Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

Summary

In questo metodo, usiamo fotopolimerizzazione e tecniche di chimica clicca per creare modelli di proteina o peptide sulla superficie di idrogeli di polietilenglicole (PEG), fornendo immobilizzata bioattivi segnali per lo studio delle risposte cellulari in vitro .

Abstract

Ci sono molti stimoli biologici che possono influenzare la differenziazione delle cellule staminali e comportamento delle cellule. Cellulari generali cultura approcci si basano su fattori solubili all'interno del mezzo per controllare il comportamento delle cellule. Tuttavia, aggiunte solubile non possono simulare alcuni motivi, come fattori di crescita associati a matrice di segnalazione, segnalazione della cellula-cellula e spaziale segnali biochimici, che sono comuni influenze sulle cellule. Inoltre, le proprietà biofisiche della matrice, come ad esempio la rigidità del substrato, svolgono i ruoli importanti nel destino della cellula, che non è facilmente manipolata utilizzando pratiche di coltura convenzionale della cella. In questo metodo, descriviamo un protocollo semplice per fornire proteine bioattive modellati su idrogel sintetico in polietilene glicole (spina) utilizzando fotochimica. Questa piattaforma permette il controllo indipendente della rigidità del substrato e spaziale segnali biochimici. Questi idrogeli possono realizzare una vasta gamma di valori di rigidità fisiologicamente rilevanti. Inoltre, le superfici di questi idrogeli possono essere photopatterned con peptidi bioattivi o proteine via tiolo-ene clicca chimica reazioni. Questi metodi sono stati ottimizzati per conservare la funzione della proteina dopo immobilizzazione superficiale. Si tratta di un protocollo versatile che può essere applicato a qualsiasi proteina o peptide di interesse per creare una varietà di modelli. Infine, cellule seminate sulle superfici di questi idrogeli bioattivi possono essere monitorate nel tempo come rispondono ai segnali nello spazio specifici.

Introduction

Ci sono molti stimoli che influenzano il comportamento delle cellule. In generale, tecniche di coltura tipica cellula si basano su fattori solubili di suscitare risposte cellulari; Tuttavia, ci sono limitazioni di questo approccio. Questi metodi sono in grado di visualizzare con precisione tutti i motivi di segnalazione comunemente trovati in vivo. Tali meccanismi di segnalazione includono sequestrati fattori di crescita, segnalazione della cellula-cellula e spazialmente specifici segnali biochimici. Inoltre, rigidità del substrato può giocare un ruolo importante nel differenziamento delle cellule staminali e comportamento cellulare e non è facilmente manipolata utilizzando comuni pratiche coltura cellulare^1,2. Biomateriale approcci offrono una nuova piattaforma per cominciare ad esplorare questi meccanismi di segnalazione. In particolare, idrogeli sono candidati eccellenti per ottimizzazione substrato rigidità^3,4, immobilizzante proteine e peptidi^5,6e la creazione di modelli spazialmente specifici^{7, 8}.

Idrogeli sono comunemente usati come impalcature in ingegneria tissutale a causa loro commonalities biofisica e biochimica con la matrice extracellulare (ECM)^9,10. Polimeri naturali sono scelte comuni per ponteggi, in quanto sono biocompatibili e si trovano in molti tessuti del corpo. La limitazione dell'utilizzo di polimeri naturali come substrati è che mancano moiety chimica facilmente manipolabile per bioconjugation. D'altra parte, idrogel sintetico, in quanto tale come PEG, sono eccellenti piattaforme per prodotti chimici mirati per^11,12. Inoltre, idrogeli PEG non suscitare una risposta cellulare e pertanto vengono utilizzati come backbone di inerte per la creazione di strutture bioattive.

Per creare idrogeli bioattivi, fotopolimerizzazione sia del tiolo-ene scegliere chimica reazioni sono impiegate. Questi FOTOREAZIONI richiedono un fotoiniziatore e una sorgente di luce UV. Quando fotoiniziatori vengono introdotti ai raggi UV, obbligazioni rompono per formare i radicali. Tesi i radicali sono necessari per avviare la reazione ma possono influire negativamente sulle proteine bioattività^12,13. Di conseguenza, è fondamentale ottimizzare fotoiniziatore e tempi di esposizione UV per mantenere la bioattività di proteina.

