Discriminazione e caratterizzazione delle popolazioni eterocellulari con tecniche di imaging quantitative

Summary

Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per studiare la dinamica della popolazione eterologica in risposta alle perturbazioni. Questo manoscritto descrive una piattaforma basata sull'immagine che produce set di dati quantitativi per la caratterizzazione simultanea di molteplici fenotipi cellulari di popolazioni eterellulari in modo robusto.

Abstract

I processi cellulari sono complessi e derivano dall'interazione tra diversi tipi di cellule e il loro ambiente. Le tecniche di biologia cellulare esistenti spesso non consentono un'interpretazione accurata di questa interazione. Utilizzando un approccio quantitativo basato su imaging, presentiamo un protocollo ad alto contenuto per caratterizzare le risposte fenotipiche dinamiche ( cioè cambiamenti morfologici, proliferazione, apoptosi) di popolazioni cellulari eterogenee a cambiamenti negli stimoli ambientali. Sottolineiamo la nostra capacità di distinguere tra i tipi di cellule basati sull'intensità di fluorescenza o sulle caratteristiche morfologiche inerenti a seconda dell'applicazione. Questa piattaforma consente una caratterizzazione più completa della risposta della subpopolazione alla perturbazione, utilizzando tempi più brevi, quantità minori di reagenti e minori probabilità di errore rispetto ai test di biologia cellulare tradizionali. Tuttavia, in alcuni casi, le popolazioni cellulari possono essere difficili da identificare e quantitativamente basate su cellu complesseE richiederà ulteriori problemi di risoluzione; Sottolineiamo alcune di queste circostanze nel protocollo. Abbiamo dimostrato questa applicazione utilizzando la risposta al farmaco in un modello di cancro; Tuttavia, può essere facilmente applicato in modo più ampio ad altri processi fisiologici. Questo protocollo consente di individuare le sottopopolazioni all'interno di un sistema di co-coltura e caratterizzare la particolare risposta di ciascuno a stimoli esterni.

Introduction

I dosaggi a base di cellule sono stati un cavallo di lavoro nella ricerca di base e nelle impostazioni di sviluppo dei farmaci. Tuttavia, le limitazioni di questi test standard sono diventate sempre più evidenti con la discordanza tra dati in vitro e clinici e il fallimento della maggior parte dei farmaci per ricevere l'approvazione della FDA. Qui espostiamo un nuovo metodo per l'utilizzo di immagini quantitative per analizzare contemporaneamente i fenotipi eterocellulari in risposta a rilevanti e coinvolgenti stimoli ambientali.

I saggi tradizionali basati sulle cellule che vengono utilizzati per misurare la vitalità cellulare includono: saggi di esclusione di trypan blu, MTT / MTS e colorazione a citometria a flusso di Annexin V-FITC. I test di exclusion di Trypan Blue, pur essendo semplici e poco costosi, richiedono un gran numero di celle, richiedono molto tempo e sono spesso influenzate da un orientamento dell'utente1. I test MTT e MTS misurano indirettamente la vitalità delle cellule attraverso misurazioni del tasso metabolico mitocondriale. Tuttavia, gli attivi metaboliciLe cellule possono essere influenzate da differenti condizioni di coltura (quali media o concentrazione di ossigeno) che portano a risultati imprecisi e impediscono la standardizzazione tra tipi e condizioni di cellule ^{2 , 3} . Un altro svantaggio importante di queste tecniche è la loro incapacità di distinguere tra tipi di cellule multiple - la maggior parte dei sistemi biologici sono eterocellulari. Mentre i metodi di citometria a flusso hanno la capacità di distinguere tra più popolazioni di celle, sono necessarie etichette di cella, il campionamento dinamico è impegnativo e, quando si utilizzano le cellule aderenti, questa applicazione diventa tempo e perde errori.

