.R" in R [versione 3.0.1; ¹¹ ].
   7. Modificare lo script "example plots.R" nella riga 30 in modo tale che il percorso del file si riferisca alla cartella in cui viene salvato il file .csv generato in precedenza. Inoltre, modificare il nome del file "profile.csv" nella riga 31 al nome del file scelto per il file .csv generato nel passaggio 5.9.4. Successivamente, eseguire "esempio plots.R" e seguire la documentazione da "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" nonché i commenti del file di script per generare l'analisi demografica.

Results

Induzione della differenziazione e della generazione di colonie di brulicante

La figura 1 fornisce uno schema delle fasi importanti per la produzione di colonie di V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Una cultura del nuotatore è stata individuata su agar aghi e incubata a 24 ^° C, inducendo una differenziazione e una proliferazione del swarmer sulla superficie del solido agar. ...

Discussion

Questo documento descrive un metodo per l'imaging microscopico delle cellule swarmer V. parahaemolyticus seguito da analisi a valle destinate a risolvere e quantificare la localizzazione subcellulare e altre caratteristiche delle proteine ​​studiate fluorescenti. Sebbene esistano diversi strumenti per l'elaborazione e l'analisi di immagini microscopiche ^{14 , 15 , 16 , 1...}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media components
LB medium	Roth	X968.3
Difco Agar, granulato	BD	214510	Per la preparazione di LB agar con LB medium
Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar
Agarose NEEO, ultra qualità	Roth	2267.3	Per la preparazione di tamponi di agarosio per microscopia
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Additives
L-arabinosio	Roth	5118.3	Utilizzato per indurre derivati pBAD
2,2'-Bipiridile	Sigma Aldrich	D216305-25G	Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar
Cloruro di calcio diidrato	Roth	5239.1	Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar
Sale sodico di ampicillina	Roth	K029.3
Cloramfenicolo	Roth	3886.3
tampone PBS	-		Ricetta standard per soluzione salina
D(+) Saccarosio	Roth	4621.1	Per la preparazione di celle elettrocompetenti
Glicerolo	Roth	3783.5	Per la preparazione di celle elettrocompetenti
Name	Company	Catalog Number	Comments
Hardware
Piastra di Petri 150 mm x 20 mm con camme	Sarstedt	82.1184.500	Per la preparazione di piastre di sciamatura di agar HI
kelvitron t (B 6420)	Heraeus-Utilizzato		per l'essiccazione di piastre di sciamatura di agar HI
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Utilizzato per l'elettroporazione del DNA plasmidico
strong>Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Software
MetaMorph Offline (versione 7.7.5.0)	Molecular	Devices-Utilizzato	per l'analisi delle immagini al microscopio
Excel		Microsoft-Utilizzato	per l'analisi dei dati al microscopio