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Articolo metodologico

Modello del ratto della partizione del fegato associando i e legatura della vena portale per procedura di messa in scena epatectomia (ALPPS)

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DOI:

10.3791/55895

⸱

14 agosto 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology - Center for Integrative Human Physiology, University of Zurich, 2Department of Surgery, Rush University Medical Center, 3Department of Surgery, Cantonal Hospital Winterthur, 4Institute of Anesthesiology, University and University Hospital Zurich

In questo articolo

Sommario

Indurre ipertrofia epatica rapida utilizzando associando i fegato partizione e legatura della vena portale per un'epatectomia Staged (ALPPS) è stato proposto per la resezione dei tumori del fegato resecabile limite. Questo modello può delucidare i meccanismi coinvolti nell'ipertrofia rapido e permette di testare farmaci che promuovono o bloccano l'accelerazione della rigenerazione.

Abstract

Recenti dati clinici supportano un metodo chirurgico aggressivo per tumori primari e metastatici del fegato. Per alcune indicazioni, come metastasi colorettali del fegato, la quantità di tessuto del fegato lasciato alle spalle dopo resezione del fegato è diventato il principale fattore limitante di resecabilità di grandi dimensioni o tumori multipli del fegato. Una minima quantità di tessuto funzionale è necessaria per evitare la complicazione severa di post-epatectomia insufficienza epatica, che ha un'elevata morbilità e mortalità. Che induce la crescita del fegato del residuo potenziale prima di resezione è più affermata nella chirurgia epatica, sia sotto forma di embolization della vena portale da radiologi interventisti o sotto forma di legatura della vena portale diverse settimane prima di resezione. Recentemente è stato dimostrato che la rigenerazione del fegato è più ampia e rapida, quando il transection parenchimatico viene aggiunto a legatura della vena portale in una prima fase e poi, dopo solo una settimana di attesa, resezione eseguita in una seconda fase (associando i fegato partizione e la legatura della vena portale per Staged hepatectomy = ALPPS). ALPPS è diventato rapidamente popolare in tutto il mondo, ma è stato criticato per la sua mortalità perioperatoria alta. Il meccanismo di crescita accelerata e vasto indotto da questa procedura non è stato ben compreso. Modelli animali sono stati sviluppati per esplorare entrambi i meccanismi fisiologici e molecolari di rigenerazione accelerata del fegato in ALPPS. Questo protocollo presenta un modello del ratto che permette l'esplorazione meccanicistica di rigenerazione accelerata.

Introduzione

Le dimensioni del fegato residuo limitano il resectability dei tumori del fegato. 1 in generale, quando meno di 25% del fegato tessuto è lasciato alle spalle, il paziente è al rischio aumentato di morte da insufficienza epatica acuta dovuto la mancanza della funzione metabolica per l'intero organismo ("troppo piccola per la sindrome di dimensioni"). 2 questo post-epatectomia insufficienza epatica è la complicazione più devastante dopo resezione del fegato. Pertanto i medici hanno tentato di indurre la rigenerazione del fegato prima di resezione del fegato di manipolare il flusso della vena portale. 3 è stato trovato che, una volta che la vena è occlusa, la restante parte con flusso della vena portale inizia a crescere ad un ritmo lento e quindi può aumentare fino al 60% in dimensione. Legatura chirurgica5 interventistica della vena portale o 4 occlusione sono entrambi stati clinicamente stabiliti. 4 l'aumento di volume e la funzione del fegato è affidabile, ma il tasso di crescita del fegato dopo l'occlusione portale è solo circa un quinto rispetto alla crescita del fegato residuo dopo l'epatectomia parziale. 6

Il tempo necessario per il fegato a crescere è settimane o mesi, anche se il fegato può rigenerare ad un tasso molto più veloce dopo resezione. Come tale, il fegato è l'unico organo che cresce alla normale funzione dopo la rimozione di una parte di esso. 7 una procedura innovativa che inducono la rigenerazione del fegato a un ritmo simile come dopo hepactectomy parziale è stato sviluppato da un gruppo di chirurghi che ha scoperto che aggiungendo un transection tra l'occlusa e induce la parte non-occlusa del fegato fegato ipertrofia allo stesso tasso di crescita come dopo resezione del fegato, ma prima di resezione. 9 la procedura avvia rapida ipertrofia dell'80% all'interno di un residuo di settimana in futuro del fegato, che permette la resezione dei tumori vasti, principalmente non resecabile, fegati entro una settimana. La procedura è stata chiamata "associazione la legatura della vena portale e fegato partizione per Staged hepatectomy = ALPPS" ed è diventato rapidamente popolare in tutto il mondo. 10 più report supportato un'espansione di resecabilità dei tumori del fegato resecabile limite raggiunto dalla nuova tecnica,11 mentre la complessa procedura chirurgica è stata anche criticata per il suo alto tasso di complicazione. 12 , 13