Altri importanti fenotipi cellulari, compresi i cambiamenti morfologici, si verificano in risposta a stimoli ambientali ma non sono catturati dai test tradizionali a base di cellule. Lo stato delle cellule di profilazione attraverso la caratterizzazione morfologica e la mappatura delle somiglianze tra i campioni è un potente strumento imparziale con l'aPossibilità di fornire nuovi approfondimenti in molti aspetti della ricerca di base e traslazione, inclusa la biologia delle cellule di base e la scoperta di farmaci ⁴ . Inoltre, la morfologia delle cellule tumorali è risultata correlata con i sottotipi del tumore ⁵ e l'aggressività ⁶ . Quindi, è di grande interesse studiare queste caratteristiche cellulari e come si riferiscono a particolari perturbazioni ambientali. Inoltre, è possibile utilizzare le differenze nelle caratteristiche morfologiche per discriminare le sottopopolazioni nei sistemi di co-coltura. Le celle di etichettatura a fluorescenza hanno dei downfalls ( vale a dire modificando le proprietà cellulari inerenti, richiedono molto tempo) e quindi metodi aggiuntivi per classificare tipi di cellule sono vantaggiosi.

L'imaging basato sulla microscopia è un metodo alternativo per profilare i fenotipi cellulari in modo multiplexato, quantitativo e robusto. In questo manoscritto appliciamo la nostra pipeline quantitativa di imaging per evidenziare l'evoluzioneDinamiche narie di popolazioni di cellule eterogenee all'interno di un tumore. Ci focalizziamo sull'interazione tra cellule non cancerose di cellule neoplastiche (NSCLC) e fibroblasti associati a cancro (CAF), il tipo di cellule stromal più diffuso nei tumori. I CAF sono stati implicati nell'iniziazione, nella progressione e nella risposta terapeutica del tumore; Pertanto, eseguire test fenotipici sulle cellule tumorali in assenza di CAF può essere fuorviante ^{7 , 8 , 9} . In particolare, abbiamo valutato gli effetti dei CAF sulle cellule tumorali in risposta a Erlotinib, una piccola molecola che punta sul recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) che viene spesso utilizzato nel trattamento clinico di NSCLC. Abbiamo utilizzato una piattaforma di screening ad alto contenuto e il relativo software di analisi delle immagini per la valutazione; Tuttavia, nel tentativo di rendere accessibile tale metodologia ad altri ricercatori abbiamo anche sviluppato un protocollo a valle comparabile utilizzando il software open source:CellProfiler ¹⁰ e Analizzatore CellProfiler ¹¹ . La maggior parte dei test di screening ad alto contenuto di immagini basati su immagini vengono analizzati con software commercializzato specifico per un dato modello di strumento. I risultati sono difficili da replicare in altri laboratori con diversi software perché gli algoritmi sottostanti sono spesso proprietari. Utilizzando questa pipeline basata sull'immagine, è stata misurata la proliferazione cellulare, la morte e la morfologia di ciascuna sottopopolazione di una coltura eterologica in risposta al trattamento farmacologico utilizzando sia la classificazione basata sulla fluorescenza che sulla morfologia. Il seguente protocollo fornisce una metodologia robusta per sondare processi cellulari complessi.

Protocol

1. Cultura cellulare

NOTA: Qui sono state indagate le risposte fenotipiche delle cellule NSCLC (H3255) all'agente di targeting EGFR, erlotinib, quando co-coltivate con fibroblasti polmonari (CCD-19Lu GFP). Per lo stesso set di dati è stata eseguita la classificazione basata sulla fluorescenza e sulla morfologia delle due popolazioni cellulari (H3255 e CCD-19Lu GFP) per esemplificare la loro concordanza. Tuttavia, deve essere utilizzato un solo metodo di classificazione e deve essere scelto in base all'applicazione.

1. Preparare 500 ml di RPMI-1640 completato con FBS caldo inattivato al 10% e 1% penicillina / streptomicina.
   NOTA: il supporto di crescita e gli integratori possono essere sostituiti come richiesto per altri tipi di cellule.
2. Coltivare le cellule in 10 cm ³ piastre come popolazioni pura in 5% CO ₂ a 37 ° C e passare il rapporto appropriato ogni 3-4 giorni.

