Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

Summary

In questo metodo, usiamo fotopolimerizzazione e tecniche di chimica clicca per creare modelli di proteina o peptide sulla superficie di idrogeli di polietilenglicole (PEG), fornendo immobilizzata bioattivi segnali per lo studio delle risposte cellulari in vitro .

Abstract

Ci sono molti stimoli biologici che possono influenzare la differenziazione delle cellule staminali e comportamento delle cellule. Cellulari generali cultura approcci si basano su fattori solubili all'interno del mezzo per controllare il comportamento delle cellule. Tuttavia, aggiunte solubile non possono simulare alcuni motivi, come fattori di crescita associati a matrice di segnalazione, segnalazione della cellula-cellula e spaziale segnali biochimici, che sono comuni influenze sulle cellule. Inoltre, le proprietà biofisiche della matrice, come ad esempio la rigidità del substrato, svolgono i ruoli importanti nel destino della cellula, che non è facilmente manipolata utilizzando pratiche di coltura convenzionale della cella. In questo metodo, descriviamo un protocollo semplice per fornire proteine bioattive modellati su idrogel sintetico in polietilene glicole (spina) utilizzando fotochimica. Questa piattaforma permette il controllo indipendente della rigidità del substrato e spaziale segnali biochimici. Questi idrogeli possono realizzare una vasta gamma di valori di rigidità fisiologicamente rilevanti. Inoltre, le superfici di questi idrogeli possono essere photopatterned con peptidi bioattivi o proteine via tiolo-ene clicca chimica reazioni. Questi metodi sono stati ottimizzati per conservare la funzione della proteina dopo immobilizzazione superficiale. Si tratta di un protocollo versatile che può essere applicato a qualsiasi proteina o peptide di interesse per creare una varietà di modelli. Infine, cellule seminate sulle superfici di questi idrogeli bioattivi possono essere monitorate nel tempo come rispondono ai segnali nello spazio specifici.

Introduction

Ci sono molti stimoli che influenzano il comportamento delle cellule. In generale, tecniche di coltura tipica cellula si basano su fattori solubili di suscitare risposte cellulari; Tuttavia, ci sono limitazioni di questo approccio. Questi metodi sono in grado di visualizzare con precisione tutti i motivi di segnalazione comunemente trovati in vivo. Tali meccanismi di segnalazione includono sequestrati fattori di crescita, segnalazione della cellula-cellula e spazialmente specifici segnali biochimici. Inoltre, rigidità del substrato può giocare un ruolo importante nel differenziamento delle cellule staminali e comportamento cellulare e non è facilmente manipol....

Protocol

1. preparazione dei materiali per la sintesi dell'idrogelo

1. preparare soluzioni di riserva di PEGDA, litio fenil-2, 4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) e fibronectina in condizioni sterili e basato su calcoli (tabella 1A).
   1. Pesare e sciogliere composti in tampone fosfato salino (PBS). In genere, mantenere PEGDA lavorando le concentrazioni di soluzione tra 50 e 200 mg/mL (5-20% peso/volume). Dispensare la soluzione PEGDA attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione.
      Nota: Mantenere le soluzioni PEGDA coperte con un foglio di avvolgimento per proteggerli dalla luce. Preparare una soluzione fresca di PEGDA ....

Results

Il protocollo per creare modelli bioattivi sulla superficie di idrogeli di PEG è illustrato nella Figura 1. Un foglio di calcolo è stato sviluppato per calcolare il volume e la concentrazione per ogni soluzione di riserva (tabella 1A). Proteine per essere immobilizzati sulla superficie dell'idrogel vengono modificate con 2-Iminotiolano (Figura 1B). Questa reazione viene eseguita utilizzando i vol.......

Discussion

Questo protocollo fornisce un metodo per la creazione di modelli di proteine bioattive per applicazioni biologiche. Ci sono diverse modifiche che possono essere fatte per adattare questo protocollo per diversi esperimenti. In primo luogo, requisiti di collegamento cella varierà per diversi tipi di cellule. Se inizialmente si osserva un collegamento scadente delle cellule per i gel, aumentando la concentrazione della proteina all'interno della soluzione di precursore ECM è consigliato. Altre proteine ECM possono essere ut.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diacrilato (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	Può anche essere sintetizzato o acquistato tramite altri venditori. Possono essere utilizzati diversi pesi molecolari.
Litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)			Sintetizzato in laboratorio
Fibronectina	Corning	356008	Possono essere utilizzate altre proteine di attacco cellulare, come la laminina, matrigel
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma	D8537-500ML
Photomask	FineLine Imaging	n/a	Stampe personalizzate su fogli trasparenti con DPI ad alta risoluzione.
Clip per legante	Vari fornitori Sorgente
di luce UV compatta (365nm)	UVP	UVP-21	È possibile utilizzare altre sorgenti di luce UV, è necessaria la calibrazione della potenza.
2-imminotiolano (Pierce Traut' s Reagent)	Thermo Sci.	26101
Ellman' s Reagente: DTNB; Acido 5,5-ditio-bis(2-nitrobenzoico)Thermo	Sci.	22582
cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)	Lonza		tra 6 e 10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 senza fattori di crescita. Il terreno EGM-2 completo è stato utilizzato per il mantenimento cellulare
0,25% Tripsina EDTA	Life Tech	25200-056
Neutralizzatore di tripsina	Life Tech	R-002-100
Centrifuga	Vari venditori
Emocitometro	Hausser Sci. Linea brillante
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0,22µ m filter	Cell Treat	229743
1mL Siringa
Vetro Vetrini per microscopio	Fisher Sci.	12-550C
Distanziatori in plastica	Vari venditori		0,5 mm spessore
70% Etanolo	BICCA	2546.70-1
Bio-scudo	Bio-scudo	19-150-0010
Bradford Reagent	BIO-RAD
- Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Colonne Microspin	Thermo Sci.
AR-G2 rehometer	TA Instruments