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Articolo metodologico

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

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DOI:

10.3791/55857

⸱

7 giugno 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 2Division of Vector-Borne Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive il recupero del virus infettivo da Zika da un clone infetto cDNA a due plasmide.

Abstract

I cloni infetti cDNA consentono la manipolazione genetica di un virus, facilitando così il lavoro sui vaccini, la patogenesi, la replicazione, la trasmissione e l'evoluzione virale. Qui descriviamo la costruzione di un clone infettivo per il virus Zika (ZIKV), che attualmente sta causando uno scoppio esplosivo nelle Americhe. Per evitare la tossicità per i batteri che è comunemente osservato con i plasmidi derivati ​​da flavivirus, abbiamo generato un sistema a due plasmidi che separa il genoma al gene NS1 ed è più stabile di quelli a piena lunghezza che non possono essere recuperati con successo senza mutazioni. Dopo la digestione e la legatura per unire i due frammenti, l'RNA virale a piena lunghezza può essere generato mediante trascrizione in vitro con T7 RNA polimerasi. Dopo l'elettroporazione di RNA trascritto nelle cellule, è stato recuperato il virus che ha mostrato simili cinetica di crescita in vitro e fenotipi di virulenza e infezione in vivo nei topi e nelle zanzare rispettivamente.

Introduzione

Il virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) è un flavivirus dalle zanzare che è arrivato in Brasile nel 2013-14 ed è stato successivamente associato ad un massiccio focolaio di malattia febbrile che si è diffuso in tutte le Americhe 1 . Inoltre, ZIKV è stato collegato a gravi conseguenze della malattia, come la sindrome di Guillain-Barré negli adulti e la microcefalia nei feti e nei neonati 2 . Poco noto su ZIKV prima della sua diffusione rapida nell'emisfero occidentale. Ciò comprendeva la mancanza di strumenti molecolari, ostacolando così la ricerca meccanicistica. Gli strumenti molecolari per i virus, come i cloni infetti cDNA, facilitano il vaccino e lo sviluppo terapeutico antivirale e consentono la valutazione dei fattori genetici virali correlati alla patogenesi virale differenziale, alla risposta immunitaria e all'evoluzione virale.

I cloni infettivi di Flavivirus sono noti per essere altamente instabili nei batteri dovuti alla crI promotori prokaryotici yptici presenti nei loro genomi 3 . Sono stati utilizzati diversi approcci per migliorare questo problema; Incluso l'inserimento di ripetizioni tandem a monte delle sequenze virali 4 , la mutazione di sequenze 5 di promoter prokaryotiche presunte, suddividendo il genoma in plasmidi multipli 6 , vettori di numeri a bassa copia (compresi i cromosomi artificiali batterici) 7 , 8 e l'inserimento di introni nel genoma virale 9 . Un sistema a tutta lunghezza senza modifiche è stato descritto per ZIKV; Tuttavia, questo clone sembrava essere attenuato nella coltura cellulare e nei topi 10 . Altri gruppi hanno introdotto gli introni nel genoma ZIKV, consentendo la distruzione di sequenze instabili nei batteri che possono essere splicate in cellule di mammiferi in vitro per la produzione di virus infettivo 11, 12 . Inoltre, un sistema basato su PCR intitolato Infectious-Subgenomic-Amplicons è stato usato con successo per salvare il prototipo MR766 ceppo di ZIKV 13 . L'approccio qui descritto non richiede sequenze straniere, ma disturba il genoma nella regione di elevata instabilità usando plasmidi multipli, precedentemente impiegati con successo con la febbre gialla 6 , i dengue 14 , 15 e i virus del West Nile 16 . Inoltre, l'aggiunta della sequenza ribozima di epatite D alle terminazioni genomiche virali facilita la creazione di un'autentica 3 'estremità senza la necessità di aggiungere un sito di linearizzazione. Inoltre, entrambi i plasmidi sono costruiti in un vettore di numero di copie basse (pACYC177, ~ 15 copie per cellula) per mitigare ogni tossicità residua 17 . Il virus recuperato mostra un profilo di crescita comparabile aVirus parenterale in curve di crescita in vitro in 8 linee cellulari comprendenti una varietà di tipi di cellule derivanti da entrambi i mammiferi e dagli insetti e ha mostrato identici profili patogeni nei topi e nelle infezioni, diffusione e velocità di trasmissione nelle zanzare 18 .

