Articolo metodologico

Saggio per la fosforilazione e l'associazione dei microtubuli con localizzazione della proteina Tau in cellule di cancro del colon-retto

DOI:

10.3791/55932

⸱

10 ottobre 2017

 ,  , 
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto descrive protocolli standard per la misurazione iperfosforilazione di tau, associazione tau ai microtubuli e la localizzazione intracellulare Tau dopo trattamenti farmacologici di misura. Questi protocolli possono essere utilizzati in modo ripetitivo per lo screening di farmaci o altri composti che ottenere tau iperfosforilazione o dei microtubuli associazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il tau proteina microtubule-collegata è una proteina di un neurone che si localizza principalmente negli assoni. Generalmente il tau è essenziale per il normale funzionamento neuronale perché è coinvolto nella stabilizzazione e microtubuli. Oltre a neuroni, tau è espresso in umano del seno, prostata, gastrica, del colon-retto e cancri del pancreas dove Mostra struttura quasi simile ed esercita funzioni simili come il tau neuronale. La quantità di tau e sua fosforilazione può modificare la sua funzione come stabilizzatore dei microtubuli e portare allo sviluppo di filamenti elicoidali accoppiati in diversi processi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer. Determinazione dello stato di fosforilazione di tau e le sue caratteristiche di microtubule-leganti è importante. Inoltre, esaminando la localizzazione intracellulare di tau è importante in diverse malattie. Questo manoscritto particolari protocolli standard per la misurazione di fosforilazione di tau e associazione tau i microtubuli in cellule di cancro colorettale con o senza curcumina e trattamento di LiCl. Questi trattamenti possono essere utilizzati per interrompere lo sviluppo e la proliferazione della cellula tumorale. Localizzazione intracellulare di tau è esaminati mediante immunoistochimica e microscopia confocale durante l'utilizzo di basse quantità di anticorpi. Queste analisi possono essere utilizzate ripetutamente per lo screening di composti che influenzano l'iperfosforilazione di tau o associazione dei microtubuli. Approcci terapeutici utilizzati per differenti Taupatie o relativi agenti anticancro potenzialmente possono essere caratterizzati tramite questi protocolli.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau è stata originariamente identificata come una proteina microtubule-collegata di termo-stabile che è stato co-purificata con tubulina1. Tau è espresso esclusivamente in più alti eucarioti2,3,4. La funzione principale di tau è quello di controllare microtubule Assemblea1,5,6. Contribuisce anche alla polimerizzazione dei microtubuli7, trasporto assonale8, cambiamenti nel diametro assonale9, formazione di neuroma polarità e neurodegenerazione10. Tau funge anche da un'impalcatura di proteine per controllare alcune vie di segnalazione. Gli studi del cervello di ratto suggeriscono che tau è neurone-specifico e che localizza principalmente in assoni11. Perché tau è essenziale per la polimerizzazione dei microtubuli e sviluppo neuronale, tau è stata supposta per svolgere un ruolo importante nello sviluppo di axonal nel sistema nervoso centrale; Questa ipotesi è stato successivamente verificato da esperimenti in vitro e in vivo . Oltre ai neuroni, tau è espresso in cellule non neuronali differenti, compreso fegato, rene e muscolo cellule12,13. Tau è espresso anche in umano del seno, della prostata, del colon-retto, gastrica e cancro del pancreas cella linee e tessuti14,15,16,17,18, 19. tau si trova anche nella miosite come twisted tubulofilaments in corpi di inclusione20.