2. Preparazione delle cellule

1. Per preparare una sospensione cellulare, rimuovere cI supporti e le cellule di lavaggio con 5 mL di 1X fosfato-tamponato salina (PBS).
2. Aspirare il PBS, aggiungere 1 mL di trypsina 0,05% riscaldato a 37 ° C e incubare per 5 minuti (o fino a quando le cellule non sono più aderenti alla piastra) a 37 ° C.
3. Per neutralizzare la tripsina, aggiungere 4 mL di RPMI a H3255 e CCD-19Lu GFP e pipettare le soluzioni cellulari in 15 ml di tubi conici.
4. Centrifugare le cellule a 150 xg per 5 minuti a RT.
5. Aspirare il supernatante e risospendere le pellicole cellulari in 10 mL di supporti RPMI in tubi conici per preparare la semina.

3. Plating Cell

1. Conta le cellule per standardizzare la semina.
   1. Invertire i tubi per mescolare le cellule in soluzione. Pipettare 10 μL di ogni sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga e aggiungere 10 μL di blu di trypan.
   2. Pipettare 10 μL di questa soluzione in una diapositiva di conteggio delle cellule e inserire nel contatore delle cellule automatiche.
      NOTA: Altri metodi di conteggio delle cellule (ad es. Emocitometro) può essere utilizzato.
   3. Ripetere il conteggio delle cellule almeno tre volte, o fino a quando i conteggi ottenuti sono coerenti.
2. Celle di semi su un piatto a più pozzetti
   NOTA: Il numero di piastre al seme dipende dal numero di punti temporali che verrà riprodotto. In alternativa, una piastra può essere ripresa nel tempo se le cellule sono trasdurate con istone-2B-GFP (o altre macchie nucleari lentivirali stabili che forniscono un'adeguata segmentazione nucleare).
   1. Sementare un totale di 1.500 cellule / pozzetto in 100 μl di RPMI. Preparare tre sospensioni cellulari per piastrare tre cellule: H3255, CCD-19Lu GFP e 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Eseguire ciascuna in triplice copia con impostazioni identiche per ciascun punto temporale.
      NOTA: Le densità iniziali di semina dovrebbero essere ottimizzate per ogni linea cellulare e la dimensione della piastra.
   2. Celle di semi in 3 piastre a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO ₂ .

4. Dosaggio di droga

1. Aggiungere DMSO alla polvere erlotinib per ottenere una soluzione finale di erlotinib di concentrazione di 10 mM.
   NOTA: il farmaco può essere sostituito come desiderato.
2. Diluire il farmaco con il mezzo di coltura cellulare a 2x la concentrazione finale con la più alta concentrazione finale a 10 μM e diluire serialmente quattro volte ad un rapporto 1:10 per un totale di cinque concentrazioni di farmaci e un controllo di droga non.
   NOTA: Se la concentrazione di DMSO è uguale o superiore a 0,1% v / v alla dose più elevata di farmaci, il controllo non deve contenere quantità equivalente di DMSO per garantire che gli effetti osservati non siano dovuti alla tossicità DMSO.
3. Pipettare 100 μL di soluzione farmacologica nel pozzetto appropriato per una concentrazione finale di farmaci di 1x diluito in mezzo.

5. Acquisizione di immagini

NOTA: Le immagini sono state acquisite nei giorni 0, 2 e 3. A seconda dei tipi di cellule e dei processi cellulari studiati, oPossono essere studiati i punti di tempo desiderati.

