Articolo metodologico

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

DOI:

10.3791/55936

⸱

1 gennaio 2018

 ,  ,  , 
1The Institutes of Brain Science, the State Key Laboratory of Medical Neurobiology, the Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la stabilizzazione del livello di ossigeno in un piccolo volume di tampone riciclato e aspetti metodologici della plasticità sinaptica attività-dipendente di registrazione in fettine ippocampali acute sommersi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anche se gli esperimenti su fettine di cervello sono stati in uso fin dal 1951, permangono problemi che riducono la probabilità di realizzare un'analisi stabile e di successo della modulazione della trasmissione sinaptica durante l'esecuzione di registrazioni sul campo potenziale o intracellulare. Questo manoscritto descrive aspetti metodologici che potrebbero essere utili nel migliorare le condizioni sperimentali per la manutenzione delle fette del cervello acuto e per la registrazione di potenziali postsinaptici eccitatori di campo in una camera di immersione disponibili in commercio con un'unità di deflusso-carbogenation. Il deflusso-carbogenation aiuta a stabilizzare il livello di ossigeno negli esperimenti che si basano sul riciclaggio di un serbatoio di buffer di piccole dimensioni per migliorare l'efficienza dei costi degli esperimenti di droga. Inoltre, il manoscritto presenta esperimenti rappresentativi che esaminano gli effetti di carbogenation diverse modalità e paradigmi di stimolazione sulla plasticità sinaptica attività-dipendente della trasmissione sinaptica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nel 1951, gli esperimenti di fetta di primo-ha segnalato il cervello acuto erano condotti1. Nel 1971, dopo il successo in vitro registrazioni da piriform corteccia2,3 e la scoperta che i neuroni hippocampal sono interconnessi trasversalmente lungo l'asse di septotemporal di ippocampo4, uno del prime registrazioni in vitro dell'attività di un neurone hippocampal era raggiunto5. La somiglianza dei parametri neurofisiologici o neurostructural dei neuroni in condizioni in vivo e in vitro sono ancora oggetto di qualche dibattito6, ma nel 1975, Schwartzkroin7 ha indicato che il basale Proprietà dei neuroni vengono mantenuti in vitro e che la stimolazione ad alta frequenza (cioè, tetanization) delle afferenze nella formazione hippocampal induce una facilitazione di lunga durata di potenziali sinaptici8. Elettrofisiologici registrazione dell'attività neuronale in vitro notevolmente ampliato lo studio dei meccanismi cellulari di plasticità sinaptica attività-dipendente9,10, che era stata scoperta nel 1973 da Bliss et al. 11 in vivo gli esperimenti con i conigli.

Lo studio di attività neuronale o segnalazione percorsi nelle fette del cervello e soprattutto in fettine ippocampali acute, è ora uno strumento standard. Tuttavia, sorprendentemente, gli esperimenti in vitro hanno ancora essere standardizzati, come testimoniano i diversi approcci che ancora esistono per la preparazione e la manutenzione di fettine ippocampali acute. Reid et al. (1988) 12 recensione le sfide metodologiche per la manutenzione delle fettine di cervello acuto in diversi tipi di fetta alloggiamenti e le scelte di livello medio, pH, temperatura e ossigeno di balneazione. Questi parametri sono ancora difficili da controllare nella camera di registrazione a causa di elementi su misura in vitro fetta-registrazione Setup. Pubblicazioni possono essere trovati che potrebbe contribuire a superare alcune delle sfide metodologiche e che descrivono nuovi tipi di alloggiamenti di fetta di sommersione, come un sistema interstiziale 3D microperfusion13, una camera con maggiore flusso laminare e ossigeno fornire un sistema di registrazione multi-camera16, un sistema con controllo di temperatura computerizzato15e14. Dal momento che queste camere non sono facili da costruire, maggior parte degli scienziati si basano su chambers fetta commercialmente disponibili. Questi alloggiamenti possono essere montati su un sistema di microscopio, consentendo in tal modo la combinazione di elettrofisiologia e fluorescenza imaging17,18,19. Poiché questi alloggiamenti mantenere le fette di cervello immerse in liquido cerebrospinale artificiale (aCSF), un'alta portata della soluzione tampone deve essere mantenuto, aumentando la spesa dell'applicazione della droga. A tal fine, abbiamo incorporato un sistema di perfusione riciclaggio con deflusso-carbogenation che fornisce una stabilità sufficiente per la registrazione a lungo termine dei potenziali di campo in una camera di fetta di sommersione usando un volume relativamente piccolo aCSF. Inoltre, abbiamo riassunto come l'uso di questo sistema sperimentale carbogenation/aspersione influenza il risultato della plasticità sinaptica attività-dipendente10 e come inibizione della chinasi di allungamento eucariotico factor-2 (eEF2K) modula sinaptica trasmissione20.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli animali sono stati mantenuti in conformità con le norme stabilite di cura degli animali e le procedure dei istituti di scienza del cervello e stato chiave laboratorio di medici Neurobiologia della Fudan University, Shanghai, Cina.

