Articolo metodologico

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

DOI:

10.3791/55848

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10 gennaio 2018

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1Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 3School of Biomedical Engineering, Drexel University, 4Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 5Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presenteremo lo sviluppo di auto-assemblati, tridimensionale fasci di somata astrocytic allineati longitudinalmente e processi all'interno di un encasement romanzo biomateriale. Questi ingegnerizzato "ponteggi vivente", che esibiscono micron-scala diametro ancora estendere centimetri di lunghezza, può servire come banchi di prova per lo studio dei meccanismi dello sviluppo neurologico o facilitare la neurorigenerazione di regia della migrazione neuronale e/o assonale path-finding.

Abstract

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Malattia di neurodegenerative e neurotrauma provocare spesso durevole deficit neurologici a causa della limitata capacità del sistema nervoso centrale (CNS) per sostituire i neuroni persi e rigenerare le vie axonal. Tuttavia, durante lo sviluppo del sistema nervoso, della migrazione neuronale ed assonale estensione spesso si verificano lungo le vie formate da altre cellule, indicato come "vita ponteggi". Cercando di emulare questi meccanismi e per progettare una strategia che elude l'ambiente inibitorio del SNC, questo manoscritto presenta un protocollo per fabbricare tessuti ingegnerizzati basati su astrociti "vivente ponteggi". Per creare questi costrutti, abbiamo impiegato uno schema di encasement del romanzo biomateriale per indurre gli astrociti di auto-assemblarsi in tridimensionale densi fasci di bipolare somata allineati longitudinalmente e processi. Idrogel in primo luogo, cavo micro-colonne erano riunite, e il lume interno è stato rivestito con collagene-matrice extracellulare. Astrocytes corticali cerebrali dissociato quindi sono state consegnate nel lumen della micro-colonna cilindrica e, a un diametro interno critico di < 350 µm, spontaneamente auto-allineati e contratta per produrre fibra come lunghi cavi composto densi fasci dei processi di astrociti e fibrille di collagene misura < 150 µm in diametro ancora estendere diversi centimetri di lunghezza. Questi ingegnerizzato ponteggi vivente ha esibiti > 97% vitalità cellulare e sono stati quasi esclusivamente composta da astrociti esprimendo una combinazione del filamento intermedio proteine glial-proteina silicea fibrillare (GFAP), vimentina e nestina. Questi stati allineati Astrocita reti sono state trovate per fornire un substrato permissivo per il fissaggio di un neurone e allineato del neurite estensione. Inoltre, questi costrutti mantengono l'integrità e l'allineamento quando estratti dal encasement di idrogel, che li rende adatti per l'impianto di CNS. Questi costrutti preformati strutturalmente emulano gli elementi chiave cytoarchitectural di biofiltri glial-based "vivere impalcature" in vivo. Come tale, queste impalcature derivati dal vivente possono servire come banchi di prova per studiare neurodevelopmental meccanismi in vitro o facilitare la neurorigenerazione dirigendo la migrazione neuronale e/o pathfinding axonal seguendo la degenerazione di CNS in vivo .

Introduzione

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Il sistema nervoso centrale (SNC) ha una capacità limitata per contrastare la perdita e/o disfunzione dei neuroni e vie axonal che accompagnano condizioni come la ferita di cervello traumatica (TBI), ictus, malattia di ferita (SCI) e neurodegenerative del midollo spinale1 ,2,3,4,5. Neurogenesi nel SNC è limitata a un numero limitato di aree del cervello, che ostacolano il restauro di neuroni persi6,7. Inoltre, la rigenerazione delle vie axonal perse nello SNC è insufficiente a causa della mancanza di orientamento diretto, la presenza di inibitori di conseguenza e astrogliosi reattiva dopo danno di tessuto neurale2,8, 9,10. Astrociti in genere hanno diverse funzioni nell'assistere i neuroni con omeostasi ionica, neurotrasmettitore gioco, formazione della sinapsi e neurovascular attacco11. Tuttavia, in seguito anche lievi danni al tessuto neurale, astrocytes possono subire variazioni molecolari, strutturali e funzionali come la transizione a un stato ipertrofico11. In risposta a grave neurotrauma, questi cambiamenti provocano la formazione di una cicatrice con una penombra contenente la migrazione astrociti reattivi e un nucleo di lesione che include leucociti trapelati dalla rottura emato - encefalica (BBB), microglia, oligodendrociti e fibroblasti11,12,13. Questi astrociti reattivi raggiungono una morfologia dei processi filamentosi, disorganizzati ed esibiscono l'espressione aumentata di proteine dei filamenti intermedi e proteoglicani Condroitin solfato (CSPG), che ostacolano la rigenerazione neurale12. Anche se inizialmente la cicatrice gliale aiuta a ripristinare l'integrità BBB ed evitare la trasmissione della risposta infiammatoria al tessuto sano circostante, serve come una barriera fisica e biochimica contro assone rigenerazione12,14 ,15,16. Per esempio, gli assoni che incontrano la cicatrice gliale visualizzare dei coni di crescita distrofica bulboso e stentata crescita12. Inoltre, la disorganizzazione dei processi astrocitari dopo lesione impedisce l'estensione della rigenerazione di assoni17. Il risultato di queste caratteristiche inibitorie si manifesta spesso permanenti menomazioni fisiche e neurologiche che pazienti soffrono dopo neurotrauma grave, tra cui TBI e SCI.