Tau può trasportare parecchie modifiche post-traduzionali. Di tutte le modifiche post-traduzionali, fosforilazione è il più comune. Fosforilazione di tau aumento diminuisce la sua affinità per i microtubuli, infine destabilizzare il citoscheletro. Siti di fosforilazione di ottantacinque sono stati descritti nella proteina tau isolato dai tessuti di cervello umano del morbo di Alzheimer. Di questi siti, 53% costituiscono serina, treonina 41% e solo 6% tirosina residui21,22,23. La fosforilazione di Tau influisce sulla sua localizzazione, funzione, associazione, solubilità e della sua suscettibilità ad altre modificazioni post-traduzionali. Anche la fosforilazione di tau a oltre la misura normale (o completamente saturo con gruppi fosfato) è conosciuto come iperfosforilazione che replica le caratteristiche strutturali e funzionali del morbo di Alzheimer24. Tau mantiene il corretto funzionamento dei microtubuli assonali e assicura il normale funzionamento neuronale in condizioni fisiologiche. Tuttavia, tau iperfosforilata non riesce a mantenere un'associazione ben organizzata dei microtubuli, causando la perdita di un neurone a causa di disassemblaggio dei microtubuli. Sono necessari per tau corretto funzionamento normali livelli di fosforilazione di tau, ma tau non riesce a funzionare normalmente se il livello di fosforilazione caratteristico è alterato e se è hyperphosphorylated25. Nel morbo di Alzheimer e di alcuni altri disordini neurodegenerative relativi all'età, tau diventa hyperphosphorylated e forma i filamenti elicoidali accoppiati e grovigli neurofibrillary26,27. Così, i metodi per determinare la fosforilazione di tau e associazione dei microtubuli sono importanti.

Cancro colorettale, un cancro di invecchiamento-collegato, è che il terzo più frequentemente diagnosticato cancro e il terzo cancro prominente di causa di morte per uomini e donne28. Il cancro colorettale è uno dei cancri più principali causa di morte nel mondo occidentale29. Perché sia cancro colorettale e morbo di Alzheimer sono associate con l'invecchiamento e sia capita soprattutto nei paesi sviluppati, dove le persone godono simili abitudini alimentari, le due malattie possono in qualche modo essere correlate. Inoltre, le cellule tumorali tau-positivi e negativi tau rispondono in modo diverso agli agenti chemioterapeutici, ad es., paclitaxel16.

La curcumina è uno dei principali derivati di Curcuma longa, la curcuma spezia indiana30. Per secoli, popolazioni sud asiatiche hanno consumato curcuma nella loro dieta su base giornaliera. La curcumina è usata per trattare diverse patologie, compreso cancro colorettale, morbo di Alzheimer, diabete, fibrosi cistica, malattie infiammatorie intestinali, artrite, iperlipidemia, aterosclerosi e malattia cardiaca ischemica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. al litio può anche uccidere le cellule tumorali del colon-retto o prevenire la loro proliferazione39. Litio può essere utilizzato anche per il trattamento del morbo di Alzheimer40 come si diminuisce l'aggregazione di tau e impedisce la sua iperfosforilazione come osservato in un topo transgenico modello41,42,43, 44.

Questo manoscritto si propone di: 1) misurare la tau totale e livelli di espressione di phospho-tau in cellule trattate; 2) descrivere un'analisi della fosfatasi per misurare la fosforilazione di tau complessiva; 3) esaminare microtubule-leganti di tau; e 4) localizzare tau mediante microscopia confocale in linee cellulari di cancro colorettale trattate con curcumina o LiCl. I risultati rivelano che il trattamento delle cellule con la curcumina, che è un agente chemioterapeutico apparentemente buono per tumore del colon, e trattamento con LiCl può ridurre l'espressione di entrambi tau totale e fosforilato tau in linee cellulari di cancro colorettale. Questi trattamenti possono anche causare la traslocazione nucleare di tau. Tuttavia, inaspettatamente, la curcumina non riesce a migliorare associazione di tau i microtubuli.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparazione dei reagenti