Qui abbiamo un protocollo che descrive come coltivare i plasmidi infetti del clone, generare in vitro l' RNA virale a piena lunghezza (il genoma virale) e recuperare il virus infettivo nella coltura cellulare. In primo luogo, descriviamo la propagazione di plasmidi in batteri o amplificazione senza batteri usando l'amplificazione del cerchio di rotolamento (RCA). Successivamente, mostriamo come i due plasmidi vengono digeriti e successivamente legati insieme per generare virus a piena lunghezza. Infine, descriviamo la produzione di RNA trascritto e la sua successiva elettroporazione in cellule Vero, seguita da una titolazione del virus recuperato ( Figura 1 ). L'approccio descritto è rapido, permettendo perR recupero di scorte di virus infettive in 1-2 settimane.

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Protocollo

1. Trasformazione e recupero dei plasmidi di cloni infettivi

  1. Trasformare entrambi i plasmidi (separatamente) utilizzando un protocollo di trasformazione commerciale ( ad esempio , NEB 5 Minute Transformation Protocol) con alcune modifiche. Entrambi i plasmidi contengono un gene che codifica per la resistenza all'ampicillina, quindi utilizzare ampicillina o carbenicillina per la selezione. La carbenicillina è preferita, in quanto è più stabile.
    1. Rimuovere le celle (vedere tabella dei materiali) da congelatore da -80 ° C e scongelare su ghiaccio per 5-10 min. Brodo Lysogeny (LB) (contenente 10 g / L NaCl e 25 μg / mL carbenicillina, chiamato LB-carb) e il brodo con repressione catabolita (SOC (senza antibiotici) - venuta con le cellule) a 37 ° C.
    2. Aggiungere fra 100 pg-10 ng in 1 μl di plasmide DNA in un tubo contenente 50 μL di cellule competenti; Mescolare delicatamente spostando il tubo.
    3. Incubare i tubi in ghiaccio per 5 min.
    4. Tubazioni a scossa termica a 42 ° C per 30 sIn un bagno d'acqua. Ritorna al ghiaccio per 2 minuti subito dopo lo shock termico.
    5. Pipettare 950 μL di temperatura ambiente SOC in ogni tubo e mescolare pipettando. Distribuire 100 μL di miscela batterica su un piatto di LB-carb e incubare per una notte a 37 ° C (circa 12-14 h).
  2. Rimuovere le piastre da incubatore a 37 ° C dopo 12-14 h di incubazione. Posizionare le piastre in un cassetto scuro a temperatura ambiente per permettere alle colonie di continuare a crescere (circa 8-9 h).
  3. Utilizzando 5 ml di brodo Terrific (TB, contenente 25 μg / mL di carbenicillina, chiamato TB-carb), coltivate 5-10 piccole colonie per ogni plasmide per una notte a 30 ° C in un agitatore batterico (circa 14-16 h).
    NOTA: Le piccole colonie sono un indicatore che il plasmide è intatto; Le colonie con plasmidi contenenti delezioni, riarrangiamenti o mutazioni (qui chiamati eventi di instabilità) crescono più velocemente e quindi saranno più grandi. Pertanto, si dovrebbe cercare di prendere le colonie più piccole sul piatto, in particolare noT selezionando le più grandi colonie presenti. Alcune colonie di medie dimensioni possono anche essere selezionate per completezza. La temperatura inferiore utilizzata riduce la probabilità che le cellule si svilupperanno (OD 600 superiore a 0,6-0,8). Poiché la maggior parte dei ricercatori esegue la crescita durante la notte, consente un maggiore controllo e riduzione delle probabilità di sovraesposizione.
  4. Controllare le colture liquide per la torbidità (circa OD 600 di 0,6-0,8). Posizionare eventuali tubi torbidi a 4 ° C e permettere a altri tubi di diventare torbidi crescendo per più tempo.
    NOTA: Non coltivare i batteri ai valori OD 600 maggiori di quelli raccomandati, in quanto possono verificarsi eventi di instabilità plasmidica.
  5. Estrarre il DNA plasmidico da batteri con un kit di miniprep plasmide commerciale (vedi tabella dei materiali). Eluire in 15 μl di pre-riscaldato (a 70 ° C in un blocco di riscaldamento) tampone di eluizione. Lasciare che il buffer di eluizione si incuba sulla colonna per 5 minuti prima della centrifugazione.
    NOTA: conservare almeno 1 ml di questa coltura di starter a 4 ° C perUlteriore utilizzo nella fase successiva.
  6. Digest 10 μL dei plasmidi recuperati per valutare se gli eventi di instabilità del plasmide si sono verificati durante la coltura.
    NOTA: Digest p1 con SalI / NheI e p2 con BamHI / HindIII a 37 ° C per 1 h. Confermare la presenza delle bande corrette dopo la digestione ( Figura 2a ) mediante elettroforesi a gel e procedere al punto 2. Se si prepara il DNA del plasmide mediante l'amplificazione a cerchio di rotolamento (RCA), riservare un po 'di eluato di miniprep per servire come template.