Indipendentemente dalle sfide estrinseche funzionale rigenerazione nel SNC, assoni hanno dimostrati di possedere un'intrinseca capacità di rigenerarsi. Per esempio, la natura dinamica dei coni di crescita distrofico a contatto con la cicatrice gliale suggerisce che queste terminazioni mantengono la loro capacità di estendere12. Di conseguenza, si ritiene che un ostacolo principale alla ricrescita assonale è l'ambiente inibitorio del SNC di alberino-ferito e che fornendo un ambiente più permissivo via la riduzione di cicatrici e/o fornendo rigenerative ponti attraverso la cicatrice sarebbe glial vantaggioso. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che i neuroni CNS erano capaci di estendere gli assoni attraverso una lesione usando gli innesti di nervi periferici come ponti, che presentano un ambiente più favorevole per assone rigenerazione12,18, 19. Parecchie altre strategie sono state perseguite per sfruttare questa capacità rigenerativa vestigiale. Ad esempio, manipolazione delle vie di segnalazione cellulare crescita in vari modelli di lesione ha provocato la rigenerazione assonale e cicatrice gliale riduzione10,20,21. Inoltre, gli studi hanno indicato che il trattamento con chondroitinase ABC, che scinde la maggior parte delle catene dello zucchero in CSPG, diminuisce l'effetto inibitorio di CSPG secernuto da astrociti reattivi22. Nonostante incoraggianti i risultati, questi approcci non forniscono diretto orientamento dei coni di crescita, che può potenzialmente causare rigenerazione aberrante12e inoltre non tengono conto della perdita di neuroni. Approcci basati su cellule sono stati utilizzati nei tentativi per superare gli effetti della cicatrice gliale e per ricostituire le cellule perse, in particolare i neuroni. Alcuni gruppi hanno dedifferenziate di astrociti reattivi nei neuroni, mentre gli altri sono trapiantate cellule progenitrici neurali in lesioni dello SNC di ripopolare la zona ferita e promuovere assone rigenerazione23,24, 25. Tuttavia, trapianto di cellule staminali è limitato dalla bassa sopravvivenza, scarsa integrazione e conservazione modesta nel tessuto danneggiato5. Inoltre, queste strategie basate sulle cellule non riescono a ripristinare a distanza axonal tratti, soprattutto in un modo controllato. Di conseguenza, biomateriali in combinazione con altri approcci stanno esplorande come veicoli di consegna per vari neurale e fattori di crescita e cellule progenitrici26. Approcci basati su biomateriali presentano un elevato grado di controllo di progettazione per la produzione di costrutti che imitano le specifiche fisiche, haptotaxic, e chemotaxic spunti presentano nel microambiente tridimensionale (3D) di destinazione host tessuto27, 28,29,30,31,32,33,34. Riproduzione di questi segnali ambientali è preminente per cellule trapiantate a presentare nativo-come la morfologia, la proliferazione, migrazione e segnalazione, tra le altre caratteristiche neurobiologiche29. Nonostante queste proprietà vantaggiose, avanzamento oltre tradizionale delle cellule seminate biomateriale ponteggi è necessaria per promuovere la rigenerazione assonale interurbano diretta e sostituire i neuroni persi contemporaneamente.

Un promettente approccio alternativo si basa su tessuto neurale ingegnerizzato "ponteggi vivente", che sono distinti da altri approcci basati su cellule a causa della presenza di cellule neurali viventi con un cytoarchitecture preformato che emula neuroanatomia nativo e/o meccanismi per facilitare la sostituzione mirata, la ricostruzione e la rinascita di circuiti neurali4,35. Considerazioni per la progettazione di ponteggi viventi includono i fenotipi e le fonti di cellule neurali, come pure le proprietà fisiche e meccaniche e i segnali biochimici dettata dalla composizione di qualsiasi accompagnamento di biomateriali35. Dopo il montaggio in vitro, queste impalcature vivente possono essere impiantato in vivo di molecole di adesione cellulare presente e chemiotattica e neurotrophic segnali per regolare attivamente la migrazione delle cellule neurali e crescita assonale a seconda dello stato e progressione dei processi rigenerativi35. Le cellule gliali possono servire come base per i derivati dal cytoarchitecture di vita ponteggi poiché queste cellule mediano vari meccanismi in vivo. Durante lo sviluppo cerebrale, nuovi neuroni si basano su processi basali esteso da glia radiale dalla zona ventricolare verso la piastra corticale in via di sviluppo come vivente impalcature per migrazione diretto36,37. Inoltre, estendendo la crescita coni sono mostrato a orientarsi rilevando segnali attraenti e repellenti suscitati dalle cellule gliali guidepost e cosiddetto "pionieristico" assoni sono consigliati per raggiungere gli obiettivi corretti estendendo lungo pre-modellato glial ponteggi di35,38,39. Così, le cellule gliali sono necessari per la Guida di avanguardia di assoni, che più tardi servono come assone-based "ponteggi vivente" per dirigere la proiezione degli assoni "seguace". Inoltre, meccanismi di crescita mediata da cellule gliali sono stati indicati a persistere dopo la nascita, come neuroblasti seguono migratori rostrale (RMS) per spostarsi dalla zona subventricolare (SVZ), una delle poche regioni di neurogenesi nel cervello adulto, per il bulbo olfattivo (OB)40. Questi neuroblasti nel RMS migrano all'interno del tubo glial (Figura 1A-1), che è costituito da processi astrocitari allineati longitudinalmente, tramite le adesioni cellula-cellula diretto e localizzato fattori solubili37, 41. Infine, mentre danno dello SNC in cause di mammiferi perturbato disposizione astrocytic processo formando una cicatrice gliale che fisicamente impedisce la rigenerazione assonale17, molti sistemi di mammiferi mancano la formazione di una cicatrice gliale dannosa. Piuttosto, le cellule gliali di specie di mammiferi mantengono più organizzato, allineato modelli che vengono utilizzati come guide attraverso la regione feriti17,42,43. Per esempio, nei modelli SCI non derivanti da mammiferi, assoni sono mostrati a crescere in stretta associazione con glial ponti che attraversano la lesione, suggerendo un ruolo importante per ponteggi glial organizzati come substrati facilitando la rigenerazione assonale e recupero funzionale ( Figura 1A -2) 42 , 44 , 45. ricapitolazione delle caratteristiche neuroanatomiche e i meccanismi dello sviluppo/rigenerativo descritti sopra può produrre una nuova classe di derivati dal vivere glial basato su impalcature che contemporaneamente possono guidare immatura migrazione neuronale ed assonale path-finding attraverso ambienti altrimenti non permissivi, quindi potenzialmente mitigare gli effetti di un neurone e la degenerazione del tratto dell'assone associato con lesione dello SNC e malattia.