Lo sviluppo di un roditore e anche grandi modelli animali dell'ipertrofia lento e veloce sono stati tentati sin dalla pubblicazione di ALPPS nel 2012 per consentire una migliore caratterizzazione istologica e la comprensione dei meccanismi e per testare gli effetti della droga sulla tassi di crescita differenti del tessuto del fegato negli animali. Il primo modello animale sviluppato era un modello del ratto. In questo modello, ipertrofia rapida dopo il transection parenchimatico tra la destra e la parte di sinistra del lobo mediano accelerata rigenerazione del lobo in mediana. 14 un altro modello è stato introdotto più tardi nel topo. In questo modello è stato resecato il lobo laterale sinistro e i rami della vena portale per ogni lobo del fegato tranne il lobo mediano sinistro erano legati. 15 nel frattempo, modelli animali di grandi dimensioni di ALPPS nei suini sono stati descritti come bene. 16

Per lo studio dei meccanismi fisiologici come variazioni di flusso e pressione nella vena porta, perfusione e ossigenazione del tessuto del fegato, il modello di ratto è superiore al modello di ALPPS nei topi. Un altro vantaggio del ratto rispetto al modello murino è che nel modello del ratto non c'è alcuna necessità per una resezione del lobo laterale sinistro,15 che potrebbero contaminare gli effetti di resezione del fegato con quelli di ALPPS. Il modello di ratto in contrasto non riduce il fegato massa cellulare. Un modello di maiale utilizza il lobo posteriore di destra come il lobo crescente, ma il fegato di maiale è altamente lobulato. Di conseguenza, è difficile creare un aereo transection del ponte di tessuto già sottile tra il lobo anteriore di destra e posteriore destro. Al contrario, il lobo mediano in ratti consistono di due parti che sono forniti separatamente da una vena e un aereo transection parenchimatica possa essere facilmente creato tra i due usando le tecniche microsurgical. La disponibilità di piccolo animale computer tomografia (CT) e/o di risonanza del magnete (RMN) permette la quantificazione molto esatta di crescita volumetrica tra solo la legatura della vena portale e legatura della vena portale e il transection aggiunto, che è importante per la validazione di qualsiasi modello di ipertrofia epatica rapida.

Il protocollo presentato qui descrive la tecnica chirurgica e le procedure utilizzate per la convalida volumetrica e caratterizzazione fisiologica del modello dell'ipertrofia lento e veloce dopo la legatura della vena portale e la legatura della vena portale con il transection, rispettivamente, in ratti.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti in questo protocollo sono stati approvati dalle autorità veterinarie del Cantone di Zurigo, Svizzera (numero 60/2014). Inoltre, tutte le fasi sperimentali sono state eseguite in stretta conformità con le linee guida sugli esperimenti con gli animali dall'Accademia Svizzera delle scienze mediche (SAMS) e linee guida della Federazione di europeo laboratorio animale scienza associazioni (FELASA) .

1. allevamento di animali, attrezzature di sala operatoria e strumenti, anestesia