In questo metodo, idrogeli sono sintetizzati attraverso acrilato-acrilato catena crescita fotopolimerizzazione. PEG-Diacrilato (PEGDA) monomeri reagiscono con a vicenda per formare reti di polimero ramificato responsabile della struttura dell'idrogel. La concentrazione dei monomeri PEGDA all'interno della soluzione di precursore di gel controllerà la rigidità del substrato. Dovuto la piccola dimensione dell'idrogel dei pori, proteine ECM come fibronectina possono essere facilmente incorporate all'interno di idrogel ai fini del collegamento delle cellule. Infine, questi idrogeli possono essere a superficie-fantasia con peptidi bioattivi o proteine via tiolo-ene clicca chimica reazioni. Qui, acrilati non reagiti gratuiti all'interno del sistema di idrogel reagirà con tioli gratuiti situati sulla proteina o peptide quando esposto a luce UV. Dopo le proteine o peptidi sono immobilizzati sulla superficie dell'idrogelo, l'idrogel possono essere memorizzati a 4 ° C per diverse settimane senza perdere la bioattività. Questo offre convenienza, flessibile pianificazione sperimentale e la possibilità di collaborazione tra i laboratori. Nel complesso, questa piattaforma permette di controllo biochimico biomeccanico e spaziale, indipendente uno da altro, per l'opportunità di influenzare il comportamento cellulare.

Protocol

1. preparazione dei materiali per la sintesi dell'idrogelo

1. preparare soluzioni di riserva di PEGDA, litio fenil-2, 4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) e fibronectina in condizioni sterili e basato su calcoli (tabella 1A).
   1. Pesare e sciogliere composti in tampone fosfato salino (PBS). In genere, mantenere PEGDA lavorando le concentrazioni di soluzione tra 50 e 200 mg/mL (5-20% peso/volume). Dispensare la soluzione PEGDA attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione.
      Nota: Mantenere le soluzioni PEGDA coperte con un foglio di avvolgimento per proteggerli dalla luce. Preparare una soluzione fresca di PEGDA (consigliato) per ogni esperimento.
   Polvere di
   2. ricostituire fibronectina proteina basata sul produttore ' s raccomandazione. Mantenere la soluzione di riserva di fibronectina a 1 mg/mL, aliquotare e in aliquote di 60 a 100 µ l e conservarli a-20 ° C fino all'utilizzo. Scongelare le aliquote a 4 ° C per diverse ore o durante la notte prima dell'uso. Se Stock in proteine non viene già fornita in condizioni sterili, utilizzare un filtro per siringa da 0,22 µm per la sterilizzazione.
      Nota: Fibronectina è utilizzata per il collegamento delle cellule. Altre proteine ECM possono essere sostituito con.
   3. Pesare LAP per la soluzione di riserva e dissolverlo in PBS; una tipica concentrazione stock è 25 mg/mL. Sonicare se c'è qualche problema con dissoluzione. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 µm per la sterilizzazione. Percorrere il giro con un involucro di stagnola e conservarlo a 4 ° C per fino a parecchi mesi.
      Nota: LAP è il fotoiniziatore utilizzato per la fotochimica.
2. Preparare stampi diapositiva vetro sterile per formazione di idrogel.
   1. Autoclave un poliestere foglio; uno è necessario per ogni stampo di gel. Immergere due lastre di vetro e tre distanziali in plastica (0,5 mm di spessore) per ogni stampo di gel in etanolo al 70% per almeno 2 ore, ma generalmente di lasciarli in ammollo durante la notte. Ammollo cinque clip legante per ogni stampo di gel in etanolo al 70% per 10 minuti prima dell'uso.
   2. Posizionare i vetrini, distanziali e raccoglitore Clip su un piccolo foglio sterilizzato nell'autoclave della cappa di cultura cellulare per consentire loro di aria secca per diverse ore.
   3. Preparazione stampi di idrogel inserendo distanziali in plastica intorno al bordo del vetrino. Posizionare la seconda diapositiva di vetro sulla parte superiore. Fissare i distanziali strettamente uno accanto a altro con clip legante, due su ogni lato lungo e quello in alto.
      Nota: Se questo non è montato correttamente, la soluzione di gel colerà.
   4. Superficie-sterilizzare lo stampo con coltura cellulare cappa luce UV per 30 min prima dell'uso. A metà strada attraverso, capovolgere lo stampo per esporre entrambe le superfici.