Il nostro gruppo di ricerca ha già progettato più tipi di ponteggi vivente per la ricostruzione e rigenerazione di axonal tratti nel sistema nervoso centrale e sistema nervoso periferico (PNS) tramite micro-tessuto ingegnerizzato reti neurali (micro-teen) e tessuto innesti ingegnerizzati del nervo (TENGs), rispettivamente27,46,47,48. Entrambe le strategie dipendono intrinsecamente biomimetica. Micro-teen sono strutture anatomicamente ispirato alla strutturalmente e funzionalmente sostituire axonal tratti collegamento distinte popolazioni neuronali del cervello. TENGs sfruttare il meccanismo inerente allo sviluppo di assone-facilitato la rigenerazione assonale, esemplificato dalla crescita assonale "seguace" lungo gli assoni "pioniere", per raggiungere la destinazione host la rigenerazione assonale35,46,48. Abbiamo recentemente sfruttato la versatilità dello scaffold vivente tecnica mediante uno schema simile di encasement come micro-teen e in cerca di ispirazione dai meccanismi basati su cellule gliali presenti nel corso dello sviluppo. Qui, abbiamo sviluppato costrutti costituito da fasci astrocytic allineati che abbracciano il lume collageno di un idrogel micro-colonna49. Queste impalcature astrocytic viventi sono state sviluppate da primo riempimento un gruppo di ago di agopuntura-tubo capillare con agarosio liquido per creare un idrogel cavo cilindrico con un diametro esterno (OD) e il diametro interno (ID) corrispondenti ai diametri della tubo ed ago, rispettivamente. A seguito dell'agarosi gelificazione ed estrazione di idrogel micro-colonna dal tubo capillare, interno cavo è rivestito con tipo I collagene per fornire un ambiente permissivo per adesione di astrociti e allineato bundle formazione (Figura 1B -1). In seguito, il lumen è seminato con i astrocytes corticali cerebrali isolati da cuccioli del ratto postnatale (Figura 1B-2). Contrariamente alle tecniche bidimensionali (2D) allineamento che si basano sull'applicazione di campi elettrici, bioerodibili scanalature e matrice extracellulare della proteina (ECM) patterning, allineamento di astrociti nell'impalcatura di vita tecnica si basa sulla auto-assemblaggio secondo variabili controllabili come substrato curvatura (ID di colonna), la densità delle cellule e collagene concentrazione50,51,52. Gli astrociti contraggono e rimodellano il collagene e di acquisiscono una morfologia bipolare, allineati longitudinalmente analoga per i ponteggi naturali osservati in vivo (Figura 1B-3). Infatti, stiamo attivamente perseguendo l'uso di questi cavo-come le strutture come substrati fisici per un orientamento mirato di migrazione neuroni immaturi, nonché facilitare la rigenerazione assonale attraverso l'ambiente sfavorevole del danneggiato snc, in particolare la cicatrice gliale mammiferi (Figura 1). Questo articolo verrà presentare il metodo di fabbricazione dettagliato per le micro-colonne astrocytic, contrasto e immunofluorescenza immagini della citoarchitettura previsto e per una discussione esaustiva sulle limitazioni attuali e future direzioni di fase i tecnica.

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Figura 1: ispirazione, protocollo di fabbricazione e applicazioni proposte per le reti di Astrocytic allineate. Ispirazione neurobiologica (A): (1) neuroblasti provenienti dalla zona subventricular neurogena (SVZ) utilizzano il tubo glial allineato longitudinalmente in rostrale migratori (RMS) per la migrazione diretto verso il bulbo olfattivo (OB); (2) Non-mammiferi come anfibi e pesci possono sostenere la rigenerazione dopo tessuto neurale in parte i danni dovuti alla formazione di un ponte glial che collega le estremità di una lesione (ad es. transected del midollo spinale) e serve come impalcatura per la Guida di assoni di rigenerazione. (B) Panoramica di fabbricazione: (1) costruzione di un'idrogel micron di dimensioni medie, cavo micro-colonna con il lume rivestito con ECM, (2) semina di astrociti corticali primari isolati da cuccioli del ratto postnatale, (3) auto-assemblaggio di longitudinalmente orientati verso il fasci di cultura ed estrazione (4) del fascio dal encasement del biomateriale per gli studi futuri dell'impianto. (C) applicazioni In vivo : (1) Queste impalcature vivente possono servire come tubi gliali ingegnerizzati per migrazione neuronale diretto da neurogene centri per ripopolare le regioni del neurone-carenti; (2) ricapitolazione del meccanismo dello sviluppo di avanguardia di orientamento dell'assone e il meccanismo rigenerativo di glial ponti in non-mammiferi può dotare queste impalcature astrocitari con la capacità di dirigere la rigenerazione assonale attraverso il non permissivi ambiente della cicatrice gliale dei mammiferi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

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Tutte le procedure sono state approvate dalle commissioni di utilizzo presso la University of Pennsylvania e la Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center e istituzionali Animal Care e rispettate le linee guida stabilite nei criteri del servizio di sanità pubblica di NIH su Humane Cura e uso degli animali da laboratorio (2015).