  1. Mantenere ratti maschii di Wistar con un peso di 250-300 g in gabbie ventilate in condizioni standard esenti da patogeni in un ciclo luce/buio di 12/12 h. Dare animali libero accesso a cibo e acqua a una temperatura ambiente di 22 ± 1 ° C.
  2. Indurre l'anestesia in una scatola, dove isoflurano viene svuotata con 5 vol % per 30 s (Figura 1A), seguita da una concentrazione di isoflurane di 3% in volume fino a quando l'animale è sotto anestesia profonda. Confermare il livello di anestesia dal riflesso del toe-pizzico.
  3. Fornire l'analgesia per via sottocutanea utilizzando applicato buprenorfina (0,01 mg/kg) durante l'intervento chirurgico, seguito da 0,02 mg/kg ogni 12 h nella fase postoperatoria per 48 h.
  4. Trasferire l'animale nel posto di lavoro, dove sono spontaneamente respirazione esposti ad una miscela di gas di 1.0-2.5 vol % isoflurane in ossigeno (flusso: 600 mL/min).
  5. Chiudere gli occhi dell'animale e utilizzare un unguento per proteggere gli occhi. Iniettare 5 mL di soluzione salina per via sottocutanea, la metà di esso su ogni lato dell'addome, seguito da atropina 0,1 mg.
  6. Eseguire un intervento chirurgico utilizzando un microscopio chirurgico in una stanza di microchirurgia.
  7. Mantenere l'animale in anestesia volatile utilizzando una maschera di ventilazione, composto da una membrana in lattice (Figura 1B), attraverso il quale viene inserito il muso del ratto. Fissare le estremità con del nastro adesivo (Figura 1B).
  8. Stendere gli strumenti chirurgici in modo sterile su un tavolino: imbevuta di soluzione fisiologica e Betadine spugne (Figura 2A), addominale parete divaricatori (Figura 2B) così come punti di sutura 3-0 per la retrazione della parete addominale e xifoideo, forbici, Adson forcipe, fine suggerimenti Micropinze dritto e curvo e taglio di cravatte di seta 6-0 per la procedura di legatura (Figura 2).
  9. Utilizzare antiaderenti Micropinze bipolari per transection del parenchima epatico. Chiudere la parete addominale e la pelle utilizzando suture seta 3-0 con gli aghi SH-1 e 5-0 Maxon (Figura 2D). Utilizzare una pinza bipolare per emostasi.

2. inizio della chirurgia

  1. Radere l'addome dell'animale con un piccolo animale tagliacapelli al xifoideo ai genitali con un 2-cm area laterale della linea mediana. Rimuovere accuratamente i capelli.
  2. Disinfettare la zona 3 volte con spugne imbevuto di betadine.
  3. Eseguire un'incisione del midline usando un bisturi per la pelle e quindi utilizzare forbici chirurgiche per aprire l'addome.
  4. Ritrarre la destra e di sinistra della parete addominale e la xifoideo con punti di sutura in seta 3-0 (Figura 3A).
  5. Ritrarre lo stomaco, colon e intestino tenue dal legamento epatoduodenale del ratto con divaricatori self made piccolo filo (Figura 3B).

3. vena portale legatura (PVL)

  1. Accedere la vena portale ed i relativi rami laterale ritrazione dello stomaco e l'intestino tenue (Figura 3B).
  2. Sezionare la vena portale senza mezzi termini di far salire il peritoneo con la pinza a coccodrillo e lentamente peeling medialmente.
  3. Sezionare i rami della vena portale fuori (Figura 3) nella seguente sequenza: ramo posteriore (1) diritto, (2) lasciato il ramo mediano laterale e sinistro insieme e (3) caudato.
    1. In primo luogo, di staccare il peritoneo con piccole, non troppo energiche mosse per evitare di strappare i piccoli rami arteriosi ai lobi del fegato che girano direttamente sotto la copertura peritoneale.
    2. Una volta che la vena portale principale è denudata, circondano i rami con lento avanti spingendo e diffusione di movimenti e tirare un pezzo di seta 6-0 1-cm cravatta intorno al ramo rispettivo della vena portale e legare esso.
  4. Legare il ramo posteriore di destra del lobo. (Figura 3) La difficoltà tecnica del ramo posteriore di destra consiste nel fatto che l'arteria al lobo posteriore di destra è in esecuzione attraverso il ramo posteriore di destra della vena portale.
    1. Tirare l'arteria cranialmente insieme con il peritoneo per esporre il ramo destro della vena portale con la pinza a coccodrillo curvo.
    2. Legare il ramo del lobo posteriore di destra con il pre-taglio cravatta di seta di 6-0. Il lobo posteriore di destra si trasforma visibilmente pallido, una volta che la vena portale è legata.
    3. Evitare di spingere contro la resistenza durante la circuitazione per evitare la lacerazione dell'arteria o vena portale. In caso di emorragia, applicare pressione per almeno un minuto con un tampone di cotone sterile e quindi rivalutare. Se il sanguinamento non si ferma, sacrificare l'animale.
  5. Legare il laterale sinistro (LLL) e lobo mediano sinistro (LML) rami. Questi rami hanno un tronco comune. (Figura 3). Il ramo di sinistra del lobo mediano nasce dalla vena portale all'interno del parenchima della formazione permanente.
    1. Legare la vena portale che conduce sia LLL e anche l'amore mio ramo vita insieme usando il pre-taglio cravatta di seta di 6-0.
    2. Evitare lesioni alle arterie che conducono a LLL e amo la mia vita, in esecuzione all'interno dello strato peritoneale. Fintanto che il peritoneo è sbucciato indietro con attenzione, rimangono intatti. Il LLL e amore la mia vita girare visibilmente pallido una volta che i rami sono legati.
  6. Legare il ramo di lobo caudate (Figura 3). La vena portale che conduce a un po' lobi separati caudati in ratti decolla dalla vena portale principale, distalmente e medialmente al decollo del ramo lobo di destra dalla vena portale principale (non strettamente inferiorly come in esseri umani o gli animali più grandi).
    1. Sezionare fuori e circondano sollevando il peritoneo plus dei dotti biliari e arterie dalla vena portale principale.
    2. Circondare il ramo caudate della vena portale con una curva Micropinze provenienti da lateralmente. I due lobi caudati impallidire visibilmente, di una volta che il ramo di lobo caudate è legato con seta 6-0.
  7. Legando questi tre rami della vena portale conduce alla vena portale esclusivo perfusione del lobo in mediana (RML), che è visibile da una linea di demarcazione distinti tra il lobo mediano destro e sinistro.