  1. aggiungere 10 µ l di soluzione di fluoruro phenylmethylsulfonyl di (1 mM), 10 µ l (1 x da deposito x 100) di soluzione cocktail dell'inibitore di proteasi e 10 µ l (1 x da deposito x 100) di fosfatasi il soluzione cocktail inibitore a 1 mL di tampone di dosaggio (RIPA) x radioimmunoprecipitation 1 per preparare il tampone di lisi completa RIPA.
  2. Preparare 10 x buffer buffer (PEM) generale tubulina.
    1. Aggiungi 800mm (6,0474 g) piperazina-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic acido, 10 mM (95,1 mg) glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetico acido, 10 mM (51 mg) MgCl 2 e 1,25 M (3 mL di 10 M) NaOH in un tubo da 50 mL , mescolare con 15 mL di acqua distillata e sciogliere utilizzando un vortice. Controllare il pH (dovrebbe essere 6,9). Se pH > 6.9, scartare il buffer e rifare un sacco di fresco.
      Nota: NaOH dovrebbe essere inferiore a 1,25 M per garantire che il pH non overshoot 6,9. Non è consigliabile utilizzare HCl per regolazione pH > 6.9.
    2. Aggiungi NaOH goccia a goccia fino a quando il pH è 6.9. Aggiungere acqua distillata per fare fino a 25 mL di buffer di 10 X PEM. Infine, applicare un filtro tramite una siringa e un filtro per siringa 0,2 µm. Dividere questo buffer in aliquote in provette da 1,5 mL e conservare a 4 ° C.
  3. Preparare 5 x tampone del campione con agente riducente e tintura.
    1. Mix 300 µ l (60 mM) di 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25%) di glicerolo al 50%, 1 mL (2%) di 10% sodio dodecil solfato (SDS) e 1,2 mL di acqua distillata per compensare 5 mL di SDS sample buffer 5x. Conservare a − 20 ° C.
      Nota: Poiché il glicerolo è viscoso, misura 1,25 mL glicerolo è difficile. Un mL di glicerolo al 100% pesa 1,26 g. Così, pesare 1,575 g di glicerolo al 100% (che equivale a 1,25 mL del 100% o 2,5 mL di glicerolo al 50%) in un 15 mL tubo prima; mescolare bene con gli altri componenti.

2. Cultura, trattamento con curcumina o trattamento LiCl e l'esame dell'espressione della proteina delle cellule

  1. Aggiungi ~ 1 x 10 6 HCT 116 celle in 100 mm piatti di coltura del tessuto contenente la Media essenziale minimo (MEM) completati con 10% fetale bovino siero (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina. Dopo un giorno di coltura, le cellule raggiungerà la confluenza di 60-70%.
    Nota: Il numero di piatti necessari dipende dal numero di trattamenti descritti di seguito.
  2. Quando le cellule raggiungono ~ 65% confluenza (approssimata utilizzando la microscopia), rimuovere il mezzo MEM completati e aggiungere MEM privo di siero con 5 µM 10 µM e 30 µM curcumina o 25 mM, 50 mM e 100 mM LiCl. Incubare a 37 ° C per 24 h in atmosfera umidificata contenente 5% CO 2.
  3. 24 h dopo il trattamento, lavare le cellule con soluzione di 1 mL ghiacciata tampone fosfato (PBS) e raschiare le celle utilizzando un raschietto di cella. Trasferimento le cellule raschiate in 1,5 mL provette da centrifuga e centrifugare per 4 min a 1.800 x g a 4 ° C per ottenere il pellet cellulare.
  4. Lisare le cellule sospendendo il pellet in 100 µ l di buffer RIPA completo a 4 ° C per 20 minuti mentre toccando regolarmente i tubi. Sottoporre brevemente agli ultrasuoni campioni.
  5. Centrifugare gli omogeneati delle cellule in una centrifuga da banco a 22.570 x g per 20 min a 4 ° C. trasferire i surnatanti in altre provette usando una pipetta.
  6. Misurare la concentrazione di proteina nei surnatanti del saggio di Bradford 45 usando i kit commerciali di analisi della proteina.
    7. Buffer di gel-caricamento di
  7. preparare campioni di concentrazione nella proteina uguale (10 µ g proteine/13 µ l di campione) dei lisati cellulari con 4 X SDS. Preparate 4 x buffer di gel-caricamento SDS fresco contenente 400 mM dithiothreitol (DTT).
    Nota: In questa fase, campioni possono essere conservati a − 20 ° C, se necessario.
  8. Incubare i campioni su un blocco di calore a 100 ° C per 5 min, mescolano i campioni utilizzando un vortice e aspettare per raffreddarli per ~ 10-15 min.
  9. Montare un sistema di elettroforesi.
    1. Carico 10 µ g proteine (13 µ l di campione) per bene su un gel di SDS-poliacrilammide del 10% per elettroforesi (SDS-PAGE). Caricare la scala di peso molecolare sul gel a una sola corsia.
      Nota: Elettroforesi all'avvio, la scala di proteina risolverà in fasce della proteina di peso molecolare apparente. Utilizzare queste bande per stimare il peso molecolare delle bande proteiche sconosciuto.
    2. Dopo aver caricato i campioni, collegare gli elettrodi positivi e negativi del sistema elettroforesi a una fonte di alimentazione per mantenere una tensione costante. Inizialmente, iniziare a 70 V per 20 min a spostare i campioni di proteine dal gel d'impilamento in gel di risoluzione. Quindi, aumentare la tensione a 125 V per circa 70-120 min fino a campioni e scaletta della proteina raggiunge la fine del gel.
    3. Dopo il completamento dell'elettroforesi, il gel di trasferimento ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) utilizzando un sistema di electroblotting bagnato. Trasferimento per ~ 100 min a 100 V. blocco della membrana in tampone bloccante 4% albumina di siero bovino (BSA) per 90 min a temperatura ambiente di circa 25 ° C.
  10. Contrassegnare il blot tagliandolo sul lato con la scala di peso molecolare. Utilizzare un foglio di plastica trasparente e un cutter affilato per tagliare la macchia. Preparare le soluzioni primarie-anticorpo (anti-tau al 1:5, 000; anti-phospho-tau al 1:4, 000) e incubare la macchia in questa soluzione a 4 ° C durante la notte.
  11. Dopo incubazione overnight, lavare la macchia per 7 min quattro volte in soluzione tampone fosfato salino-Tween-20 (PBST).
  12. Preparare le soluzioni pertinenti di secondaria-anticorpo (anti-coniglio di capra o anti-IgG di topo a 1:5, 000) e incubare la macchia in questa soluzione per 90 min a temperatura ambiente di circa 25 ° C. lavare in PBST quattro volte, 7 min ogni.
  13. Sviluppare la macchia usando un kit di chemiluminescenza secondo il produttore ' consigli di s. Coprire la macchia usando un involucro di plastica trasparente. Acquisire immagini da una sistema per chemiluminescenza con relativo software di imaging di chemiluminescenza.