2. Preparazione di un sufficiente DNA plasmidico per la legatura

NOTA: La legatura e la successiva elettroporazione richiedono una quantità sufficiente di DNA plasmidale che deve essere generato tramite maxiprep o RCA. Mentre il maxiprep è l'approccio tradizionalmente utilizzato, RCA offre il vantaggio di non richiedere batteri, eliminando così il potenziale di tossicità indotta dal plasmide nei batteri che possono causare eventi di instabilità.

  1. Eseguire la seguente procedura maxiprep.
    1. Per ciascun plasmide che ha dimostrato il corretto schema di digestione dell'enzima di restrizione nella sezione precedente, aggiungere 500 μl di coltura d'avviamento a 1 L di brodo di TB-Carb (25 μg / mL carbenicillina) e agitare per una notte a 30 ° C (circa 14-16 h , Circa OD 600 di 0,6-0,8).
      NOTA: non consentire alla coltura di crescere oltre questo valore OD 600 . Ciò potenzialmente può determinare eventi di instabilità all'interno dei plasmidi.
    2. Raccogli i batteri e eseguite maxipreps per protocollo del produttore (vedi tabella dei materiali).
  2. Utilizzando il miniprep salvato dal punto 1.6, eseguire quanto segue per la procedura RCA.
    1. Trasferire 1 μl di plasmide DNA in un tubo contenente 50 μl di campione di tampone.
    2. Diluire il campione a 95 ° C per 3 minuti e poi incubare a 4 ° C fino a quando non è pronto per l'uso.
    3. Preparare l'amplificazione commercialePremix (vedi tabella dei materiali ). Combinare 50 μl di tampone di reazione con 2 μl di miscela enzimatica in un tubo posto sul ghiaccio.
      NOTA: La premiscela di amplificazione deve essere mantenuta sul ghiaccio fino a quando non sarà pronta per l'uso. È conveniente preparare un mix master combinando reagenti sufficienti per il numero richiesto di reazioni di amplificazione. Ogni premiscela non utilizzata deve essere scartata.
    4. Trasferire 50 μl di preparata preparata di amplificazione al campione denaturato.
    5. Incubare i tubi di reazione a 30 ° C per 18 ore.
    6. Incubare i tubi a 65 ° C per 10 minuti per inattivare la polimerasi ø29 DNA.
    7. Conservare i tubi di reazione a 4 ° C oa -20 ° C fino all'uso pronto.
      NOTA: A questo punto, il plasmide DNA preparato con entrambi i metodi dovrebbe essere quantificato (utilizzando l'assorbanza a 260 nm) e il genoma ZIKV dovrebbe essere Sanger sequenziato interamente per confermare eventi di instabilità (delezioni e riarrangiamenti) durante la preparazione.
Nome primario Sequenza (5 '- 3')
ZIKV PRVABC59 1For. AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC
ZIKV Conservato 632For. GCCCTATGCTGGATGAGG
ZIKV Conservato 692Rev. GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG
ZIKV Conservato 1313Rev. CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA
ZIKV Conservato 1201For. CCAACACAAGGTGAAGCCTAC
ZIKV Conservato 1663For. GCAGACACCGGAACTCCACACT
ZIKV Conservato 2008For. CAGATGGCGGTGGACATGC
ZIKV conservato 2350Rev. GTGAGAACCAGGACATTCCTCC
ZIKV Conservato 2605Per. TACAAGTACCATCCTGACTCCC
ZIKV Conservato 3499Rev. GCCTTATCTCCATTCCATACCA
ZIKV Conservato 3961Rev. TTGCCAACCAGGCCAAAG
ZIKV Conservato 4132For. CATTTGTCATGGCCCTGG
ZIKV Conservato 4561Rev. CTATTGGGTTCATGCCACAGAT
ZIKV Conservato 4665For. GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT
ZIKV Conservato 5189Rev. AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG
ZIKV Conservato 5219For. GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA
ZIKV Conservato 6086Rev. CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC
ZIKV Conservato 6119Per. GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG
ZIKV Conservato 6721Rev. CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC
ZIKV Conservato 6769Per. CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC
ZIKV Conservato 7209Rev. ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA
ZIKV Conservato 7343Per. GTTGTGGATGGAATAGTGGT
ZIKV Conservato 8243Per. TGCCCATACACCAGCACTATGA
ZIKV PRVABC59 8893Rev. TGCATTGCTACGAACCTTGTTG
ZIKV conservato 9133For. AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA
ZIKV PRVABC59 9673Rev. AACGCAATCATCTCCACTGACT
ZIKV Conservato 9686For. GATGATAGGTTTGCACATGCC
ZIKV Conservato 10321Rev. GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT
ZIKV Conservato 10455Per. CAGGAGAAGCTGGGAAACC
ZIKV Conservato 10621Rev. CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC

Tabella 1: Primer per il sequenziamento di cloni cDNA. I plasmidi possono essere sequenziati interamente con i primer elencati. Primeri contrassegnati come indici "conservati"Che sono probabilmente in grado di sequenziare / amplificare tutti i genotipi di ZIKV. I primer contrassegnati come "PRVABC59" sono specifici a questo ceppo ma possono anche funzionare per altri ceppi di genotipo asiatici e forse altri genotipi.

