Induzione della differenziazione cellulare e dell&#39;immagine delle cellule singole di<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Nuotatore e cellule Swarmer

Sommario

Questo protocollo consente la microscopia a cellule singole del nuotatore diverso Vibrio parahaemolyticus e delle cellule swarmer. Il metodo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili per l'analisi delle cellule singole e copre la preparazione delle colture cellulari, l'induzione della differenziazione swarmer, la preparazione del campione e l'analisi delle immagini.

Abstract

La capacità di studiare la localizzazione intracellulare delle proteine ​​è essenziale per la comprensione di molti processi cellulari. A sua volta, questo richiede la possibilità di ottenere singole celle per la microscopia a fluorescenza, che può essere particolarmente impegnativa quando le cellule di immagini che esistono all'interno delle comunità batteriche. Ad esempio, il patogeno umano Vibrio parahaemolyticus esiste come brevi cellule nuotatori a forma di bastoncino in condizioni liquide che, al contatto con la superficie, si differenziano in una sottopopolazione di cellule swarmer altamente allungate specializzate per la crescita su superfici solide. Questo articolo presenta un metodo per eseguire un'analisi microscopica di una singola cellula di V. parahaemolyticus nei suoi due stati differenziali. Questo protocollo produce molto riproducibilmente la differenziazione del V. parahaemolyticus in un ciclo vitale della cellula swarmer e facilita la loro proliferazione su superfici solide. Il metodo produce fasci di cellule swarmer differenziate che si estendono da tÈ il bordo della colonia. Notevolmente, alla punta delle bruciature di swarm, le cellule swarmer esistono in un unico strato di cellule, che consente loro facile trasferimento a una diapositiva del microscopio e successiva microscopia a fluorescenza di singole cellule. Inoltre, viene presentato il flusso di lavoro dell'analisi delle immagini per la rappresentazione demografica delle società batteriche. Come prova del principio, è descritta l'analisi della localizzazione intracellulare delle matrici di segnalazione chimotassie in nuotatori e cellule swarmer di V. parahaemolyticus.

Introduzione

I batteri sperimentano costantemente cambiamenti nel loro ambiente esterno e hanno sviluppato diverse tecniche per modificare e adattare il loro comportamento di conseguenza. Uno di questi meccanismi comporta la differenziazione in tipi cellulari distinti che meglio integrano l'ambiente alterato. La differenziazione comporta spesso importanti cambiamenti nella regolazione del ciclo cellulare, nella morfologia delle cellule e nell'organizzazione spaziale delle cellule. Un organismo che può subire la differenziazione è Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartiene alla Vibrionaceae , che è una famiglia di proteobatteri che ....

Protocollo

1. Preparazione delle cellule V. parahaemolyticus elettrocompatibili e elettroporazione del DNA plasmidico nelle cellule nuotatori

NOTA: La seguente sezione del protocollo consente la preparazione di celle elettro-competenti e la successiva elettroporazione del plasmide DNA in cellule nuotatori. Questo passo è importante se le proteine ​​fluorescenti vengono espresse ectopicamente da un plasmide.

1. Sradicare le cellule V. parahaemolyticus da una riserva di glicerolo da -80 ° C su una piastra di LB agar fresca contenente 100 μg / mL di ampicillina e incubare per una notte a 37 ° C.

Risultati

Induzione della differenziazione e della generazione di colonie di brulicante

La figura 1 fornisce uno schema delle fasi importanti per la produzione di colonie di V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Una cultura del nuotatore è stata individuata su agar aghi e incubata a 24 ^° C, inducendo una differenziazione e una proliferazione del swarmer sulla superficie del solido agar. .......

Discussione

Questo documento descrive un metodo per l'imaging microscopico delle cellule swarmer V. parahaemolyticus seguito da analisi a valle destinate a risolvere e quantificare la localizzazione subcellulare e altre caratteristiche delle proteine ​​studiate fluorescenti. Sebbene esistano diversi strumenti per l'elaborazione e l'analisi di immagini microscopiche ^{14 , 15 , 16 , 1.......}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Media components
LB medium	Roth	X968.3
Difco Agar, granulato	BD	214510	Per la preparazione di LB agar con LB medium
Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar
Agarose NEEO, ultra qualità	Roth	2267.3	Per la preparazione di tamponi di agarosio per microscopia
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Additives
L-arabinosio	Roth	5118.3	Utilizzato per indurre derivati pBAD
2,2'-Bipiridile	Sigma Aldrich	D216305-25G	Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar
Cloruro di calcio diidrato	Roth	5239.1	Per la preparazione di piastre di sciamatura HI agar
Sale sodico di ampicillina	Roth	K029.3
Cloramfenicolo	Roth	3886.3
tampone PBS	-		Ricetta standard per soluzione salina
D(+) Saccarosio	Roth	4621.1	Per la preparazione di celle elettrocompetenti
Glicerolo	Roth	3783.5	Per la preparazione di celle elettrocompetenti
Name	Company	Catalog Number	Comments
Hardware
Piastra di Petri 150 mm x 20 mm con camme	Sarstedt	82.1184.500	Per la preparazione di piastre di sciamatura di agar HI
kelvitron t (B 6420)	Heraeus-Utilizzato		per l'essiccazione di piastre di sciamatura di agar HI
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Utilizzato per l'elettroporazione del DNA plasmidico
strong>Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Software
MetaMorph Offline (versione 7.7.5.0)	Molecular	Devices-Utilizzato	per l'analisi delle immagini al microscopio
Excel		Microsoft-Utilizzato	per l'analisi dei dati al microscopio

tamponata con fosfato<