1. sviluppo di agarosio Hydrogel Micro-colonne

  1. Fare una soluzione di agarosio 3% peso/volume (p/v) di peso 3 g di agarosio e trasferirlo in un recipiente sterile contenente 100 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Aggiungere una barra magnetica sterile Becher e posizionarlo sulla superficie di una piastra calda/agitatore. Tenere a riposo il becher coperto per evitare l'evaporazione del suo contenuto nel passaggio successivo.
  2. Riscaldare l'agarosio e DPBS ad una temperatura di 100 ° C e mescolare a 60-120 giri/min. Regolare queste impostazioni come necessario e monitorare costantemente la progressione del processo di dissoluzione, come la soluzione inizialmente cambia da opaco a un aspetto chiaro che significa che l'agarosio è stato sciolto completamente.
    Attenzione: Il bicchiere caldo e la soluzione sono calde!
  3. Come la soluzione di agarosio è riscaldata e mescolata, recuperare quattro capsule di Petri vuota 10cm e aggiungere 20 mL di DPBS a due di loro. Posizionare gli aghi di agopuntura (diametro: 300 µm, lunghezza: 40 mm), microliter tubi capillari di vetro (diametro: 701,04 µm, lunghezza: 65 mm, capacità: 25,0 µ l) e un dispenser di lampadina all'interno della cappa di biosicurezza. Quando la soluzione di agarosio liquido Cancella, mantenere costante riscaldamento a circa 50 ° C e mescolando per evitare la gelificazione di agarosio.
  4. Introdurre un ago di agopuntura nell'apertura inferiore di un distributore di lampadina. Inserire un tubo capillare sopra l'ago esposta all'esterno. Fissare il tubo capillare inserendo parte di esso nella sezione di gomma del cilindro erogatore lampadina.
  5. Trasferire 1 mL di liquido dell'agarosi con una micropipetta alla superficie di una piastra di Petri vuota e inserire un'estremità del capillare verticalmente (con l'ago inserito) a contatto con agarosio, mentre il tappo di gomma del dispenser lampadina è vengano schiacciato verso l'interno. Rilasciare lentamente la pressione sul tappo erogatore lampadina disegnare agarosio nel tubo capillare.
    Nota: Il trasferimento di agarosio liquido nel tubo capillare deve essere eseguito rapidamente. Se l'agarosio liquido viene lasciato raffreddare sulla superficie di Petri per un tempo sufficiente (circa 60 s), inizia a gel, prevenire l'aspirazione adatto di agarosio lungo il tubo capillare.
  6. Posto che ogni gruppo di lampadina-tubo-ago in un libero di Petri e lasciare che l'agarosio gel all'interno dei tubi capillari solidificare per 5 min. Estrarre con cautela il tubo capillare con le mani fuori il tappo di gomma nel cilindro erogatore lampadina, lasciando l'ago e la gel di agarosio al posto all'interno del tubo.
  7. Estrarre manualmente l'ago di agopuntura estraendolo lentamente il tubo capillare; il cilindro di agarosio appena solidificato anche scivola fuori dal tubo in questa procedura, che ancora circondano l'ago. Spingere delicatamente la micro-colonna lungo l'ago di agopuntura con la punta delle pinze sterili per spostarlo alla fine. Posizionare l'ago sopra un aperto, capsula di Petri contenenti DPBS e spingere la micro-colonna nella DPBS con il forcipe.
    Nota: Se la micro-colonna di agarosio rimane all'interno del tubo capillare di vetro alla rimozione dell'ago di agopuntura, e spingere lentamente la micro-colonna di agarosio fuori il tubo capillare con un ago calibro 25 mm e nel piatto con DPBS.
  8. Sterilizzare microscalpels o forcipe usando uno sterilizzatore caldo perlina. Fare 4% w/v agarosio pesando 4 g di agarosio e trasferirlo a 100 mL di DPBS. Riscaldare e mescolare come spiegato nel passaggio 1.2 per ottenere una soluzione di agarosio liquido trasparente di 4%. Mantenere il riscaldamento e l'agitazione della soluzione durante la procedura seguente.
  9. Trasferire le capsule di Petri contenente le micro-colonne da un cappuccio di dissezione e spostare una micro-colonna con una pinzetta in una capsula di Petri vuota. Utilizzare lo stereoscopio per la guida ottica e un microscalpel per tagliare le micro-colonne fino alla lunghezza desiderata. Tagliare entrambe le estremità all'estremità di forma smussata agli angoli di 45o dalla posizione orizzontale per facilitare la movimentazione delle micro-colonne durante l'aggiunta di ECM e cella.
  10. Ripetere la precedente passo per tre ulteriori micro-colonne nello stesso piatto Petri e allineare i quattro costrutti in parallelo con una separazione di < 3 mm tra ognuno dei cilindri. Caricare 50 µ l di soluzione di agarosio 4% con una micropipetta e versare una striscia/linea di liquido sopra la matrice di micro-colonna per connettersi e aggregare i costrutti in gruppi di quattro persone (di seguito denominati "micro-colonna barche"). Evitare movimenti di 4% di agarosio fino ai confini della micro-colonne, che possono intasare l'interno, riducendo al minimo la distanza tra i costrutti e aggiungendo l'agarosio rapidamente in una linea sottile.
    Nota: Organizzare gruppi di quattro micro-colonne in "barche" non è necessaria per fabbricare i ponteggi astrocytic. Tuttavia, le barche servono per accelerare il processo di fabbricazione e di offrire un modo più sicuro per spostare e gestire micro-colonne nei passaggi successivi.
  11. Lasciare raffreddare la barca di micro-colonna per 1-2 min consentire di gelificazione di agarosio 4% aggiunto. Prendere la barca di micro-colonna con una pinzetta di collegamento 4% agarosio e spostare la micro-colonne di altri contenenti DPBS Petri preparata al punto 1.1.3. Fabbricare altre imbarcazioni con le micro-colonne rimanenti come desiderato.
  12. Spostare le piastre Petri contenenti micro-colonne e/o barche per una cappa di biosicurezza e sterilizzare con l'esposizione ai raggi ultravioletti (UV) per 30 min.
    Attenzione: Indossare una protezione adeguata per evitare l'esposizione ai raggi UV.
  13. Conservare i piatti con le barche di micro-colonna in DPBS a 4 ° C, se aggiunta di ECM e placcatura di cella non verrà eseguita immediatamente in seguito, fino a 1 settimana. Ripetere i passaggi di fabbricazione di micro-colonna se i costrutti non sono utilizzati durante questo lasso di tempo.