3. Preparazione di RNA trascritto in vitro

  1. Impostare la reazione di digestione del DNA preparato con maxiprep o RCA.
    1. Per la digestione p1, mescolare 10 μL di tampone di reazione 10x, 3 μL di ApaLI, 3 μL di BamHI-HF, 3 μL di rSAP o CIP e 3,3 μg di DNA p1. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL.
    2. Per la digestione p2, mescolare 10 μl di tampone di reazione 10x, 3 μL di ApaLI, 3 μL di EcoRI-HF e 13,3 μg di DNA p2. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL.
    3. Incubare a 37 ° C per 1-2 ore.
    4. Purificare con un gel commerciale e un kit di pulizia PCR (vedi tabella dei materiali). Eluire in 30 μl di tampone di eluizione pre-riscaldato a 70 ° C in un blocco di riscaldamento (incubare ilColonna per 5 min prima della rotazione).
      NOTA: tenere 1 μL in esecuzione su un gel in seguito.
  2. Preparare la reazione di legame.
    1. Combinare 10 μl di tampone di reazione di DNA di 10x T4, 3 μL di ligasi del DNA di T4 (400 U / μL), 29 μl di p1 purificato e 29 μl di p2 purificato. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL.
    2. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore o 16 ° C per una notte.
    3. Purificare con un gel commerciale e un kit di pulizia PCR (vedi tabella dei materiali). Eluire in 10 μl di tampone di eluizione pre-riscaldato a 70 ° C in un blocco di riscaldamento (incubare colonna per 5 minuti prima della filatura).
      NOTA: tenere 1 μL in esecuzione su un gel in seguito.
  3. Eseguire i plasmidi non digeriti, i plasmidi digeriti e la legatura su un gel agarosico. Il prodotto di legatura dovrebbe avere una banda di peso molecolare superiore (circa 11 kb) rispetto a solo il plasmide digerito, indicando che la legatura ha avuto successo ( Figura 2b ).
  4. Impostare T7 in vitro reazione di trascrizione.
    1. Combinare 10 μL di 2x ARCA / NTP Mix, 2 μL di miscela polimerasi T7 RNA e 8 μL di reazione di legatura purificata per un volume finale di 20 μL.
      NOTA: L'ARCA incluso nel mix è un analogo di protezione che è incorporato esclusivamente nell'orientamento corretto. Gli analoghi di protezione standard possono determinare solo il ~ 50% delle trascrizioni con un tappo nell'orientamento corretto.
    2. Incubare per 4 ore a 37 ° C.
    3. Misurare la concentrazione di RNA tramite uno spettrofotometro UV. Facoltativamente, eseguire un gel agarosante denaturante per confermare la lunghezza del trascritto RNA.

4. Salvataggio del virus infettivo mediante elettroporazione

  1. Giorni prima dell'elettropazione, preparare 1 pallone T182 di cellule Vero (tra T150 e T182 è accettabile, coltivato in DMEM + 10% siero fetale fetale (FBS)) per struttura da recuperare. Includi 1 T182 come un controllo di transforzione falsa. CeDeve essere utilizzato a confluenza del 70-80%.
  2. Quando le cellule sono pronte, posizionare 12 mL / reazione di DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES in un bagno d'acqua riscaldato a 37 ° C.