3. Analisi della fosfatasi

  1. trattare i lisati di cellule (dal punto 2.5) con fosfatasi alcalina nel buffer della fosfatasi alcalina.
    1. Per sia il controllo e campioni trattati, preparare 20 µ l campioni contenenti 20 µ g proteina totale. Aggiungere il volume di lisati cellulari che contiene 20 µ g proteine totali, seguita da 2 µ l di tampone di fosfatasi alcalina e 10 µ l fosfatasi alcalina. Aggiungere acqua distillata per compongono 20 µ l.
  2. Incubare i campioni a 37 ° C per 1 h. fermare la reazione aggiungendo acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) ad una concentrazione finale di 50 mM, o aggiungendo orthovanadate del sodio (Na 3 VO 4) ad una concentrazione finale di 10 mM. La reazione può essere fermata anche da riscaldamento a 75 ° C per 5 min.
  3. Prima che finisca l'incubazione dei campioni con fosfatasi, preparare i campioni della stessa concentrazione senza aggiunta di fosfatasi per confronto con campioni trattati con fosfatasi.
  4. Aggiungi il 4 preparata buffer di gel-caricamento SDS X contenente 400 mM DTT.
  5. Incubare i campioni su un blocco di calore a 100 ° C per 5 min, Mix i campioni utilizzando un vortice. Raffreddare a temperatura ambiente per ~ 10-15 min.
  6. Assemblare un sistema di elettroforesi per l'esecuzione di un gel di poliacrilammide di 10% SDS-page.
    1. Carico 10 µ g proteine (13 µ l di campione) per bene su un polyacry di 10%gel di Lilliu. Caricare la scala di peso molecolare.
    2. Dopo il caricamento del campione, collegare gli elettrodi positivi e negativi del sistema elettroforesi a una fonte di alimentazione per mantenere una tensione costante. Inizialmente, iniziare a 70 V per 20 min a spostare i campioni di proteine dal gel d'impilamento in gel di risoluzione. Quindi, aumentare la tensione a 125 V ed eseguire il gel per circa 70-120 min fino a campioni e scaletta della proteina raggiunge la fine del gel.
    3. Dopo il completamento dell'elettroforesi, trasferire il gel su una membrana PVDF utilizzando un sistema di electroblotting bagnato. Trasferimento per ~ 100 min a 100 V.
    4. Mark il blot facendo un piccolo taglio sul lato della scala di peso molecolare. Utilizzare un foglio di plastica trasparente e un cutter affilato per tagliare il blot.
  7. Bloccare la membrana in tampone bloccante di 4% BSA per 90 min a temperatura ambiente.
  8. Incubare la macchia in soluzione primaria-anticorpo (anti-tau al 1:5, 000) a 4 ° C durante la notte. Lavare la macchia in PBST quattro volte, per 7 minuti ciascuno,.
  9. Preparare la soluzione di anticorpo secondario pertinente (capra anti-IgG di topo a 1:5, 000) e incubare la macchia per 90 min a temperatura ambiente. Lavare in PBST quattro volte, per 7 minuti ciascuno,.
  10. Sviluppare la macchia usando un kit di chemiluminescenza secondo il produttore ' consigli di s. Coprire la macchia all'interno di un involucro di plastica trasparente. Acquisire immagini da una sistema per chemiluminescenza con relativo software di imaging di chemiluminescenza.