2. isolamento e coltura primaria delle cellule

  1. Isolamento di astrociti corticali da cuccioli del ratto
    1. In preparazione per la procedura seguente, aggiungere 20 mL di Hank soluzione salina (HBSS) a quattro Petri da 10 cm che servirà come serbatoi per i tessuti dissecati equilibrata. Tenere tutti i piatti sul ghiaccio. Sterilizzare pulito forbici, pinze, micro-spatola e micro-bisturi in uno sterilizzatore a caldo della perla.
    2. Preriscaldare il 0,25% tripsina con 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e desossiribonucleasi (DNasi) di 0,15 mg/mL in HBSS a 37 ° C. Inoltre, preriscaldare il terreno di coltura di astrociti a 37 ° C, che consiste di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con miscela di nutrienti F-12 di prosciutto e 10% siero bovino fetale (FBS).
    3. Anestetizzare postnatale giorno 0 o cuccioli del ratto Sprague-Dawley di giorno 1 di esporli a condizioni ipotermiche ed eutanasia per decapitazione. Perno la testa in un palcoscenico con una 19 mm calibro ago inserito nel muso davanti agli occhi.
    4. Fare un'incisione con un bisturi nel mezzo posteriore a anteriore, dalla base del collo fino al proprio dietro gli occhi. Eseguire un'altra incisione andando lateralmente da direttamente dietro gli occhi verso il basso, formando una forma a T. Utilizzare una pinzetta per tirare il pelle/cranio cranico fuori al lato.
    5. Tenere la testa per il muso (rivolto verso l'alto) inserendo un polo delle pinze nella bocca dell'animale e l'altro sulla superficie esterna. Rimuovere il cervello con una micro-spatola sterile e inserirlo in uno dei piatti Petri riempito con HBSS refrigerati. Posto questa capsula di Petri sul ghiaccio immediatamente in seguito e a tutte le volte tranne quando è in uso.
    6. Situare un blocco di granito precedentemente conservato a-20 ° C sotto uno stereoscopio all'interno di una cappa di dissezione. Collocare la capsula di Petri con il tessuto cerebrale sulla superficie del blocco di granito per preservare la sua bassa temperatura durante la procedura di dissezione. Utilizzare lo stereoscopio come guida visiva durante la procedura seguente.
    7. Se bulbi olfattivi rimangono intatti, estrarli da taglio con forcipe o microscalpels. Inoltre, utilizzare un microscalpel per rimuovere il cervelletto e fare un'incisione mediana che separa i due emisferi cerebrali. Trasferire gli emisferi con il forcipe per una piastra Petri contenente HBSS fresco, refrigerato.
    8. Sezionare le strutture del midbrain dall'interno degli emisferi con un microscalpel per ottenere solo le cortecce separate. Utilizzare una pinzetta per staccare le meningi, una foglio-come la struttura, dal tessuto corticale e trasferire le cortecce isolate per una nuova capsula Petri con HBSS freddo. Utilizzare il microscalpel per tritare il tessuto al fine di aumentare la superficie per azione della tripsina nel passaggio successivo.
    9. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire le cortecce una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 4 mL di tripsina-EDTA preriscaldata (8 cortecce in ogni tubo). Esporre il tessuto corticale di tripsina-EDTA per 5-7 min a 37 ° C.
    10. Con una pipetta Pasteur, rimuovere la tripsina-EDTA con cautela e aggiungere 400 µ l di 0,15 mg/mL dnasi I soluzione per la provetta da centrifuga. Agitare il tubo o vortice fino a tutto il tessuto è dissociato e non ci sono nessun pezzi di tessuto rimanente nel liquido. Se non è possibile sciogliere completamente il tessuto, rimuovere i frammenti rimasti con la punta di una pipetta di Pasteur.
    11. Centrifugare la provetta contenente la soluzione delle cellule dissociate a 200 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur senza disturbare le cellule. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura di astrociti (definito al punto 2.1.2) al tubo con una micropipetta e agitare per risospendere e creare una soluzione omogenea.
    12. Trasferire 10 mL di terreno di coltura di astrociti con una pipetta sierologica in un pallone di T-75. Aggiungere 250 µ l di soluzione di cella 1 mL (preparata al punto 2.1.11) con una micropipetta al pallone a piastra un cervello pup vale la pena di cellule per fiaschetta. Distribuire uniformemente la soluzione scaricata cella il terreno di coltura e agitare delicatamente il pallone per promuovere ulteriormente una distribuzione uniforme.
    13. Coltura le beute placcate in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Dopo aver raggiunto 24 e 72 h nella cultura, meccanicamente agitare la beuta per staccare i tipi di cellule non-aderenti, quali i neuroni ed oligodendrociti.
    14. In seguito, ciascuno di questi punti temporali, è possibile eseguire una modifica di media. Tenere la beuta verticalmente così i terreni di coltura si trova sul fondo del matraccio, non coprendo le cellule aderite. Aspirare il terreno di coltura con una pipetta Pasteur, premendo la punta della pipetta contro l'angolo inferiore del pallone per evitare l'estrazione delle cellule. Mettere il pallone in posizione orizzontale originale e delicatamente aggiungere 10 mL di medium di astrociti sopra le cellule con una pipetta sierologica.
    15. Riporre le beute nell'incubatore dopo ogni cambiamento di media. Dopo aver acquisito il 90% confluency, Agitare meccanicamente il pallone una volta di più per rimuovere tutte le cellule rimanenti non aderenti.
    16. Passaggio i astrocytes prendendo fuori il terreno di coltura con un vuoto e una pipetta Pasteur. Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA 0.25% con una pipetta sierologica sopra le cellule aderite. Agitare delicatamente il pallone per assicurare che la tripsina copre tutte le celle e incubare la beuta per 5-7 min a 37 ° C e 5% CO2.
    17. Placare la tripsina aggiungendo 1 mL di terreno di astrociti alle cellule con una pipetta sierologica. Estrarre la soluzione di cella dal pallone con una pipetta sierologica e trasferirlo in una provetta da centrifuga sterili da 15 mL. Centrifugare la provetta a 200 x g per 3 min.
    18. Rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica e risospendere le in 1 mL di terreno di coltura di astrociti. Agitare il tubo per garantire che la soluzione di cella è omogenea. Contare il numero di celle nella soluzione con un contatore automatico delle cellule o un emocitometro.
      Nota: Un pallone che è 90% confluenti in genere produce circa 3 milioni gli astrociti.
    19. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura di astrociti in un pallone da T-75. Eseguire una diluizione di 1:4 trasferendo 250 µ l della soluzione delle cellule (passo 2.1.18) con una micropipetta il matraccio di T-75 già contenente terreno di coltura. Agitare delicatamente per garantire una distribuzione omogenea delle cellule su tutta la superficie del pallone.
    20. Ripetere passaggi 2.1.16-2.1.19 ogni volta confluency di 90% avviene per le cellule del passaggio.
  2. Isolamento di neurone corticale da feti di ratto
    1. Seguire preparazioni simili come punti 2.1.1 e 2.1.2, con l'eccezione che i media preriscaldati è co-coltura, composto da Neurobasal medium + supplemento di B-27 del 2% (per i neuroni) + 1% G-5 privo di siero supplemento (astrociti) + 0,25% L-glutammina.
    2. Eutanasia ratti Sprague-Dawley temporizzato-gravidanza giorno embrionale 18 con anidride carbonica asfissia e confermare la morte per decapitazione.
    3. Estrarre i feti di ratto e sezionare le cortecce dal resto del tessuto cerebrale in capsule di Petri contenente HBSS sulla superficie del blocco di granito refrigerati, utilizzando uno stereoscopio per guida visiva e forbici sterilizzate, microscalpel e forcipe53 . Dopo la dissezione successiva delle teste, cervello, emisferi cerebrali e cortecce, trasferire ogni tessuto per una nuova scatola di Petri HBSS-riempito.
    4. Tritare il tessuto corticale in frammenti più piccoli per aumentare l'area per la tripsina. Trasferimento nelle cortecce di 4-6 con un Pasteur pipettare in una provetta con 5 mL di tripsina-EDTA preriscaldato e mantengono a 37 ° C per dissociare il tessuto. A 5-7 min agitare manualmente il tubo per mescolare ed evitare l'agglutinamento del tessuto.
    5. Rimuovere il tubo da 37 ° C dopo 10 min. Come spiegato in precedenza nel passaggio 2.1, estrarre la tripsina-EDTA e sostituire con 1,8 mL di 0,15 mg/mL soluzione dnasi. In seguito, vortice il tessuto fino a quando la soluzione appare omogeneo, con nessun frammenti di tessuto galleggiante nel liquido.
    6. Centrifugare la soluzione dissociata tessuto a 200 x g per 3 min. Dopo aver rimosso il sovranatante, risospendere in 2 mL di mezzo di co-coltura. Contare il numero di cellule in questa soluzione con un contatore automatico delle cellule o un emocitometro.
      Nota: La resa di solito è 3.0-5.0 x 106 cellule/corticale emisfero.
    7. Preparare una nuova soluzione di cella con una densità di 2.0-4.0 x 105 cellule/mL in co-coltura sopra definito.