4. vena portale legatura con il Transection (PVL + T)

  1. Eseguire il transection lungo la linea di demarcazione tra RML e amo la mia vita dopo PVL (Figura 3D).
  2. Utilizzare una pinza bipolare antiaderenti di argento con una punta di neurochirurgica molto fine per precauterize il tessuto del fegato creando una striscia di cauterizzazione 1 mm lungo la linea di demarcazione.
  3. Usare le forbici per tagliare con precisione il tessuto precauterized. È abbastanza difficile da valutare correttamente la profondità del transection. L'obiettivo è quello di ottenere il più vicino alla vena cava come possibile, che corre intrahepatically in ratti. Lesioni della vena cava sono accompagnato da vasto spurgo, che di solito può non essere interrotta.
  4. In caso di infortunio applicare una leggera pressione con un batuffolo di cotone, ma se l'emorragia non si ferma all'interno di 3-4 min, sacrificare l'animale. Tentativi di riparazione della vena cava usando i suturare sono stati generalmente infruttuosi. I ratti sono molto sensibili all'aria embolia, che può verificarsi in occasione e portare all'arresto cardiaco.

5. intraoperative misurazione della pressione venosa portale e Volume

  1. Analisi della pressione della vena portale di incannulazione diretta con un ago di G30 collegato ad un monitor di pressione (Figura 4A).
  2. Uso della sonda di flusso di volume 2 mm disposti lateralmente collegato al dispositivo di flusso per la misura diretta di portata in volume portale in 2 minuti (Figura 4B). Solo registrare dati con qualità di misura stabile come indicato sul display della macchina.
  3. Valutare la pressione e flusso della vena portale separatamente dopo che il gruppo di passaggi che definiscono la procedura rispettiva, cioè la vendita abbinata al largo di tre rami della vena portale o la legatura fuori i tre rami della vena portale più eseguire il transection parenchimatico tra la RML e l'amore la mia vita.

6. ultimi passi della chirurgia

  1. Assicurarsi che il piccolo intestino è posizionato correttamente nella cavità addominale prima della chiusura.
  2. Chiudere il peritoneo e la parete addominale con punti di sutura seta 3-0 con gli aghi SH-1.
  3. Infine suturare la pelle utilizzando Maxon 5-0.
  4. Disinfettare la pelle nuovamente.
  5. Applicare di nuovo 5 mL di soluzione salina per via sottocutanea nel tessuto sottocutaneo laterale all'addome.

7. fegato volumetria in ratti facendo uso di piccolo animale CT

  1. 24 h prima la prima formazione immagine di CT iniettare 200 μL del mezzo di contrasto nella vena caudale attraverso un catetere endovenoso G26.
  2. Utilizzare una micro CT per analizzare i ratti. Metti l'animale in una scatola di plexiglas per indurre l'anestesia generale (prima a filo con 5 vol % per 30 s, seguita da una concentrazione di isoflurane di 2-3% in volume fino a quando l'animale è sotto anestesia e mantenerla durante la scansione tramite un sistema di tubazione). Per una qualità immagine ottimale, è necessario sincronizzare l'esplorazione di CT con la respirazione dell'animale.
  3. Esportare le immagini digitali e le comunicazioni nei file di medicina (DICOM) e analizzarli utilizzando il piattaforma OsiriX 8.0 di imaging di pubblico dominio. Utilizzare lo strumento "poligono chiuso" per disegnare i bordi del lobo basati su radiodensitiy del contrasto delle nanoparticelle nel fegato e utilizzare l'area di menu di interesse (ROI) per calcolare i volumi del fegato parziale (Vedi Figura 2A in Schadde et al. 17)
  4. Nel modello standard, permettono il fegato di crescere oltre i 3 giorni e di ottenere ogni giorno TAC per valutare l'aumento di volume.