4. Dosaggio di microtubule-leganti

  1. per il dosaggio di associazione dei microtubuli, ripetere i passaggi da 2.1-2.6.
  2. Preparare 1 X (2 mL) PEM tampone dal buffer di 10 X PEM conservati a 4 ° C aggiungendo 20 µM (40 µ l) paclitaxel e GTP (20 µ l) di 1 mM. Fare il microtubulo (MT) punto da − congelatore 80 ° C e lo stock di lavoro tau di e. coli da − congelatore 20 ° C.
  3. Preparare campioni come da tabella 1.
  4. Incubare a 37 ° C per 30 min. ultracentrifuga a 25 ° C per 60 min a 100.000 x g.
  5. Trasferire 120 µ l di sovranatante contenente non associato tau, per pulire e provette.
  6. Aggiungere 120 µ l (stesso volume come supernatante) di 5 X campione buffer per il pellet contenente associato tau e mescolare accuratamente. Trasferire la soluzione per pulire le provette e mescolare accuratamente.
  7. Misurare la concentrazione di proteina (Vedi punto 2.6).
    Nota: Durante la preparazione dei campioni, utilizzare il volume della soluzione (punto 4.6) per la preparazione dei campioni il pellet e il surnatante.
  8. Preparare campioni di concentrazione nella proteina equivalente e aggiungere preparate 4 x buffer di gel-caricamento SDS contenente DTT (400 mM).
    Nota: I campioni possono essere conservati a − 20 ° C in questa fase.
  9. Ripetere i passaggi da 3.5-3.10.
di < td colspan = " 2">
esempio nome Microtubule necessari principale proteina necessaria PEM-GTP-PTX
1 2 μl HCT 116-controllo (6.21 μg/μl) 9.66 μl (60 μg) μl 108.34
2 HCT 116-curcumina 10 μM (4.81 μg/μl) 2 μl μl 16.63 (80 μg) 101.37 μl
3 HCT 116-curcumina 20 μM (3,28 μg/μl) 2 μl μl 30.49 (100 μg) μl 87.51
4 HCT 116-LiCl 25mm (5.43 μg/μl) 2 μl μl 18.42 (100 μg) 99.58 μl
5 Escherichia coli tau μl 2 1 μl Tau-352 μl 117
6 MT solo μl 2 X μl 118
120 μl di ogni

tabella 1: preparazione per l'analisi di microtubule-leganti del campione.