  3. Staccare le cellule mediante trypsinizzazione con un protocollo standard e recuperare le cellule nel supporto con il 10% di FBS per inattivare la tripsina; Centrifugare le cellule a 150 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  4. Le cellule di lavaggio in soluzione salina fosfato-tampone 1x (PBS), celle di pelleto a 150 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ripetere due volte questo passaggio per un totale di tre lavaggi.
  5. Resuspendere le cellule in 200 μL di RPMI 1640 + 10 mM HEPES (sterile) per # campioni. Trasferire 200 μL di sospensione cellulare in un tubo sterile. Le cellule devono essere di ~ 0,5 x 10 7 cellule / ml.
  6. Aggiungere 20 μL di acqua (controllare la negazione negativa) o 20 μL di RNA (preferibilmente 5-10 μg) prodotta nel passaggio 3.4 ad ogni set di cellule. Mescolare delicatamente facendo scorrere il tubo e trasferire il contenuto del tubo in una cuvetta di elettroporazione di divario di 2 mm.
  7. Impostare un elettrOporatore a 170 V LV, omega (resistenza) a 0 e 950 μF (circa 625 V / cm e 20 ms di tempo per altre macchine). Impostare la resistenza all'impostazione più bassa disponibile, 0 o ∞ se disponibile.
  8. Impulsi una volta e subito aggiungere 600 μL di DMEM +15% FBS +10 mM HEPES che è stato riscaldato nel passaggio 4.2. Sciacquare bene all'interno della cuvetta per rimuovere tutte le celle. Aggiungere le cellule a un pallone di coltura tissutale T75 contenente 10 ml di supporto pre-riscaldato. Rimuovere i supporti aggiuntivi dalla cuvetta utilizzando il contagocce incluso nella cuvetta. Fare attenzione a mantenere la sterilità.
  9. Tappo di turbolenza per mescolare i supporti e le cellule e collocare in incubatore a 37 ° C.
  10. Controllare il giorno successivo per la vitalità delle cellule e farlo ogni giorno fino a quando il 50-75% della morte cellulare viene osservata. La morte cellulare viene osservata confrontando il controllo di elettroporazione.
    NOTA: L'effetto citopatico ZIKV (CPE) è abbastanza pronunciato nelle cellule Vero, provocando cellule arrotondate che si staccano e galleggiano nel mezzo di coltura. abbiamoHa osservato una gamma di 8-10 giorni come ideale per la raccolta.
  11. Raccogliere il supernatante in un tubo conico e centrifugare per rimuovere i detriti cellulari a> 3.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
  12. Rimuovere il supernatante chiarificato in un nuovo tubo e completare con una concentrazione finale del 20% di FBS (da 100% di azione). Inoltre, aggiungere HEPES sterile ad una concentrazione finale di 10 mM come agente tampone per preservare l'infettività del virus mentre è congelato (da uno stelo sterile di 1 M).
  13. Mescolare il virus mediante vortexing e l'aliquota in flaconcini a vite. Conservare a -80 ° C per un utilizzo futuro.