1. Staccare le cellule per preparare l'imaging.
   1. Compilare la soluzione di tintura alle seguenti concentrazioni finali.
      1. Per la classificazione basata su fluorescenza, preparare macchie nucleari da 5 μg / mL e macchie di cellule staminali da 5 μM in PBS (vedere tabella dei materiali ).
      2. Per la classificazione basata sulla morfologia, preparare una macchia nucleare di 5 μg / mL, una macchia di morte di 5 μM e una macchia di cellule da 5 μM in PBS (vedere tabella dei materiali ).
   2. Aggiungere a ciascun pozzetto 20 μL di soluzione colorante. Incubare per 30 minuti a 37 ° C protetto dalla luce.
2. Ottimizza e acquisisce immagini.
   1. Rimuovere la piastra di pozzetto dall'incubatore, pulire il fondo della piastra con il 70% di etanolo e inserire la piastra nella camera di imaging.
   2. Nella scheda 'Impostazione', fai clic sul pulsante '+' sotto 'Selezione canali' per aggiungere i canali appropriatiImmagine ( vale a dire campo luminoso, macchia nucleare, macchia di cellule morte, segnali GFP e RFP).
   3. Fare clic su 'Selezione layout' e prendere immagini di prova z accatastate ogni 2 μm a partire da 0 μm e terminando a 20 μm per identificare il piano di messa a fuoco. Inserisci questa distanza per ogni canale sotto 'Altezza'.
   4. Fai clic su "Snapshot" sotto ogni canale per valutare le intensità e ottimizzare i tempi di esposizione. Immettere valori più alti o inferiori in 'Tempo' come richiesto.
   5. Sul lato destro dello schermo, evidenziare i pozzetti appropriati (da immaginare) sullo schema della piastra. Negli schemi dei pozzetti qui di seguito, evidenziare i venticinque campi da immaginare in modo simile.
   6. Sotto 'Run Experiment', individuare la piastra in 'Nome piastra' nella scheda sinistra e fare clic sul pulsante 'Start' (sotto) per eseguire il protocollo di acquisizione immagini con un obiettivo 10x per generare immagini TIFF a scala grigia nei canali sopra menzionati.
      NOTA: Inst. Passo passoLe righe per il protocollo di imaging possono differire tra gli strumenti, ma i valori dei parametri devono ancora essere ottimizzati.
   7. Ripetere l'imaging nei giorni due e tre.

6. Analisi delle immagini

NOTA: Tutte le analisi delle immagini sono state eseguite usando un software proprietario. Tuttavia, poiché questa non è pubblicamente disponibile, sono state progettate analisi comparabili su CellProfiler 2.2 e CellProfiler Analyst 2.0, con un breve protocollo elencato di seguito e un protocollo dettagliato fornito come materiale aggiuntivo (le immagini di test sono già caricate in pipeline per testare il flusso di lavoro). Le immagini provenienti da questo esperimento sono state raggruppate su base per ogni pozzo, in modo che ciascun pozzo possa essere caricato individualmente. Le condutture di CellProfiler qui sotto contengono un'espressione regolare che analizza le informazioni sui metadati da ciascun nome di file immagine e consente di raggruppare ulteriormente le immagini per canale.