1. soluzione preparazione

Nota: Vedere la tabella dei materiali.

  1. Preparare il tampone per affettare (soluzione di Gey modificate): 92 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, glucosio di 25 mM, 20 mM HEPES, 3mm Na+-piruvato, 10mm MgSO4e 0,5 mM CaCl2.
  2. Regolare il pH a 7,6 utilizzando 1 M NaOH senza carbogenation.
  3. Conservare il tampone a 4 ° C.
    Nota: La titolazione chiarisce il liquido torbido. L'osmolalità è 305-310 mOsm. Il carbogen21 contiene 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno.
  4. Preparare il aCSF diluendo un 10 x soluzione madre di aCSF che non contiene bicarbonato e glucosio, dando una composizione finale di: 124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2mm MgCl2e 1,25 mM KH2PO4.
  5. Aggiungere il bicarbonato e glucosio per raggiungere 10 mM glucosio e 26mm NaHCO3.
  6. Carbogenate aCSF attraverso un tubo di silicone perforato con un fine bloccato immediatamente dopo l'aggiunta di NaHCO3.
  7. Misurare il pH mentre carbogenating (pH 7,3-7,4).
    Nota: La capacità di buffer può essere regolato leggermente alterando la quantità di NaHCO3. Poiché il pH risultante è temperatura-dipendente, è necessario controllare il pH risultante mentre carbogenating alla temperatura di esercizio (ad es., 30 ° C).

2. preparazione di fettine ippocampali Acute

Nota: Vedere la tabella dei materiali.

  1. Posizionare una mesh di fetta-tenuta in una camera di incubazione per fette del cervello acuto, riempire la camera con aCSF e carbogenate (4-6 L/h) per almeno 30 min22 a 28-30 ° C.
  2. Raffreddare gli strumenti chirurgici fino a 2-4 ° C.
  3. Posizionare un bicchiere di vetro riempito con carbogenated affettare buffer (2-4 ° C), mantenuto in una miscela di ghiaccio/acqua, nei pressi del vibratome e fredda.
  4. Anestetizzare ratti o topi fino a far scompaiono i riflessi corneali (30-50 s) utilizzando isoflurano prendendo 500 µ l in un barattolo di vetro 2L o 12,5 µ l in un tubo da 50 mL.
  5. Isolare il cervello utilizzando un metodo descritto e visualizzato in dettaglio nelle pubblicazioni di Mathis et al. (2011) 23 e Yuanxiang et al. (2014) 24.
  6. Raffreddare il cervello fino a 2-4 ° C in un buffer per affettare ghiacciato (per almeno 2 min) prima il cervelletto di dissezione e separazione degli emisferi.
  7. Utilizzare una lama chirurgica fredda per sezionare un pezzo di corteccia dorsale ad un angolo di 70° lungo il bordo dorsale di ogni emisfero25 per ottenere sezioni trasversali dalle ventrali e la parte intermedia dell'ippocampo, come illustrato nella Figura 1C ed E.
  8. Con una spatola di freddo cemento dentale, trasferire un emisfero a un pezzo di carta da filtro asciugare brevemente la superficie creata (1-2 s).
  9. Montare i due emisferi con superfici appena tagliate sulla piattaforma ghiacciata per affettare utilizzando colla adesiva ad azione rapida; hanno l'estremità caudale del viso emisferi la lama di rasoio (Figura 1D).
  10. Posizionare la piattaforma per affettare nella camera di raffreddamento di un vibratomo e riempire quello alloggiamento con il buffer per affettare (2-4 ° C). Carbogenate utilizzando un tubo di silicone perforato.
  11. Tagliare 350 µm fette utilizzando le impostazioni adeguate vibratome (ad es., velocità di avanzamento lama: 1,2 mm/s, ampiezza di lama: 1 mm).
  12. Isolare la formazione hippocampal dal subiculum e le cortecce entorinale utilizzando due cannule di iniezione (> 28 G) come forbici.
  13. Rimuovere le bolle dalla mesh fetta-tenuta della camera di incubazione precedentemente preparato usando una pipetta Pasteur.
  14. Trasferire le fette che hanno certa trasparenza presso il corneum pyramidale dalla piattaforma per affettare sulle maglie della camera umida. Evitare qualsiasi pieghevole, stretching, sovrapposti e galleggianti aspirando aCSF e la fetta in una pipetta di Pasteur bocca grande.
    Nota: L'intera procedura (passo 2.5-2.14) può prendere 5-10 min; Pertanto, è importante controllare la temperatura della soluzione tampone nel tempo a mantenerla a 4 ° C.
  15. Incubare le fette a 30 ° C per almeno 1,5-2 h nella camera di incubazione e fornire carbogen a 4-6 L/h.
    Nota: Regolare la portata di carbogen a circolare il buffer in incubatrice, ma evitare le fette dal galleggiante.