5. Titolazione del virus recuperato

  1. Seguire il numero appropriato di piastre da 6 o 12 pozzetti di cellule Vero il giorno prima della titolazione.
  2. Rimuovere il virus dal congelatore e fare serie di diluizioni 10 volte in DMEM + 2% FBS in tubi o piatti a 96 pozzetti.
    NOTA: Il titolo atteso da cloni recuperati è compreso tra 1 x 10 6 e 5 x 10 7 PFU / mL.
  3. Aggiungi 200 oR 400 μL di ciascuna diluizione in duplice copertura a un pozzetto di una piastra da 12 o 6 pozzetti, rispettivamente.
  4. Posizionare le piastre in incubatore a 37 ° C e scendere ogni 15 minuti per un periodo di adsorbimento di ~ 1-1,5 h.
  5. Rimuovere l'inoculo virale e aggiungere 1 ml di overlay di DMEM-Tragacanth a 12 pozzetti o 2 mL (6 pozzetti) ad ogni pozzetto.
    NOTA: è possibile utilizzare agarosio, agar, metilcellulosa o altri supporti di sovrapposizione qui.
  6. Incubare le cellule in incubatore a 37 ° C per 5 giorni. Il tempo per una corretta formazione delle placche varia a seconda della sovrapposizione utilizzata.
  7. Per fissare le celle, rimuovere le piastre dall'incubatore e coprire decantamente in disinfettante.
  8. Aggiungere un sufficiente 20% di etanolo / 0,1% di violetta di cristallo (CV) ad ogni pozzetto per coprire e turbare per mescolare.
    NOTA: Molti altri fissativi esistono e possono essere usati qui. Inoltre, se si utilizza una sovrapposizione di agarosio o di agar, è possibile utilizzare una seconda sovrapposizione in combinazione con il rosso neutro per visualizzare le placche senza fissaggio. L'etanolo del 20% ha dimostrato di essereEfficace nell'inattivazione dei virus avviluppati negli studi precedenti; Non utilizzare questa quantità per i virus non avvolti in quanto non saranno inattivati 19 .
  9. Incubare le piastre per 30-60 minuti a temperatura ambiente (in un armadio di sicurezza di classe II); Scartare CV (secondo le normative locali) e lavare le piastre con acqua di rubinetto.
  10. Lasciare le piastre per asciugare e contare manualmente le placche.
    NOTA: il riferimento 20 può essere utilizzato come riferimento aggiuntivo per eseguire test di placca.