1. Scaricare e installare il software open source: 'CellProfiler9; E 'Analista CellProfiler'. Accetta tutte le opzioni predefinite ed i componenti aggiuntivi durante l'installazione.
2. Classificare le colture eterologiche in sottopopolazioni.
   1. Apri il software 'CellProfiler', clicca su 'File' | 'Importa pipeline' | 'Da file' e selezionare il file appropriato ("Fluorescence_Classification.cppipe" per la classificazione basata su fluorescenza o "Morphology_Classification.cppipe" per la classificazione basata sulla morfologia).
      NOTA: Questi file contengono protocolli per l'elaborazione delle immagini di base e la segmentazione dei nuclei / cellule. A causa della macchia di Hoechst irregolare presenti in queste cellule, i nuclei sono stati segmentati e ingranditi e poi utilizzati per mascherare l'immagine per consentire la segmentazione di nuclei con intensità minori.
      1. Selezionare la conduttura di classificazione basata sulla fluorescenza per classificare le celle come H3255 o CCD-19Lu basate sull'intensità eGFP e per calcolare le caratteristiche della morfologia.
         NOTA: CCDLe cellule -19Lu sono state trasfuse con GFP.
      2. Selezionare la pipeline di classificazione basata sulla morfologia per segmentare i nuclei e le cellule e per calcolare le caratteristiche morfologiche.
         NOTA: Per la classificazione è necessaria un'ulteriore analisi a valle in 'Analista di CellProfiler'. Le cellule morte sono classificate mediante classificazione basata su fluorescenza.
   2. Fai clic su "Visualizza impostazioni output" in basso a sinistra dello schermo. Selezionare la posizione dei file di immagine per l'analisi ('Cartella di input predefinita') e la destinazione dei dati estratti ('Cartella di output predefinita').
   3. Fai clic su "Analizza le immagini" per iniziare l'analisi. Al termine dell'analisi, fare clic su 'OK' e passare alla 'cartella di output predefinita' per visualizzare i dati calcolati.
      NOTA: I valori e le immagini dei parametri di esempio sono disponibili in Supplemental File 1-CellProfilerProtocol.pdf .
   4. Per la classificazione basata sulla morfologia (solo) effettuare quanto segue.
      1. Apri il software 'CellProfiler Analyst', seleziona il file delle proprietà del database generato in CellProfiler e fai clic su 'Apri'.
      2. Fai clic sulla scheda 'Classificatore' in alto a sinistra della schermata. Per chiamare immagini a cellule casuali dall'esperimento, fai clic su "Fetch"; Le immagini verranno visualizzate nella finestra non classificata.
   5. Classificare manualmente le celle come positive (H3255) o negativo (CCD-19Lu) selezionando e trascinando le celle in un contenitore appropriato (vedere Supplemental File 2-Pipeline.pdf : Figura B ). Dopo aver classificato almeno 50 celle per sottopopolazione, fai clic su "Train Classifier" e fai clic su "Controllo progresso".
      NOTA: le celle vengono classificate tramite un algoritmo di apprendimento casuale di macchine casuali controllato dall'utente ¹² . Se l'accuratezza non è superiore alla soglia approvata (> 90%), potrebbe essere necessario tornare indietro e ottimizzare la segmentazione cellulare su 'CellProfiler' o le celle potrebbero non essere ideali per la classeFingendo dalla morfologia.
   6. Fai clic su "Punteggio tutto" per generare una tabella con i conteggi delle cellule per ciascuna sottopopolazione.

Results

Abbiamo generato un set di immagini costituito da 25 campi / pozzetto, 54 pozzetti / piastra (3 cellule popolazioni x 6 concentrazioni di farmaci x 3 repliche), su tre piastre per un totale di 4.050 singole immagini. I set di immagini generati nel corso dell'esperimento sono stati analizzati utilizzando software proprietario (vedi tabella dei materiali) per estrarre diverse proprietà quantitative delle cellule (ad es. Morfologia, fluorescenza) che potrebbero poi essere utilizzate per classificare le sottopopolazioni di cellule. Tuttavia, poiché il software commerciale utilizzato ha accesso limitato, sono state create delle condutture a valle comparabili in CellProfiler e CellProfiler Analyst.

Classificazione eterocellulare nelle sottopopolazioni

I nuclei sono stati identificati e segmentati in base alla macchia del DNA (qui Hoechst) e le cellule sono state classificate o basate sulla fluorescenza o moRfologia ( Figura 1 ). Per la classificazione basata su fluorescenza, i fibroblasti (CCD-19Lu) sono stati precedentemente trasfusi con GFP-lentivirus. I livelli di intensità del GFP sono stati misurati per ogni nucleo e quelli che sono stati calcolati al di sopra della soglia accettata (basati sul segnale di sfondo) sono stati classificati come CCD-19Lu mentre quelli di seguito sono stati identificati come cellule tumorali (H3255). Per la classificazione basata sulla morfologia, le cellule sono state precedentemente macchiate con una macchia cellulare atossica (vedi tabella dei materiali) e questo è stato usato per identificare e segmentare il citoplasma. Un algoritmo di apprendimento macchina è stato addestrato con ~ 50-100 cellule di ogni popolazione. Sono state identificate funzionalità morfologiche che sono state significativamente diverse tra le popolazioni, che sono state poi utilizzate per progettare un classificatore lineare per distinguere tra le cellule CCD-19Lu e H3255. I protocolli di classificazione di fluorescenza e morfologia erano del 97,4% (n = 1403) concordanti per distinguere tra i due populIn condizioni non trattate e 92,5% (n = 916) concordanti nelle condizioni trattate con farmaci (1 μM erlotinib) ( Figura 2 ).