3. sviluppo dei cavi Astrocytic all'interno delle Micro-colonne

  1. Montaggio centro ECM
    Nota: L'ECM dovrà essere aggiunto all'interno dell'idrogel micro-colonne nello stesso giorno in cui semina cellulare verrà eseguita.
    1. All'interno di una cappa di biosicurezza, preparare un 1 mg/mL soluzione di coda di topo collagene di i tipo mezzo di co-coltura in una provetta da microcentrifuga sterile. Mantenere il tubo del microcentrifuge con la soluzione di ECM su ghiaccio sempre eccetto quando in uso.
    2. Trasferire 1-2 µ l della soluzione ECM con una micropipetta su una striscia di cartina al tornasole per valutare il suo pH. Aggiungere 1 µ l di 1 N di idrossido di sodio (NaOH) o acido cloridrico (HCl) con una micropipetta per aumentare o diminuire il pH della soluzione ECM, rispettivamente e pipettare su e giù per omogeneizzare. Verificare il pH di nuovo con una striscia di carta di tornasole e aggiungere più acido o base, se necessario, fino a quando il pH è stabile nell'intervallo di 7,2-7,4.
    3. Spostare le piastre di Petri da passo 1.2 un cappuccio di dissezione e trasferimento di 4-5 micro-colonne o una barca con una pinzetta sterile un vuoto, sterile 35 o 60 mm di Petri. Usando lo stereoscopio come guida, situare la punta di 10 µ l di una micropipetta a un'estremità di ogni micro-colonna e aspirazione per svuotare il lume delle bolle di aria e DPBS. Verificare l'assenza di bolle d'aria con lo stereoscopio per garantire che l'ECM aggiunto nel passaggio successivo può fluire liberamente attraverso il lume.
    4. Caricare una micropipetta P10 con soluzione di ECM, posto il 10 µ l punta contro un'estremità di idrogel micro-colonne e fornire una soluzione abbastanza per riempire il lume (circa 3-5 µ l), osservando la voce di ECM con lo stereoscopio. Pipettare un piccolo serbatoio (2-4 µ l) di soluzione di ECM su entrambe le estremità della micro-colonna.
      Nota: Il gestore sempre 4-5 micro-colonne o una barca alla volta per evitare prolungata essiccazione dei costrutti, come questo può provocare la sgualcendo della struttura micro-colonna. Micro-colonne completamente asciutto applicare saldamente alla superficie delle capsule di Petri, che impedisce il loro utilizzo per la semina delle cellule. Una quantità eccessiva di co-coltura (come una misura di idratazione) non è possibile aggiungere alle micro-colonne, perché ciò potrebbe causare l'ECM di fuoriuscire durante il periodo di incubazione descritto di seguito.
    5. Pipetta di co-coltura in un anello intorno alla capsula di Petri per fornire un sink di umidità per evitare che le colonne secchino durante l'incubazione. Incubare la capsula di Petri contenente le micro-colonne contenenti ECM a 37 ° C e 5% di CO2 per 1 h promuovere la polimerizzazione di collagene prima di aggiungere i neuroni e/o astrociti.
      Nota: L'ECM dovrebbe formare uno strato di rivestimento della superficie interna del lume cavo, piuttosto che un nucleo solido di ECM che comprende l'interno, entrambi i quali possono essere osservati utilizzando lo stereoscopio. Se l'ECM costituisce un nucleo, continuare il periodo di incubazione fino a quando non viene lasciato solo il livello. Con questo strato formato, la soluzione delle cellule astrocitarie possa riempire l'interno della micro-colonna nei passaggi placcatura.
    6. Durante il periodo di incubazione, è necessario preparare la soluzione di cella di astrociti (come descritto di seguito).
  2. Astrociti e neuroni semina nelle Micro-colonne
    1. Come spiegato nella procedura 2.1.16-2.1.19 del passaggio gli astrociti placcati (tra il quarto e dodicesimo passaggio). Dopo il conteggio del numero di cellule nel pallone, preparare la soluzione di cella ad una densità di 9.0-12.0 x 105 cellule/mL soluzione sospesa nei mezzi di coltura cellulare.
    2. Con uno stereoscopio, posizionare la punta di una micropipetta P10 a un'estremità della micro-colonne e trasferire sufficiente soluzione di cella (~ 5 µ l) nel lumen per riempirlo completamente. Come fatto in precedenza con la ECM, aggiungere piccoli invasi di soluzione di cella a entrambe le estremità di ogni micro-colonna.
    3. Incubare il placcato micro-colonne sui piatti Petri a 37 ° C e 5% di CO2 per 1 h a promuovere l'attaccamento dei astrocytes alla ECM. Se i neuroni non verranno aggiunti al micro-colonne, passare al punto 3.2.5.
    4. Dopo il periodo di incubazione iniziale, aggiungere 1-2 µ l di soluzione neurone corticale ottenuta al passaggio 2.2.7 in entrambe le estremità delle micro-colonne con una micropipetta, osservando sotto lo stereoscopio. Assicurare che i media sufficienti è presenti nei piatti per evitare la disidratazione e incubare nuovamente per 40 min a 37 ° C e 5% di CO2 per consentire l'adesione dei neuroni.
      Nota: Soluzione di neurone corticale può essere aggiunto anche 1-2 giorni dopo la formazione di bundle, esecuzione passo 3.2.4 dopo aver accuratamente tolto terreni di coltura di Petri con una micropipetta.
    5. Dopo l'incubazione periodo, attentamente riempire le capsule di Petri contenente il placcato micro-colonne con 3 o 6 mL di co-coltura per 35 o 60 mm di Petri, rispettivamente. Mantenere la micro-colonne placcate in coltura a 37 ° C e 5% di CO2 per promuovere l'auto-assemblaggio dei fasci astrocytic allineati, che dovrebbero formare una struttura in dotazione, cavo-come dopo 6-10 h.
  3. Stabilizzazione del Astrocyte cavo architettura
    Nota: Dopo la formazione di fasci, circa 6-12 h di coltura i costrutti, procedere come segue per evitare il collasso della struttura allineata la chiodatura astrocytic.
    1. In una microcentrifuga sterile, preparare un collagene di coda di ratto 3mg/mL ho soluzione in co-coltura. Regolare il pH della soluzione a 7.2-7.4 seguendo la procedura descritta al punto 3.1.2. Mantenere il collagene Stock in co-coltura e mezzi su ghiaccio quando non in uso e mettere la soluzione di collagene preparati sul ghiaccio in ogni momento.
    2. Rimuovere il supporto dai piatti Petri contenente i ponteggi astrocitari con una micropipetta, lasciando alcuni supporti ai lati del piatto per creare un sink di umidità che assicura l'idratazione delle micro-colonne. Mettere il recipiente sotto uno stereoscopio per facilitare la visualizzazione.
    3. Con una micropipetta, prendere 2-3 µ l di soluzione di collagene e scarico a ciascuna estremità delle micro-colonne, utilizzando lo stereoscopio per la guida ottica. Assicurarsi che il piatto ha sufficienti media intorno ai lati di agire come un lavandino di umidità intorno ai bordi del piatto. Incubare le piastre di Petri con micro-colonne per 30 min a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore per promuovere la gelificazione del collagene appena aggiunto.
    4. Aggiungere lentamente 3 o 6 mL di co-coltura (per 35 o 60 mm piastre di Petri, rispettivamente) per il Petri piatti con una pipetta e cultura i piatti in un incubatore a 37 oC e 5% CO2.