2. Modificare le proteine con un tiolo gratis

1. preparare soluzioni di riserva utilizzando calcoli dal foglio di calcolo per la conversione dell'ammina in tiolo sulle proteine (tabella 1A).
   1. a fare il tampone di reazione, regolare il PBS a pH 8 e aggiungere 5 mM EDTA. Tampone di reazione della pipetta in un filtro per siringa da 0,22 µm per la sterilizzazione.
      Nota: EDTA è importante, in quanto protegge i tioli da formando legami bisolfurico. Gruppi tiolici devono rimanere nella loro forma ridotta per la reazione avvenga.
   2. Pesare 2-Iminotiolano (Traut ' s reagente) e dissolverlo in tampone di reazione per una concentrazione di soluzione stock di 2 mg/mL (14 mM). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C per fino a parecchi mesi.
      Nota: 2-Iminotiolano è la molecola che reagisce con le ammine gratis esposte al solvente sulle proteine e li converte in tioli liberi.
   3. Ricostituire la proteina nel tampone di reazione ad una concentrazione compresa tra 0,1 e 1 mg/mL. A meno che precedentemente sterile, pipettare questa soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione.
      Nota: Questa proteina è il segnale biochimico che verrà essere modellato sulla superficie di idrogel. Inoltre, mentre le concentrazioni di proteina possono variare, concentrazioni più elevate sono ideali per più forte pattern proteico.
2. Reagire la proteina con 2-Iminotiolano mescolando insieme entrambe le soluzioni stock; utilizzare tabella 1B per calcolare il rapporto di volume corretto. In genere, utilizza un rapporto molare di 8:1 2-Iminotiolano alla proteina.
   Nota: Per i più grandi proteine o più diluire le concentrazioni, utilizzare un rapporto molare superiore di 2-Iminotiolano. Consultare il produttore ' s protocollo ¹⁵.
3. Incubare la reazione per 1 h a temperatura ambiente. Utilizzare una dissalazione spin micro-colonna per rimuovere il prodotto della proteina chitosani da reagenti restanti, seguendo il produttore ' s protocollo ¹⁶.
   Nota: Il limite di esclusione di questa resina è 5 KDa.
4. Uso Ellman ' s saggio misurare quantitativamente il numero dei tioli liberi per proteina. Seguire il produttore ' protocollo di s per il dosaggio ¹⁷.

3. Formazione di idrogel

1. Crea la soluzione del precursore di gel basata su valori calcolati da tabella 1. Mescolare insieme la PEGDA, fibronectina e volumi LAP. Dispensare la soluzione vigorosamente per garantire una soluzione omogenea, ma evitare la creazione di bolle. Mantenere la soluzione al riparo dalla luce.
2. Dispensare la soluzione di gel precursore attentamente tra i due vetrini dello stampo gel. In genere, aggiungere un volume tra 800 e 1.000 µ l allo stampo. Esporre la soluzione di gel nello stampo a luce UV (lunghezza d'onda: 365 nm, potenza: 3-4 mW/cm ²) per 1-2 min formare l'idrogel.
   Nota: Non esporre l'idrogel a luce UV prolungata, come si limiterà la proteina di superficie patterning funzionalità.
3. Togliere la clip legante e rimuovere delicatamente il vetrino superiore applicando pressione di fronte ai distanziali due lato.
4. Utilizzare un pugno di dimensioni appropriate biopsia per tagliare fuori i campioni di idrogel. Punch out più idrogeli dal rettangolo di gel per servire come repliche e campioni di controllo.

4. Misure di rigidezza di idrogel

punch di biopsia

1. Punch out idrogel con un 8 mm di diametro per un reometro di piatti paralleli di 8 mm. Caricare un idrogel campione in reometro (Vedi la Tabella materiali).
2. Inferiore la geometria di piatti paralleli che è 8 mm di diametro fino a fare contatto con la superficie del gel. Mantenere una distanza di 0,5 mm per un campione di 0,5 mm di spessore idrogel.
3. Spazza tempo eseguire per 5 min a sforzo di 0,1%, 0,1 Hz frequenza e 37 ° C. Media il G ' valori attraverso ogni passaggio di tempo. Esecuzione indipendente idrogel per repliche di ogni composizione.
   Nota: Il G ' valori dovrebbero essere stabili attraverso punti di tempo; Se non sono, per cento colare e sweep di frequenza deve essere eseguita per selezionare l'appropriato i valori ¹⁴.