Analisi fenotipiche delle sottopopolazioni

Oltre alla discriminazione tra i tipi di cellule, abbiamo cercato di caratterizzare le proprietà fenotipiche di ciascuna sottopopolazione. I dosaggi multipli consentono di risparmiare tempo e reagenti, aumenta la coerenza e fornisce ulteriori informazioni sul sistema in esame. Ci sono molti potenziali risultati fenotipici e bisogna sceglierli in base alle domande di interesse. Qui sono stati studiati i cambiamenti nella morfologia delle cellule e nello stato di redditività in risposta al trattamento con erlotinib. Dopo tre giorni di trattamento con farmaci, è stata osservata una diminuzione dell'area nucleare e un aumento dell'area cellulare delle cellule H3255 ( figura 3A ). La differenza media nell'area nucleare traLe popolazioni trattate "non drogato" e "droga" sono state rilevate statisticamente significative tramite una testa di tipo 2 a due versioni (pari varianza) t ( p = 7,92 x 10 ^-16 ). Noi ipotizziamo che questa osservazione è una risposta cellulare allo stress imposto dal trattamento farmacologico.

E 'anche interessante studiare se un farmaco ha un citotossico ( cioè un aumento del numero di cellule morte nel tempo) o citostatico ( cioè diminuzione del numero di nascite cellulari nel tempo) effetto sulle cellule, in quanto questo ha un impatto clinico profondo. Ad esempio, un effetto citostatico di farmaco induce l'arresto della crescita ma non elimina le cellule dal tumore, quindi c'è il potenziale per le cellule tumorali di reiniziare la proliferazione cellulare una volta rimosso il farmaco. Gli effetti farmacologici possono spesso essere contesto, concentrazione e dipendenza di tipo cellulare. Abbiamo già osservato erlotinib che ha suscitato una risposta citotossica in un tipo di cellula, mentre mostra l'acRisposta tatostatica in un altro ¹³ .

I test di viabilità tradizionali producono il numero di cellule relative e quindi non discriminano tra arresti di crescita e morte cellulare. In questo caso, le cellule morte sono state identificate sulla base di macchia di ioduro di propidium ( Figura 3B ). Sono stati osservati sia gli effetti citotossici che citostatici di erlotinib sulle cellule H3255 con un aumento del numero di decessi e una diminuzione del numero di nascite dopo il trattamento farmacologico ( Figura 3C ). Vale la pena notare che il numero di cellule morte scende dopo il giorno 1 probabile a causa della clearance delle cellule. Le cellule CCD-19Lu non sono state influenzate dal farmaco. Un ulteriore vantaggio di questa piattaforma è la generazione di dati quantitativi. Ad esempio, nel nostro esperimento di co-cultura, una prima sottopopolazione di 1 118 (75,8%) H3255 è stata trovata a 2.817 (87.9%) o 396 (57.2%) dopo tre giorni senza o con erlotinaIb, rispettivamente ( Figura 4 ). Dal momento che possiamo generare conteggi di cellule effettive invece della percentuale relativa (come con i metodi di citometria a flusso), concludiamo che la modifica della composizione durante il trattamento farmacologico è dovuta ad una diminuzione delle cellule H3255 e non ad un aumento del CCD-19Lu. Non vale niente che i tassi di mortalità possano essere sottovalutati a causa della clearance delle cellule, che è difficile da valutare sperimentalmente e probabilmente si differenzia attraverso i tipi di cellule.