4. estrazione dei fasci Astrocytic dall'interno dell'idrogelo

  1. Sterilizzare i vetrini coprioggetti in autoclave. Preparare una soluzione di 20 µ g/mL di poli-L-lisina (PLL) in acqua di grado di cultura cellulare sterile.
  2. All'interno di una cappa di biosicurezza, manualmente trasferire i coprioggetti di vetro sterilizzati un sterile 10cm di Petri e aggiungere soluzione di PLL sufficiente per coprire i vetrini coprioggetti.
  3. Incubare i vetrini coprioggetti, coperti con la soluzione PLL, per 30 min a 37 ° C per rivestire la superficie. Rimuovere la soluzione PLL con una pipetta Pasteur dopo 30 min. Sciacquare tre volte aggiungendo acqua di grado di cultura cellulare il vetrino coprioggetto e rimuoverlo con una pipetta Pasteur.
  4. Dopo la formazione del fascio glial allineato, trasferire la micro-colonna delicatamente una capsula di Petri sterile con una pinzetta sterile e aggiungere una piccola piscina di 10 µ l di co-coltura con una micropipetta per prevenire la disidratazione e garantire salute bundle. Estrarre il pacchetto astrocytic dalla micro-colonna idrogel tirando delicatamente da un lato con il forcipe chirurgico sterile, utilizzando uno stereoscopio per la guida ottica.
  5. Tenendo il bundle astrocitario con forcipe, montarlo su un vetrino coprioggetti rivestite con PLL. Difficoltà e macchia con il protocollo sottostante.

5. immunocitochimica per studi In Vitro

Nota: Per questo studio, gli anticorpi primari erano la proteina fibrillare acida anti-glial coniglio (GFAP) (1: 500), topo anti-β-tubulina III (1: 500), rabbit anti-collagene ho (1: 500), mouse anti-nestina (1: 200) e coniglio anti-vimentin (1: 100). Gli anticorpi secondari erano asino anti-topo 568, asino 568 anti-coniglio, anti-coniglio di asino 488 e asino anti-mouse 568 (1: 500 per tutti). In tutti i casi, aggiungere un volume sufficiente di ogni soluzione per coprire interamente il micro-colonne.

  1. Preparare una soluzione di formaldeide 4% volume/volume (v/v) in 1 x DPBS all'interno di una cappa chimica.
    Attenzione: formaldeide è un composto tossico, noto per essere cancerogeni e dovrà essere smaltiti in un contenitore separato. Sempre questo composto all'interno di una cappa chimica di manipolare e utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE) ad esempio un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti.
  2. Nel caso di micro-colonne, scartare i terreni di coltura dai piatti Petri contenente i costrutti con una pipetta Pasteur senza accidentalmente l'aspirazione dei cilindri di idrogel. Aggiungere la soluzione di formaldeide sufficiente per coprire le micro-colonne o lamelle montate (entrambi dei quali rimangono sui piatti Petri) e incubare per 35 min a 18-24 ° C.
  3. Estrarre la soluzione di formaldeide 4,0% da micro-colonne fisse o lamelle con una pipetta sierologica. Sciacquare il micro-colonne fisse tre volte con PBS rapidamente aggiungendo e rimuovendo PBS due volte e poi lasciarli ammollo per 10 min la terza volta.
  4. Sciogliere di siero equino normale (NHS) in PBS per una concentrazione del 4% v / v. preparare una soluzione con un detergente non ionico ad una concentrazione di 0,3% v/v utilizzando la soluzione di NHS come solvente.
  5. Rimuovere il PBS dalle capsule di Petri contenente le micro-colonne o lamelle con una pipetta. Aggiungere sufficiente soluzione detergente 0,3% per coprire le micro-colonne/coprioggetti per 60 min a 18-24 ° C per permeabilize le cellule.
  6. Estrarre la soluzione detergente e sciacquare rapidamente due volte con PBS e tre volte da ammollo per 5 min, calcolare il volume richiesto di 4% NHS e ciascuno degli anticorpi primari per preparare una soluzione con le concentrazioni nell'anticorpo desiderato.
  7. Rimuovere il PBS dalle capsule di Petri e aggiungere abbastanza anticorpo primario (diluito in 4% NHS-DPBS) soluzione per coprire il micro-colonne o i pacchetti estratti astrocytic. Incubare per una notte (12-16 h) a 4 ° C.
  8. Togliere la soluzione di anticorpo primario e sciacquare rapidamente due volte con PBS e tre volte da ammollo per 5 minuti ciascuno. Preparare la soluzione di anticorpo secondario, al buio, con ogni anticorpo presente ad una diluizione di 1: 500 in soluzione di NHS 4,0%.
  9. Incubare le cellule con la soluzione di anticorpo secondario per 2 h 18-24 ° c. Durante l'intero periodo di incubazione, coprire le capsule di Petri contenente le micro-colonne con carta stagnola per evitare l'esposizione alla luce.
  10. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario ed aggiungere la soluzione di Hoechst (01:10, 000) per 10 min a 18-24 ° C a macchiare i nuclei.
    Attenzione: Hoechst è un noto agente mutageno che deve essere trattato come un agente cancerogeno. Pertanto, esso deve essere smaltito in un contenitore separato e PPE deve essere utilizzato in qualsiasi momento durante la manipolazione di questo agente.
  11. Risciacquare con PBS cinque volte, ogni volta per 5-10 min. in seguito, memorizzare il macchiato micro-colonne a 4 ° C in PBS e coprire con carta stagnola. Nel caso i fasci astrocytic montati, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio acquoso all'aggregazione, posizionare un altro vetrino coprioggetti sopra il fascio fisso e sigillare entrambe le lamelle con smalto per immagazzinaggio a lungo termine e la formazione immagine successiva.

