Questo studio presenta una tecnica per l'isolamento dei neuroni da topi neonatali WT. Richiede l'attenta disezione del midollo spinale dal topo neonatale, seguita dalla separazione dei neuroni dal tessuto del midollo spinale attraverso la scissione meccanica ed enzimatica.
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Articolo metodologico
Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Presentiamo un protocollo per l'isolamento e la cultura dei neuroni del midollo spinale. I neuroni sono ottenuti da topi neonatali C57BL / 6 e sono isolati nel giorno postnatalo 1-3. Un cucciolo di topo, di solito 4-10 cuccioli nati da una coppia di allevamento, viene raccolto per un esperimento e le corde spinali vengono raccolte individualmente da ciascun mouse dopo eutanasia con isoflurano. La colonna vertebrale viene disseccata e poi il midollo spinale viene rilasciato dalla colonna. I cavi spinali vengono quindi macinati per aumentare la superficie di consegna per una proteasi enzimatica che consente di liberare i neuroni e altre cellule dal tessuto. La triturazione viene poi usata per liberare le cellule in soluzione. Questa soluzione viene successivamente frazionata in un gradiente di densità per separare le varie cellule in soluzione, consentendo il isolamento dei neuroni. Circa 1-2,5 x 10 6 neuroni possono essere isolati da un gruppo di letti. I neuroni vengono poi seminati su pozzetti rivestiti di facto adesivoR che permettono una corretta crescita e maturazione. I neuroni richiedono circa 7 giorni per raggiungere la maturità nel mezzo di crescita e coltura e possono poi essere utilizzati per il trattamento e l'analisi.
Introduzione
La comprensione della patologia del midollo spinale richiede l'uso di vari modelli, sia a livello macroscopico che microscopico. I modelli animali grandi e piccoli 1 , 2 , 3 sono usati per le indagini in vivo di malattie del midollo spinale e lesioni. Mentre studia questi problemi in vivo ha i suoi meriti, l'analisi del midollo spinale è limitata all'intero homogenato del midollo spinale o alle sezioni del tessuto 4 . Ciò crea qualche ambiguità quando si cerca di isolare risposte e obiettivi specifici nel midollo sp....
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Protocollo
La cura e il trattamento degli animali in questa procedura sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale di cura e uso degli animali presso l'Università del Colorado.
1. Preparazione delle soluzioni
- Preparare e conservare tutte le soluzioni a temperature adeguate, come mostrato nella Tabella 1 .
2. Rivestimenti di pozzetti e diapositive
NOTA: i neuroni non aderiscono bene a superfici in plastica o vetro.
- Un giorno prima dell'isolamento dei neuroni, coprire i pozzetti di una piastra di coltura a 2....
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Risultati
Utilizzando questa tecnica, una singola lettiera (4-10 cuccioli) consente l'isolamento di 1-2,5 10 neuroni adatti per l'invaso su piastre di coltura. Tipicamente, 4-8 pozzetti vengono seminati alla concentrazione menzionata sopra ( cioè 300.000 cellule / ml). La Figura 3 mostra l'apparenza dei neuroni a questa concentrazione dopo una settimana di coltura a microscopia leggera di ingrandimento ( a ) e ad alta ( b<.......
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Discussione
Questa tecnica consente la cultura affidabile dei neuroni del midollo spinale. Una volta raggiunta la conoscenza della tecnica, ci vogliono circa 3,5 ore per completare. Siamo stati in grado di effettuare l'isolamento dei neuroni da 2 cucciolate separate (16 topi totali) in circa 4 h. Il passo fondamentale della fattibilità è poter estrarre efficacemente i cavi spinali dai topi. La resa consente di plating diversi pozzetti e per la capacità di testare i neuroni in varie condizioni. Siamo stati in grado di trattare i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcuna divulgazione.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno alcun riconoscimento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ibernazione A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Ibernazione A Meno Calcio - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| Integratore B27 50X - 10 ml di | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papaina, liofilizzata - 100 mg | di Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Bromuro di poli-D-lisina (PDL) - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Laminina di topo - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Diclorodimetilsilano ( | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | |
| http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US Cloroformio | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Pippette in vetro - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipetta a bulbo - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| MARCA® Piastra di Petri, vetro - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Piastra sterile per coltura cellulare a 24 pozzetti | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (camera di conteggio in vetro) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| vetrini - vetro di copertura sterile da 12 mm - non rivestito | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Anticorpo monoclonale di coniglio - 100 &; L | Abcam | ab177487 | Dopo il fissaggio in paraformaldeide (PFA) e il blocco con BSA al 5%, le cellule su un vetrino coprioggetti da 12 mm sono state incubate nell'anticorpo diluito 1:200 per 18 ore in 4 gradi |
| C MAP-2 Anticorpo monoclonale di topo - 50 &; L | Abcam | ab11267 | Dopo il fissaggio in paraformaldeide e il blocco con BSA al 5%, le cellule su un vetrino coprioggetti da 12 mm sono state incubate nell'anticorpo diluito 1:500 per 18 ore in 4 gradi E |
Riferimenti
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ische....
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Ristampe e permessi