Figura 1: Panoramica del protocollo di analisi delle immagini. Due potenziali pipeline di analisi di immagine a valle per classificare le popolazioni eterologiche utilizzando una classificazione basata sulla morfologia o una classificazione basata sulla fluorescenza. Barre di scala = 100 μm. Fai clic su di leiE per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Concordanza tra morfologia e classificazione basata sulla fluorescenza. ( A ) Concordance plot che mostra la sovrapposizione dei due protocolli di classificazione. Le stesse cellule sono state classificate come H3255 usando sia la classificazione basata sulla morfologia che sulla fluorescenza. I due protocolli erano in accordo, con classificazione per il 97,4% (n = 1403) delle cellule non trattate e il 92,5% (n = 916) delle cellule trattate con erlotinib (Nota: l'area bianca è troppo piccola per visualizzare). ( B ) 10X immagini che raffigurano esempi di buona e scarsa concordanza tra la classificazione basata sulla fluorescenza e sulla morfologia. Le frecce bianche indicano le celle che sono state inconsistentemente classificate tra le piattaforme. Immagine in ingresso: blu - nuclei (Hoechst); Verde - CCD19Lu (GFP). classiImmagini di fication: Rosso - H3255; Verde - CCD-19Lu. Barra di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Misurazioni fenotipiche multipli di un singolo setup sperimentale. ( A ) Le caratteristiche morfologiche, come nuclei e cellule, sono stati calcolati sul livello della singola cellula in presenza e assenza di farmaco. Nota: Le aree celle di dimensioni inferiori a 100 μm ² sono state considerate detriti e sono escluse dalle analisi. La scatola della scatola rappresenta il mediano con le prime e le terze quarti di quarto e le barre di errore dell'intervallo di confidenza del 95%. ( B ) Le cellule H3255 (blu) e CCD-19Lu (verde) sono state co-coltivate e le cellule morte sono state identificate in base all'intensità del propidoIum iodide (rosso) e imaging con un obiettivo 10x. Barra di scala = 1 mm (pannello superiore); 100 μm (immagini in basso). ( C ) Il numero totale di cellule vive e morte è stato calcolato in tre giorni con o senza trattamento farmacologico, con un'evidente diminuzione del numero di cellule vive e l'aumento delle cellule morte con l'aggiunta di erlotinib. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media basata su tre repliche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Dinamizzazione della subpopolazione nel tempo. Rappresentative 10x immagini di pozzetti contenenti H3255 (blu) e CCD-19Lu (verde) il giorno 0 o il giorno 3 con e senza farmaco. Le cellule appartenenti a ciascuna sottopopolazione sono state contate e grafici a torta proporzionali mostrano l'aCtuale cambiamento nella composizione della popolazione attraverso i campioni. Barre di scala = 1 mm (pannelli centrali, scanalati, pannello più efficace), 1 mm (immagine superiore), 100 μm (immagini in basso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il protocollo sopra descritto migliora gli attuali saggi di biologia cellulare fornendo informazioni più complete sulle dinamiche fenotipiche di più tipi di cellule in risposta a perturbazioni ambientali, utilizzando reagenti e tempi ridotti. Uno dei principali vantaggi di questo disegno sperimentale è la capacità di analizzare più fenotipi con un unico setup e generare dati quantitativi che caratterizzano questi fenotipi a livello di singola cellula. Un vantaggio tecnico di questa piattaforma è la facilità di risoluzione dei problemi iniziale rispetto ad altri saggi. Poiché questo metodo è basato su immagini, è possibile visualizzare i pozzetti per l'apparente sovra/sottosemina. Si consiglia di avere cellule in fase di crescita esponenziale per tutta la durata dell'esperimento e di non essere limitate da vincoli nutrizionali o spaziali o confuse dalla senescenza dovuta alla scarsa semina. In caso contrario, i tassi di natalità e mortalità potrebbero non essere riproducibili tra gli esperimenti. Per riferimento, CellPD è un programma disponibile al pubblico per il calcolo dei tassi di natalità e mortalità¹⁴. Inoltre, è possibile visualizzare se sono state aggiunte concentrazioni adeguate di coloranti a ciascun pozzetto. I problemi di pipettaggio in un singolo pozzetto potrebbero causare un'errata segmentazione e dati distorti, ma possono essere facilmente rilevati con il protocollo di cui sopra.

