Questo lavoro descrive la standardizzazione di un metodo per ottenere le popolazioni di cellule germinali purificate dal tessuto testicolo di diverse specie di mammiferi. È un protocollo diretto che combina la dissociazione meccanica dei testicoli, la colorazione con Hoechst-33342 e il ioduro di propidium e l'ordinamento FACS, con ampie applicazioni in studi comparativi della biologia riproduttiva maschile.
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Articolo metodologico
Un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) è stata uno dei metodi di scelta per isolare popolazioni arricchite di cellule germinali testicolari mammiferi. Attualmente permette di discriminare fino a 9 popolazioni di cellule germinali ad alto rendimento e purezza. Questa alta risoluzione in discriminazione e purificazione è possibile grazie a cambiamenti unici nella struttura e quantità di cromatina durante la spermatogenesi. Questi schemi possono essere catturati mediante citometria a flusso di cellule germinali maschiate colorate fluorescenti di DNA come Hoechst-33342 (Hoechst). Ecco una descrizione dettagliata di un protocollo recentemente sviluppato per isolare cellule germinali testicolari mammiferi. In breve, sospensioni singole cellule sono generate dal tessuto testicolo mediante dissociazione meccanica, doppiate con Hoechst e ioduro di propidium (PI) e trattate mediante citometria a flusso. Una strategia di gateway seriale, compresa la selezione di cellule vive (PI negative) con diverso contenuto di DNA (intensità di Hoechst), iS utilizzato durante l'ordinamento FACS per discriminare fino a 5 tipi di cellule germinali. Queste includono, con corrispondenti purezza medie (determinate dalla valutazione microscopica): spermatogoni (66%), spermatosi primari (71%) e secondari (85%) e spermatidi (90%), ulteriormente separati in tondo (93%) e allungamento (87%) delle sottopopolazioni. L'esecuzione dell'intero flusso di lavoro è semplice, consente l'isolamento di 4 tipi di celle contemporaneamente con la macchina FACS appropriata e può essere eseguita in meno di 2 ore. Poiché il tempo di lavorazione ridotto è fondamentale per preservare la fisiologia delle cellule ex vivo , questo metodo è ideale per gli studi ad alta produttività a valle della biologia delle cellule germinali maschili. Inoltre, un protocollo standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali dei mammiferi elimina le fonti metodologiche di variabili e consente un singolo insieme di reagenti da utilizzare per diversi modelli animali.
Introduzione
Data la mancanza di un sistema in vitro rappresentativo della progressione della spermatogenesi e la presenza di una grande eterogeneità cellulare nei testicoli, gli studi sulla biologia delle cellule germinali maschili richiedono tecniche robuste per isolare popolazioni arricchite di specifici tipi di cellule. La classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) è stata ampiamente utilizzata per questo scopo 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in quanto fornisce elevata resa e purezza e supera altri m....
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Protocollo
Tutte le procedure descritte di seguito sono state conformi alle norme del comitato di studio sugli animali presso l'Università di Washington a St. Louis.
1. Preparativi per il protocollo di dissociazione meccanica
- Pre-bagnare una cartuccia di disaggregazione dei tessuti monouso da 50 μm per la dissociazione di un testicolo murino completo.
NOTA: Questa cartuccia di disaggregazione dei tessuti monouso contiene micropiastre progettate per il taglio di tessuti e una maglia in acciaio immobile con circa 100 fori esagonali. Sono disponibili diverse dimensioni di maglie per la cartuccia di disaggregazione....
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Risultati
Sospensioni singole cellule dalla dissociazione meccanica dei tessuti testicolari
La Figura 2 confronta le sospensioni di una singola cellula ottenute dalla dissociazione meccanica del tessuto testicolare del mouse in condizioni diverse. I campioni ottenuti mediante l'elaborazione di tessuti freschi, non colorati ( Figura 2A ) o colorati con Hoechst (
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Discussione
Considerando le dinamiche cromatografiche altamente conservate durante la spermatogenesi nei mammiferi, l'obiettivo di questo lavoro era quello di sviluppare un protocollo per isolare le cellule germinali maschili in differenti stadi di differenziazione dai diversi tessuti testicolari dei mammiferi ( Figura 1 ). Uno degli ostacoli principali nell'applicazione di un unico flusso di lavoro a modelli animali diversi è la necessità di adeguamenti specifici delle specie, in particolare p.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) per i testicoli del cane; Jason Arand e il laboratorio del Dott. Ted Cicero presso l'Università di Washington di St. Louis (WashU) per aver fornito i test di ratto e Brianne Tabers per assistere alla raccolta; Jared Hartsock e il laboratorio del Dr. Salt al WashU per i testicoli della cavia; E il Dott. Michael Talcott presso la Divisione di Medicina Comparativa a WashU per il testicolo di maiale in miniatura. Gli autori riconoscono inoltre il Centro di Cancer di Alvin J. Siteman presso la Scuola di Medicina di Washington e l'Ospedale Ebreo di Barnes a St. Louis, MO, per l'utilizzo del Site....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4% paraformaldeide | VWR | #15710 | 4% PFA, Per il fissaggio di cellule selezionate |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | Sistema per la dissociazione del testicolo |
| 1X Dulbecco modificato Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, per la dissociazione del testicolo |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Cartuccia di disaggregazione per la dissociazione del testicolo |
| Siero fetale bovino | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, per la raccolta FACS |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, Per colorazione |
| FACS40 & micro; filtro per cellule m | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | Per la dissociazione del testicolo |
| 100 piastre di Petri da 15 mm | Falcon | #351029 | Per la dissezione del testicolo |
| Provette a fondo tondo in polipropilene da 5 mL | Falcon | #352063 | Per la raccolta FACS |
| Provette Eppendorf da 1,5 mL | VWR | #20170-650 | Per la raccolta FACS |
| Siringa inutile da 3 mL | BD Biosciences | #309657 | Per la dissociazione del testicolo |
| Provetta conica da 50 ml | MIDSCI | Per la dissociazione del testicolo | |
| Ioduro di propidio | Invitrogen | #L7011 | PI, Per colorazione FACS |
| Selezionatore cellulare MoFlo Legacy | Beckman Coulter | #ML99030 | Per il software di selezione cellulare FACS |
| Summit | Beckman Coulter | #ML99030 | Per FACS |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, Per microscopia |
| Vetrino microscopico | Fisher Scientific | #12-544-4 | Per microscopia |
| Vetrino coprioggetti | Fisher Scientific | #12-548-87 | Per microscopia |
| Pipetta di trasferimento monouso (3 mL) | Samco Scientific | #225 | Per dissociazione testicolare |
| DNasi I | Roche | #10104159001 | Per dissociazione testicolare |
| Lama chirurgica in acciaio al carbonio | Miltex | #4-111 | Per dissezione testicolare |
| Contatore di cellule automatizzato Countess | Invitrogen | #C10227 | Per il conteggio automatico delle cellule |
| Soluzione blu di tripano (0,4%) | Sigma | #T8154 | Per la colorazione di vitalità |
Riferimenti
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr ....
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Ristampe e permessi
