Questo protocollo descrive il recupero del virus infettivo da Zika da un clone infetto cDNA a due plasmide.
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Articolo metodologico
Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika
In questo articolo
Sommario
Abstract
I cloni infetti cDNA consentono la manipolazione genetica di un virus, facilitando così il lavoro sui vaccini, la patogenesi, la replicazione, la trasmissione e l'evoluzione virale. Qui descriviamo la costruzione di un clone infettivo per il virus Zika (ZIKV), che attualmente sta causando uno scoppio esplosivo nelle Americhe. Per evitare la tossicità per i batteri che è comunemente osservato con i plasmidi derivati da flavivirus, abbiamo generato un sistema a due plasmidi che separa il genoma al gene NS1 ed è più stabile di quelli a piena lunghezza che non possono essere recuperati con successo senza mutazioni. Dopo la digestione e la legatura per unire i due frammenti, l'RNA virale a piena lunghezza può essere generato mediante trascrizione in vitro con T7 RNA polimerasi. Dopo l'elettroporazione di RNA trascritto nelle cellule, è stato recuperato il virus che ha mostrato simili cinetica di crescita in vitro e fenotipi di virulenza e infezione in vivo nei topi e nelle zanzare rispettivamente.
Introduzione
Il virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) è un flavivirus dalle zanzare che è arrivato in Brasile nel 2013-14 ed è stato successivamente associato ad un massiccio focolaio di malattia febbrile che si è diffuso in tutte le Americhe 1 . Inoltre, ZIKV è stato collegato a gravi conseguenze della malattia, come la sindrome di Guillain-Barré negli adulti e la microcefalia nei feti e nei neonati 2 . Poco noto su ZIKV prima della sua diffusione rapida nell'emisfero occidentale. Ciò comprendeva la mancanza di strumenti molecolari, ostacolando così la ricerca meccanicistica. Gli ....
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Protocollo
1. Trasformazione e recupero dei plasmidi di cloni infettivi
- Trasformare entrambi i plasmidi (separatamente) utilizzando un protocollo di trasformazione commerciale ( ad esempio , NEB 5 Minute Transformation Protocol) con alcune modifiche. Entrambi i plasmidi contengono un gene che codifica per la resistenza all'ampicillina, quindi utilizzare ampicillina o carbenicillina per la selezione. La carbenicillina è preferita, in quanto è più stabile.
- Rimuovere le celle (vedere tabella dei materiali) da congelatore da -80 ° C e scongelare su ghiaccio per 5-10 min. Brodo Lysogeny (LB) (contenente 10 g / L NaCl e 25 μg / mL car....
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Risultati
Il protocollo qui descritto consente di recuperare il virus Zika derivato dal clone infettivo. La manipolazione del sistema clone infettiva a due plasmidi è semplice quando viene eseguita con cura, rispetto alle versioni a piena lunghezza che sono altamente instabili (dati non mostrati). Dopo la digestione e la legatura dei due pezzi distinti, il RNA ricoperto viene prodotto usando la trascrizione in vitro con la T7 polimerasi, che viene poi elettroporato in cellule Ver.......
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Discussione
Qui descriviamo un metodo per il recupero di un sistema di clone bipartito di cDNA infettivo per ZIKV. I cloni precedentemente descritti per ZIKV soffrono di attenuazione o richiedono l'aggiunta di introni, rendendo i plasmidi più grandi e impedendo il salvataggio nelle cellule degli insetti. Il virus infettivo può essere recuperato utilizzando il sistema di clonazione a due plasmidi in cellule di mammifero o di insetto (dati non mostrati). Inoltre, il virus recuperato da questo sistema si comporta in modo simile al viru.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero ringraziare Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic e Claudia Rückert per la loro assistenza nella caratterizzazione del virus derivato dal clone. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dell'Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive, NIH con sovvenzioni AI114675 (BJG) e AI067380 (GDE).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillina, sale disodico | vari | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20.000 unità/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20.000 unità/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10.000 unità/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20.000 unità/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20.000 unità/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20.000 unità/ml |
| illustra Kit di amplificazione TempliPhi 100 | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel e PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Fosfatasi alcalina per gamberetti (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1.000 unità/ml |
| Fosfatasi alcalina, intestinale di vitello (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10.000 unità/ml |
| DNA T4 Ligasi | New England BioLabs | M0202S | 400.000 unità/mL |
| Kit mRNA HiScribe T7 ARCA | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 Sistema di elettroporazione ad alta produttività | BTX | 45-0423 | Sono accettabili altre macchine. |
| LB Brodo con agar (Miller) | Sigma | L3147 | Può essere fatto in casa pure. |
| Il fantastico brodo | Sigma | T0918 | può essere fatto in casa pure. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Provette per coltura | VWR International | 60818-576 | |
| Palloni T75 | Celltreat | 229340 | |
| Palloni T182 | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 con L-glutammina | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM con L-glutammina e 4,5 g/L di glucosio | Corning | 10-017-CV | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Polvere di adragante | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Etanolo denaturato | VWR International | BDH1156-1LP | |
| Piastra | a 6 pozzettiCelltreat | 229106 | |
| piastra a 12 pozzetti | Celltreat | 229111 | |
| Sequenziamento Oligos | IDT | vedi tabella 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | altri metodi sono accettabili. |
| Kit di analisi Qubit dsDNA BR | ThermoFisher | Q32850 | altri metodi sono accettabili. |
| Kit di analisi Qubit RNA HS | ThermoFisher | Q32852 | altri metodi sono accettabili. |
| La cabina di biosicurezza di classe II | varia | N/A | Questo è necessario per il lavoro con virus vivi. |
Riferimenti
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guill....
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Ristampe e permessi