5. localizzazione ed espressione di Tau dopo trattamento delle cellule con curcumina

  1. un vetrino coprioggetti utilizzando etanolo al 70% di pulirlo e asciugarlo utilizzando un tessuto di laboratorio. Inserire un singolo vetrino coprioggetti in ciascun pozzetto di una piastra con etichetta 6-pozzetti-coltura del tessuto. Collocare la piastra su una sicurezza biologica armadio e accendere una luce UV per almeno 3 h.
  2. Sottocultura le cellule e loro seme nei pozzetti della piastra 6 pozzetti pertinenti a 2,5 x 10 5 cellule/pozzetto in terreno di coltura consigliata.
  3. Dopo ~ 24 h, esaminare le cellule con un microscopio invertito utilizzando sia il 10 X e 40 X obiettivi per verificare alterazioni morfologiche cellulari. Registrare foto se necessario.
  4. Sciacquare le cellule due volte con PBS. Fissare le cellule in 3,7% formaldeide in un incubatore a 37 ° C al buio.
    Nota: La fissazione di formaldeide a temperatura ambiente funziona bene, troppo. Indossare adeguati dispositivi di protezione personale per maneggiare formaldeide.
  5. Lavare le cellule in PBS. Difficoltà cellule in metanolo ghiacciato a − 20 ° C per 15 min Permeabilize le cellule di incubarle in 3% BSA e 0,1% Triton X-100 in PBS in ghiaccio per 10 min. lavare le cellule con PBS.
  6. Incubare le cellule in tampone bloccante (3% BSA e 0,1% Tween-20 in soluzione PBS) per 1 h a temperatura ambiente.
    Nota: Incubazione per 2 ore a 4 ° C funziona bene, anche.
  7. Preparare la soluzione primaria-anticorpo (anti-tau al 1: 200) in 3% BSA e 0,1% Tween-20 in PBS (ad es., 2 µ l tau-13 anticorpo in 0,4 mL di tampone).
  8. Tagliare piccoli pezzi di un PVDF membrana modo che i pezzi si incastrano correttamente all'interno di ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti; in ammollo in acqua per 5 min, posto il taglio PVDF in ciascun pozzetto.
  9. Aggiungere 60 µ l di soluzione di anticorpo primario al taglio pezzi PVDF in ciascun pozzetto. Posizionare i vetrini coprioggetti tale che le cellule possono toccare la soluzione primaria-anticorpo. Incubare per una notte a 4 ° C in una camera buia, umida. Quattro tempi di lavaggio in PBS.
  10. Preparare la soluzione di anticorpo secondario (coniugato con fluoresceina 594 anti-IgG di topo a 1: 400) in 3% BSA e 0,1% Tween-20 in PBS.
  11. Tagliare piccoli pezzi di una membrana PVDF, in modo che i pezzi adattano correttamente all'interno di ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti e metterli a bagno in acqua per 5 min, posto il taglio PVDF in ciascun pozzetto.
  12. Aggiungere 80 µ l della soluzione secondaria-anticorpo per ognuno dei pezzi PVDF in lastra 6 pozzetti. Posizionare il vetrino coprioggetto tale che le cellule possono toccare la soluzione di anticorpo secondario. Incubare i quattro volte in una camera buia, umida a temperatura ambiente per 2 h. lavaggio con PBS.
  13. Mount campioni nel mezzo di montaggio con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e fissare i coprioggetti su vetrini.
    1. Aggiungi una goccia di mezzo di montaggio con DAPI sulle lastre di vetro. Togliere i vetrini coprioggetto da ciascun pozzetto e metterli sulle lastre di vetro contenente il mezzo di montaggio con DAPI. Assicurarsi che la superficie di ogni vetrino coprioggetti contenenti cellule marcate tocca il mounmezzo di Ting su vetrino corrispondente.
    2. Applica smalto tutto intorno ogni vetrino coprioggetto per sigillare e correggerli ermetico sulle lastre di vetro. Se necessario, eseguire questo passaggio due volte.
  14. Incubare per 1,5 h a temperatura ambiente in una camera oscura.
  15. Esaminare i vetrini con un microscopio confocale utilizzando olio di immersione sul coprioggetto in una stanza buia.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Espressione di totale tau e fosfo-tau è stata esaminata dopo aver trattato le cellule con differenti concentrazioni di curcumina o LiCl (Figura 1). Trattamento delle cellule con le tre diverse concentrazioni di curcumina ha fatto diminuire i livelli di espressione di tau; Tuttavia, phospho-tau espressione aumentata dal trattamento con bassa concentrazione di curcumina ma è diminuito al momento trattando le cellule con alte concentrazioni di curcumina. Anti-ph...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto stabilito diverse condizioni procedurale per la rilevazione totale tau e fosforilato tau in cellule di cancro colorettale trattate con curcumina e LiCl. Per valutare lo stato generale di fosforilazione di tau nei campioni della proteina, è stata descritta un'analisi della fosfatasi. Questo test può potenzialmente utilizzabili per esaminare lo stato di fosforilazione di tutta la proteina.