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Risultati

Il protocollo qui descritto consente di recuperare il virus Zika derivato dal clone infettivo. La manipolazione del sistema clone infettiva a due plasmidi è semplice quando viene eseguita con cura, rispetto alle versioni a piena lunghezza che sono altamente instabili (dati non mostrati). Dopo la digestione e la legatura dei due pezzi distinti, il RNA ricoperto viene prodotto usando la trascrizione in vitro con la T7 polimerasi, che viene poi elettroporato in cellule Ver...

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Discussione

Qui descriviamo un metodo per il recupero di un sistema di clone bipartito di cDNA infettivo per ZIKV. I cloni precedentemente descritti per ZIKV soffrono di attenuazione o richiedono l'aggiunta di introni, rendendo i plasmidi più grandi e impedendo il salvataggio nelle cellule degli insetti. Il virus infettivo può essere recuperato utilizzando il sistema di clonazione a due plasmidi in cellule di mammifero o di insetto (dati non mostrati). Inoltre, il virus recuperato da questo sistema si comporta in modo simile al viru...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero ringraziare Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic e Claudia Rückert per la loro assistenza nella caratterizzazione del virus derivato dal clone. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dell'Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive, NIH con sovvenzioni AI114675 (BJG) e AI067380 (GDE).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NEB Stable CompetentE. coliNew England BioLabsC3040H
Carbenicillina, sale disodicovari
Zyppy Plasmid Miniprep KitZymo ResearchD4036
ZymoPURE Plasmid Maxiprep KitZymo ResearchD4202
SalI-HFNew England BioLabsR3138S20.000 unità/ml
NheI-HFNew England BioLabsR3131S20.000 unità/ml
ApaLINew England BioLabsR0507S10.000 unità/ml
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S20.000 unità/ml
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S20.000 unità/ml
HindIII-HFNew England BioLabsR3104S20.000 unità/ml
illustra Kit di amplificazione TempliPhi 100GE Healthcare Life Sciences25640010
NucleoSpin Gel e PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.5
Fosfatasi alcalina per gamberetti (rSAP)New England BioLabsM0371S1.000 unità/ml
Fosfatasi alcalina, intestinale di vitello (CIP)New England BioLabsM0290S10.000 unità/ml
DNA T4 LigasiNew England BioLabsM0202S400.000 unità/mL
Kit mRNA HiScribe T7 ARCANew England BioLabsE2065S
Vero cellsATCCCCL-81
ECM 630 Sistema di elettroporazione ad alta produttivitàBTX45-0423Sono accettabili altre macchine.
LB Brodo con agar (Miller)SigmaL3147Può essere fatto in casa pure.
Il fantastico brodoSigmaT0918può essere fatto in casa pure.
Petri DishCelltreat229693
Provette per colturaVWR International60818-576
Palloni T75Celltreat229340
Palloni T182Celltreat229350
1x PBSCorning21-040-CV
RPMI 1640 con L-glutamminaCorning10-040-CV
DMEM con L-glutammina e 4,5 g/L di glucosioCorning10-017-CV
Siero fetale bovino (FBS)Atlas BiologicalsFP-0500-A
Polvere di adraganteMP BioMP 104792
Crystal VioletAmresco0528-1006
Etanolo denaturatoVWR InternationalBDH1156-1LP
Piastraa 6 pozzettiCelltreat229106
piastra a 12 pozzettiCelltreat229111
Sequenziamento OligosIDTvedi tabella 1
Qubit 3.0ThermoFisherQubit 3.0altri metodi sono accettabili.
Kit di analisi Qubit dsDNA BRThermoFisherQ32850altri metodi sono accettabili.
Kit di analisi Qubit RNA HSThermoFisherQ32852altri metodi sono accettabili.
La cabina di biosicurezza di classe IIvariaN/AQuesto è necessario per il lavoro con virus vivi.

Riferimenti

  1. Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
  2. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
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