5. Patterning di proteina

1. preparare il modello desiderato per il photomask utilizzando un programma di computer-aided design (CAD). Stampare il photomask su un foglio trasparente utilizzando una stampante ad alta risoluzione. Immergere il photomask in etanolo al 70% per 10 minuti prima dell'uso. Strato di fotoresist per aria, lasciare asciugare in una cappa di cultura cellulare prima dell'uso.
2. Aggiungere la soluzione di proteina chitosani preparata nel passaggio 2 per la superficie dell'idrogel per superficie patterning. Pipettare 1-2 µ l/cm ² di soluzione proteica chitosani alla superficie di ogni ritaglio gel.
   Nota: È importante per ridurre al minimo il volume della proteina; aggiungere solo sufficiente a coprire uniformemente tutta la superficie del campione idrogel.
3. Posizionare con attenzione il photomask sulla superficie dell'idrogel. Non lasciare bolle d'aria tra la fotomaschera e la superficie di idrogel. Premere delicatamente la maschera per rimuovere tutte le bolle che si formano.
4. Esporre l'idrogel a un secondo turno di luce UV (lunghezza d'onda: 365 nm, potenza: 3-4 mW/cm ²) per 30-60 s.
   Nota: È importante l'esposizione il pattern a abbastanza luce UV per creare un modello forte senza causare la perdita di funzione della proteina.
5. Lavare l'idrogel con PBS per rimuovere specie non reagito e posizionare ogni idrogel all'interno della placca ben. Fare attenzione quando si inseriscono i gel in ciascun pozzetto; Assicurarsi che la superficie modellata sia rivolto verso. Lavare il gel in PBS a 4 ° C; i gel sono stabili per almeno due settimane a 4 ° C.

6. Preparazione di idrogeli per la semina delle cellule

1. Incubare i gel in sostanza basale per 5-10 min a 37 ° C prima della semina. Per cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs), utilizzare EGM-2 medium senza fattori di crescita. Ridurre al minimo il volume del mezzo aggiunto a ciascun bene per prevenire idrogel galleggianti. Per una piastra a 48 pozzetti, utilizzare un volume di 250 µ l di terreno.
2. Spin giù la piastra a 300 x g per 3 min garantire che nel caso degli idrogeli è situati nella parte inferiore del pozzo e non è galleggianti. Eseguire questa operazione immediatamente prima della semina delle cellule.

7. Seeding in idrogel di cella

1. uso standard cellula di mammiferi sterile cultura procedure per la semina delle cellule e procedure sperimentali. Rimuovere HUVECs da boccette di coltura del tessuto utilizzando protocolli standard delle cellule distacco. Lavare il piatto di coltura del tessuto con PBS sterile e incubare con tripsina per 3-5 min a 37 ° C.
2. Placare la sospensione delle cellule tripsinizzate con soluzione di neutralizzatore di medie o tripsina in eccesso delle cellule.
3. Rotazione verso il basso la sospensione cellulare nella centrifuga a 300 x g per 5 min. con attenzione rimuovere il supernatante e tenere il pellet cellulare.
4. Risospendere il pellet cellulare in basale EGM-2 senza fattori di crescita. Utilizzare un emocitometro per conta cellulare.
5. Aggiungere 75.000 cellule/cm ² per ogni idrogel superficie pipettando lentamente al centro di ogni bene per non disturbare i gel. Posizionare la piastra ben in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C. Per diversi giorni, periodicamente, rimuovere il piatto per osservazione.