Questa analisi è basata sul principio che fosforilato proteina mosse più lento del suo s...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano che non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata eseguita come parte del progetto dal titolo "Sviluppo e industrializzazione di alto valore materie prime cosmetiche da microalghe marine", finanziato dal Ministero degli oceani e pesca, Corea e fu sostenuta da una sovvenzione intramurale (2Z04930) da KIST Gangneung Istituto di prodotti naturali.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
HCT 116 celleATCC, CCL-247
MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
Siero fetale bovino (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Conservare a -20 gradi; C
penicillina-streptomicinaHycloneSV30010
Soluzione di tripsina-EDTAWelGeneLS 015-01
Piastra da 100 mmCorning430161
Piastra a 6 pozzettiCorningCoster 3516
Anticorpo anti-Tau 13abcamab19030
Ditiotreitolo (DTT)Roche10 708 984 001Temperatura di stoccaggio 2– 8 ° C
Centrifughe per microlitriHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Temperatura di stoccaggio 2– 8 ° C
CurcuminaSigma-Aldrich (Fluka)78246Temperatura di conservazione 2– 8 °
C Microtubuli (MT)CitoscheletroMT001Conservare a 4 ° C (essiccato)
Terreno di montaggio con DAPIVector LaboratoriesH-1200Conservare a 4 gradi C al buio
Idrossido di sodioSigma72068
Cloruro di magnesioSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Conservare a -20 ° C
DPBSWelGeneLB 001-02
Sonic DismembratorFisher ScientificModel 500
UltracentrifugaBeckman CoulterOptima L-100 XP
PIPESSigmaP1851
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaA7906
Molecular ImagerBio-RadChemiDoc XRS+Conservare a 4 gradi C
Reagente colorante per il dosaggio delle proteineBio-Rad500-0006
&alfa;-tubulina (11H10) Corpo monoclonale di coniglioSegnalazione cellulare2125
GAPDH (14C10) Corpo monoclonale di coniglioSegnalazione cellulare2118
Anticorpo anti-Tau (fosfo S396)abcamab109390
EGTASigmaE3889Conservare a temperatura ambiente
Fosfatasi alcalina termosensibile FastAPThermo ScientificEF0651Conservare a -20 ° C
PMSFSigmaP7626Conservare a temperatura ambiente
Cocktail di inibitori della fosfatasi Segnalazionecellulare5870Conservare a 4 gradi C
Proteinasi inibitore della proteasi cocktaildi segnalazione cellulare5871Conservare a 4 gradi C
RIPA BufferSigmaR 0278Temperatura di stoccaggio 2– 8 ° C
Tau-352 umanoSigmaT 9950Negozio a -20 ° C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Negozio a circa 25 gradi C
membrana PVDFBio-Rad162-0177
Capra anti-topo IgG Anticorpo secondarioThermoFisherA-11005Conservare a 4 gradi C al buio
Microscopia confocaleLeica MicrosystemLeica TCS SP5
Sodio Dodecil Solfato (SDS)Affymetrix75819
Protein AssayBio-Rad500-0006Conservare a 4 gradi; E
, , ,

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526(2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
  29. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  30. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  31. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  32. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  33. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  34. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  35. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  36. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  37. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  38. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  39. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864(2014).
  40. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  41. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  42. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  43. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  44. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  45. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  47. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  48. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  49. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  50. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9(2016).
  51. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Fosforilazione della tauLocalizzazione della tauMicroscopia confocaleWestern blotSaggio della fosfatasiImmunoistochimicaTrattamento con curcuminaCloruro di litio

Articoli correlati