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Risultati

La legatura della vena portale due differenti procedure chirurgiche (PVL) e PVL con risultato di transection (PVL + T) nella cinetica di crescita nettamente diverse. PVL induce aumento moderato del volume entro 3 giorni, mentre in PVL + T un lobo spartitraffico destro molto più grande (RML) può essere visto (Figura 5). Questo può essere verificato dalla volumetria quotidiana. Il volume di RML raddoppia approssimativamente entro 3 giorni in PVL, mentre triplic...

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Discussione

Questo protocollo presenta un modello animale di ALPPS con sua rapida ipertrofia indotta da PVL + T, che raddoppia l'aumento di volume all'interno di 3 giorni rispetto ai PVL da solo. 17 il centrale di destra del lobo epatico è usato come un lobo di modello per la coltivazione del fegato perché la centrale del lobo epatico è una massa parenchima contigua fornita da due vene portali separate alla sua sinistra e alla sua destra, come illustrato nella Figura 1 in un rece...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Isoflurano, flaconi da 250 mlAttane, Piramal, Mumbai, IndiaLDNI 22098Attrezzatura veterinaria standard
Vaporizzatore Isofluorane Tec-3Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, ILnon più disponibileAttrezzatura veterinaria standard 
Buprenorfina (Temgesic)Indivior, Baar, Svizzera7680419310353
unguento alla vitamina ABausch& Lomp, Zugo, Svizzera7680223980247Numero GTIN
Atropina solfato 0,5 mg/mLSintetica SA, Mendrisio, Svizzera7680565330045Numero GTIN
Microscopio per microchirurgiaOlympus, Tokio, GiapponeSZX10Attrezzatura veterinaria standard
BetadineMundipharma, Basilea, Svizzera7680342821377con numero GTIN
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, GermaniaNK83.1Mini-spugne
Divaricatori per pareti addominaliN/AN/AAutocostruiti con graffette e Q-Tips
3-0 seta Ethicon, Sommerville, NJK872Hchirurgiche standard
 Strumenti di precisione del mondo (WPI), Sarasota, FL503371Pinze adson microchirurgiche standard
diprecisione del mondo (WPI), Sarasota, FL501244-GMicrochirurgia standard
Micropinze a punte finiStrumenti di precisione del mondo (WPI), Sarasota, FL501976Le punte devono essere lucidate regolarmente
Micropinze a punte fini curveStrumenti di precisione del mondo (WPI), Sarasota, FL504513Essenziale per andare intorno ai rami della vena porta 
6-0 LOOK seta intrecciata neraSurgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA SP114Bobina, pretagliata prima della procedura
2-0 suture di setaEthicon, Sommerville, NJK833chirurgiche standard
5-0 maxonCovidien, Dublino, Irlanda6608-21
Micropinze bipolariSutter, Friburgo, Germania780148SGSEssenziale per la transezione parenchimale
Cotton fioc piccoloCarl Roth GmbH, Karlsruhe, GermaniaEH11.1
Cotton fiocCarl Roth GmbH, Karlsruhe, GermaniaXL54.1G30 chirurgico standard
 Terumo, Tokyo, GiapponeNN-3013R Apparecchiature per anestesia standard
Sonda di portata volumetrica da 2 mm Transonic Systems, Ithaca, NYMA-2PSLa più piccola sonda disponibile per il misuratore di portata HAT-311
Misuratore di portata transonicoTransonic Systems, Ithaca, NYHAT-311 Misuratore di portata transsonico QCUno dei misuratori di portata di prima generazione per chirurgia
ExiTron nano 12.000Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germania130-095-698Mezzo di contrasto nanomoloecolare che opacizza il fegato e la milza
Catetere endovenoso G26Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ391349Apparecchiature per anestesia standard
Quantum FX MicroCT Perkin Elmer, Waltham, MA N/AScanner CT standard per piccoli animali presso l'istituto di fisiologia, Università di Züuml; rich
OsiriX 8.0Pixmeo Sarl, Ginevra, SvizzeraN/ASoftware di pubblico dominio : www.pixmeo.com
con numero GTIN Spugne Forbici Strumenti Suture chirurgiche standard chirurgici standard grande Ago

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