6. analisi di attuabilità con Live-morti (calceina-AM/etidio omodimero) colorazione

  1. Preparare la soluzione di reagente aggiungendo 5 μl calceina (4 mM in anidro dimetilsolfossido (DMSO)) e 20 μl omodimero di etidio-1 (EthD-1) (2 mM in DMSO/H2O 1:4 v/v) a 10 mL di 1 x DPBS. Coprire la soluzione con carta stagnola o conservare al buio per proteggerlo dalla luce.
  2. Aspirare la media dalla capsula di Petri contenente le micro-colonne placcate con una pipetta Pasteur e aggiungere soluzione abbastanza (preparata in precedenza) per coprire i costrutti. Incubare per 30 min a 37 ° C e 5% CO2, mantenendo la piastra di Petri coperto per proteggere la soluzione dalla luce.
  3. Rimuovere la soluzione con una micropipetta o pipetta Pasteur. Sciacquare 2 - 3 volte con DPBS come spiegato al punto 5.3. Inondare le capsule di Petri con DPBS secondo la dimensione del piatto. Celle di immagine immediatamente in seguito con epifluorescenza o imaging confocale.
    Nota: Conversione della membrana permeabile calceina a calceina di cellule metabolicamente attive produce la fluorescenza verde della calceina. Le cellule morte vengono contrassegnate come cellule membrana-compromessi, che permettono l'entrata di EthD-1 nella cella e il suo legame con gli acidi nucleici, causando la fluorescenza rossa.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inizialmente, a contrasto di fase microscopia è stata usata per monitorare la progressione della formazione di adesione e bundle di astrociti e la stabilità generale della citoarchitettura come funzione del tempo. A 1 h dopo il placcaggio, gli astrociti sono stati trovati in tutto il lume delle micro-colonne con una morfologia sferica (Figura 2A). A 5 h, astrociti iniziato estendendo i processi e contraenti, mentre da 8 h cellule hanno esibito una morfologia ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rispetto per l'ambiente più favorevole del PNS, il CNS è notevolmente ridotto a gestire le conseguenze pregiudizievoli di neurotrauma e neurodegenerazione. Dopo un grave insulto al sistema nervoso centrale dei mammiferi, si forma una cicatrice gliale, costituito un nucleo di cellule infiammatorie e fibrotiche circondata da un denso reticolo di astrociti reattivi disorganizzati che secernono assone escrescenza-inibizione proteoglicani14. Questa cicatrice agisce come un'ostruzione fisica e biochimic...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sostegno finanziario è stato fornito dal National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [terapeutico Pipeline programma #9998 (Cullen)], Penn medicina Neuroscience Center Pilot Award (Cullen), National Science Foundation [Graduate Research Fellowships DGE-1321851 (Struzyna)], Department of Veterans Affairs [RR & D merito recensione B1097 #-ho (Cullen)] e l'US Army Medical Research e Materiel Command [n #W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago per agopuntura (300 µ m di diametro)Lhasa MedicalHS.30x40Il diametro può essere variato in base alla dimensione desiderata per il lume della microcolonna.
Piastra di PetriFisher08772B
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)Invitrogen14200075
Polistirene pipetta sierologica monousoFisher13-678-11D
AgarosioSigmaA9539-50G
Tubo capillare in vetro da microlitro (701 µ m)Fisher21-170JIl diametro può essere variato in base alla dimensione desiderata per il guscio della microcolonna.
Distributore di lampadine a microtappoFisher21-170JBulb viene fornito con i tubi a microtappo.
Piastra riscaldanteFisherSP88857200
Barra magneticaFisher1451352
MicropipettaSigmaZ683884-1EA
Ago calibro 25 mmFisher14-826-49
MicrobisturiRoboz SurgicalRS-6270
ForbiciFine Science Tools14081-09
PinzeWorld Precision Instruments501985
Sterilizzatore a perline caldeSigmaZ378550-1EA
StereoscopioNikonSMZ800N
Micro-spatolaFisherS50821
Coda di ratto di tipo Icollagene Corning354236Mantenere a 4 º C e rimuovere solo quando necessario. Usa il ghiaccio per preservarne la temperatura quando è in uso.
Provetta per microcentrifugaFisher02-681-256
Idrossido di sodio (NaOH)FisherSS2661
Acido cloridrico (HCl)FisherSA48-1
Cartina di tornasoleFisher09-876-18
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)Invitrogen14170112Conservare a 4 ºC.
0,25% Tripsina-EDTAInvitrogen 25200056Negozio a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
Desossiribonucleasi pancreatica bovina (Dnase) ISigma10104159001Store a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con Ham's F-12 Nutrient MixtureGibco11330-032Conservare a 4 ºC.
Siero fetale bovino (FBS)Atlanta BiologicalsS11195Store a -20ºC.
Postnatale giorno 0 o giorno 1 Sprague Dawley cuccioli di rattoCharles RiverCeppo 001
Neuroneurone embrionale neurobasale medio basaleInvitrogen21103049Negozio a 4º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
Integratore senza siero B-27Invitrogen12587010Store a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
L-glutamminaInvitrogen35050061Negozio a -20 º C e caldo a 37 º C prima dell'uso.
Integratore astrocitario G5Invitrogen17503012
Sprague Dawley embrionale giorno 18 rattiCharles RiverStrain 001
Pipetta PasteurFisher22-042816
Provetta da centrifuga da 15 mlEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
CentrifugaFisher05-413-115
EmocitometroFisher02-671-6
IncubatriceFisher13 998 076
Formaldeide 40%FisherF77P-4La formaldeide è un composto tossico noto per essere cancerogeno e deve essere smaltito in un contenitore separato.
Vetrino coprioggettoFisher12-548-5M
Smalto per unghieMicroscopia elettronica Scienze (EMS)72180
Fluoromont mezzo di montaggioSouthern Biotech0100-01
Poli-L-lisinaSigmaP4707
Soluzione salina tamponata con fosfatoFisherBP3994
Triton X-100SigmaT8787
Siero di cavallo normaleGibco16050-122
Anticorpo primario contro la proteina fibrillare acida gliale di coniglio (GFAP)MilliporeAB5804Conservare a -20ºC.
Anticorpo primario anti-beta-tubulina III di topoSigmaT8578Conservare a -20ºC.
Anticorpo primario anti-collagene I di coniglioAbcamab34710Conservare a -20ºC.
Coniglio anti-vimentinaMilliporeAB3400Store a -20ºC.
Topo anti-nestinaMilliporeAB5326Negozio a -20ºC.
Asino anti-topo 568 anticorpo secondarioInvitrogenA10037Negozio a 4ºC.
Asino anti-coniglio 568 anticorpo secondarioInvitrogenA10042Negozio a 4ºC.
Asino anti-coniglio 488 anticorpo secondarioInvitrogenA21206Store a 4ºC.
Hoechst 33342, tricloridratoInvitrogenH3570Negozio a 4ºC. Hoechst è un noto mutageno che dovrebbe essere trattato come cancerogeno. Pertanto, deve essere smaltito in un contenitore separato.
Calcein AMSigmaC13594 mM in DMSO anidro
Omodimero di etidio-1Life TechnologiesE11692 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimetilsulfoxano (DMSO)Sigma276855
A1RSI Laser Scanning Confocal MicroscopeNikonUtilizzato per effettuare le ricostruzioni confocali di costrutti immunomarcati.
Eclipse Ti-S MicroscopioNikonUtilizzato per scattare le immagini a contrasto di fase. Con acquisizione di immagini digitali tramite fotocamera QiClick interfacciata con il software Nikon Elements Basic Research (4.10.01).

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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