Sfortunatamente, non tutti i tipi di cellule potrebbero essere suscettibili di questa applicazione. È importante essere in grado di segmentare accuratamente i nuclei e le cellule, quindi l'analisi delle cellule che si organizzano in strutture più sferiche o raggruppate potrebbe non essere adatta. Per alcune cellule, può anche essere vantaggioso utilizzare un colino cellulare prima della semina per garantire la semina iniziale delle singole cellule. Inoltre, la tecnica del classificatore lineare è applicabile solo ai tipi di cellule che possono essere facilmente distinti in base alle caratteristiche morfologiche.

Per il successo del protocollo, è importante innanzitutto ottimizzare le condizioni di imaging, poiché la validità delle analisi a valle dipende dalla qualità delle immagini. Mentre qui abbiamo eseguito esperimenti utilizzando una piattaforma di screening ad alto contenuto, l'acquisizione delle immagini può essere eseguita anche utilizzando qualsiasi microscopio a fluorescenza (sebbene una piattaforma di imaging automatizzata sia ideale per approcci ad alto rendimento). Le immagini di prova devono essere scattate prima di ogni punto temporale dell'imaging per assicurarsi che non vi siano problemi con il microscopio o il protocollo. Il rapporto segnale/rumore dovrebbe essere elevato, soprattutto per i canali che verranno utilizzati per la segmentazione (ad es. nuclei, colorazioni cellulari). Inoltre, è importante visualizzare l'immagine nel piano di messa a fuoco ottimale. Se le immagini sono sfocate, la segmentazione diventa molto più difficile e le caratteristiche morfologiche calcolate saranno probabilmente imprecise. Anche le differenze di illuminazione tra i campi possono causare problemi con la segmentazione dell'immagine. Grandi differenze di luminosità rendono difficile la selezione automatica dei valori di soglia. Inoltre, se ci sono intensità di fluorescenza eterogenee tra le cellule, un singolo valore di soglia potrebbe non segmentare sufficientemente tutte le cellule in un'immagine. In questa analisi, questi problemi sono stati superati creando maschere attorno a popolazioni cellulari più luminose e più scure e segmentando ciascuna popolazione separatamente.

Sebbene i fenotipi oggetto di indagine in questo protocollo siano limitati alla caratterizzazione morfologica e da vivi, possono essere facilmente ampliati per indagare altre caratteristiche. Ad esempio, gli studi di genetica funzionale possono essere aggiunti con RNAi, sovraespressione o altre perturbazioni chimiche.

In questo articolo, sono state dimostrate le capacità del protocollo di misurare la risposta delle cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule a erlotinib in presenza e assenza di CAF. Tuttavia, questo è solo un esempio dei molti tipi di cellule e parametri microambientali che possono essere testati. Abbiamo esteso questo protocollo per essere utilizzato con altri tipi di cellule e studi farmacologici, comprese le cellule primarie isolate da tumori di pazienti^13,15.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Corning	10-040-CV	terreno di coltura cellulare
Siero fetale bovino (FBS)	Gemini	100-106	integratore medio
Penicillina/streptomicina	Gibco	15-140-122	integratore medio
TC20	Biorad	contatore	di cellule 1450102
Vetrini TC20 con tripano blu	Biorad	1450003	cell controvetrini piastre
96 pozzetti	Corning	3904	piastre nere a fondo trasparente
Erlotinib	LC Laboratories	E-4007
DMSO	VWR	317275-100ML	soluzione per risospendere il farmaco
Hoechst	Invitrogen	H21491	colorante nucleare
Ioduro di propidio (PI)	Invitrogen	P1304MP	colorazione delle cellule morte
Cell Tracker Orange CMRA	Life Technologies	C34551	colorazione per cellule intere
Operetta sistema di imaging ad alto contenuto	Perkin Elmer
CellProfiler	Broad Institue	versione 2.2.0 (rev 9969f42)	http://cellprofiler.org/releases/
Incubatore			per colture cellulariQualsiasi incubatore per colture cellulari sarà adatto: le cellule sono state coltivate sotto 37 º C al 5% di CO2,
15 mL Provette coniche	Falcon Falcon	14-959-53A
10 cm2 piastre per colture cellulari	TPP	93040