8. Valutazione di bioattività

1. cultura, Escherichia coli, pernottamento in sospensione in libbra di brodo in una sospensione orbitale a 37 ° C e 200 giri/min. Rotazione verso il basso la cultura di e. coli, decantare e ricostituire il pellet cellulare in volume minimo di PBS. Pesare il lisozima e ricostituire a 1 mg/mL per la soluzione di riserva.
2. Pipettare un piccolo volume (25 µ l) di soluzione di riserva di lisozima in microcentrifuga. Aggiungere livelli di variazione di LAP fotoiniziatore (0-12 mM) ed esporre i campioni a 1 min di luce UV. In un gruppo separato, aggiungere la stessa quantità di LAP (2 mM) alla soluzione di lisozima ed esporre i campioni a diversi tempi di luce UV (0-4 min). Sono repliche per ogni trattamento.
Soluzione di
3. Aggiungi uguale volume di concentrato e. coli per ciascun campione di lisozima per una concentrazione di proteina di lisozima finale di 0,5 mg/mL. Incubare le soluzioni miste per 4 h a temperatura ambiente.
   Nota: In questo modo tempo per lisozima funzionale lisare la parete cellulare batterica e rilasciare proteine nella soluzione.
4. Utilizzare incubato con e. coli per un controllo positivo non trattata di lisozima; considera questo una misurazione bioattivi di 100%. Utilizzare la soluzione di lisozima incubati con PBS da solo come controllo negativo.
5. Spin giù i campioni per rimuovere i detriti cellulari e mantenere il supernatante. Eseguire un'analisi di Bradford per quantificare la concentrazione totale di proteina all'interno il surnatante per misurare la quantità di lisato batterico.
6. Eseguire un'analisi di Bradford seguendo il produttore ' s protocollo ¹⁸. Calcolare la piega cambiamento nella concentrazione di proteina rispetto al controllo negativo.

Results

Il protocollo per creare modelli bioattivi sulla superficie di idrogeli di PEG è illustrato nella Figura 1. Un foglio di calcolo è stato sviluppato per calcolare il volume e la concentrazione per ogni soluzione di riserva (tabella 1A). Proteine per essere immobilizzati sulla superficie dell'idrogel vengono modificate con 2-Iminotiolano (Figura 1B). Questa reazione viene eseguita utilizzando i vol...

Discussion

Questo protocollo fornisce un metodo per la creazione di modelli di proteine bioattive per applicazioni biologiche. Ci sono diverse modifiche che possono essere fatte per adattare questo protocollo per diversi esperimenti. In primo luogo, requisiti di collegamento cella varierà per diversi tipi di cellule. Se inizialmente si osserva un collegamento scadente delle cellule per i gel, aumentando la concentrazione della proteina all'interno della soluzione di precursore ECM è consigliato. Altre proteine ECM possono essere ut...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diacrilato (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	Può anche essere sintetizzato o acquistato tramite altri venditori. Possono essere utilizzati diversi pesi molecolari.
Litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)			Sintetizzato in laboratorio
Fibronectina	Corning	356008	Possono essere utilizzate altre proteine di attacco cellulare, come la laminina, matrigel
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma	D8537-500ML
Photomask	FineLine Imaging	n/a	Stampe personalizzate su fogli trasparenti con DPI ad alta risoluzione.
Clip per legante	Vari fornitori Sorgente
di luce UV compatta (365nm)	UVP	UVP-21	È possibile utilizzare altre sorgenti di luce UV, è necessaria la calibrazione della potenza.
2-imminotiolano (Pierce Traut' s Reagent)	Thermo Sci.	26101
Ellman' s Reagente: DTNB; Acido 5,5-ditio-bis(2-nitrobenzoico)Thermo	Sci.	22582
cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)	Lonza		tra 6 e 10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 senza fattori di crescita. Il terreno EGM-2 completo è stato utilizzato per il mantenimento cellulare
0,25% Tripsina EDTA	Life Tech	25200-056
Neutralizzatore di tripsina	Life Tech	R-002-100
Centrifuga	Vari venditori
Emocitometro	Hausser Sci. Linea brillante
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0,22µ m filter	Cell Treat	229743
1mL Siringa
Vetro Vetrini per microscopio	Fisher Sci.	12-550C
Distanziatori in plastica	Vari venditori		0,5 mm spessore
70% Etanolo	BICCA	2546.70-1
Bio-scudo	Bio-scudo	19-150-0010
Bradford Reagent	BIO-RAD
- Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Colonne Microspin	Thermo Sci.
AR-G2 rehometer	TA Instruments