3. le modifiche di Carbogenation per il aCSF riciclaggio dei piccoli serbatoi

  1. Aggiungere un connettore 3 vie tubo per il deflusso del sistema di riciclaggio (Figura 2B).
  2. Collegare il braccio medio del connettore 3 vie tubo con un tubo di alimentazione di carbogen e regolare la portata con un misuratore massa aria (3-4 L/h, Figura 2D e Figura 4C).
  3. Aggiungere un secondo connettore 3 vie tubo per l'afflusso del sistema di riciclaggio. Collegare il braccio medio al tubo di fronte la stufa in linea, parte superiore del braccio di un tubo sottile in silicone (10 cm di lunghezza) e abbassare il braccio per il tubo di afflusso dal serbatoio (filtro passa-basso; Figura 4 C).
  4. Posizionare un strizzatubo su un tubo sottile in silicone (OD: 2 mm) in una posizione lungo il tubo dove la pulsazione della aCSF nella camera della fetta, generata dalla pompa peristaltica, è al suo minimo.
    Nota: Il deflusso-carbogenation (deflusso-carb.) modifica riduce la sensibilità del livello carbogenation al volume del serbatoio aCSF, aCSF tasso di riciclaggio, e relativo tubo posizioni all'interno di serbatoi di piccole aCSF (< 50 mL; Figura 3). Per quanto riguarda il filtro passa-basso, una certa quantità di aria nel tubo di silicio sottile riduce le pulsazioni del flusso aCSF; così, il tubo dovrebbe essere riempito per la maggior parte con aria.

4.Registrazione di risposte sinaptiche in una camera di fetta di sommersione

Nota: Vedere la tabella dei materiali.

  1. Pre-riscaldare la soluzione aCSF in un bagno di acqua a circa 28-30 ° C (questo impedirà la formazione di bolle nella camera di registrazione).
  2. Avviare il sistema di riciclaggio (4-5 mL/min) e attivare il riscaldatore inline per equilibrare il sistema per almeno 1 h.
  3. PRESOAK un piccolo pezzo di lente pulizia carta e una maglia di nylon fissato su un filo di platino a forma di U, nella camera di fetta di sommersione per pochi minuti (Figura 4).
  4. Rimuovere il filo di platino a forma di U.
  5. Spegnere il riciclaggio e mettete una fetta sulla lente carta di pulizia.
  6. Posizionare immediatamente la mesh di fetta-tenuta sopra la fetta, accendere la pompa e lasciare che la fetta equilibrare per 30 min senza immergendo l'obiettivo nel aCSF.
  7. Riempire la micropipetta borosilicato (cioè, l'elettrodo di registrazione) con aCSF (resistenza di punta: 1-2 MΩ, riempito con aCSF 1/3) e montarlo nel supporto pipetta.
  8. Verificare l'isolamento dell'elettrodo metallo stimolazione inserendolo nella soluzione di NaHCO3 (> 40 mM). Collegare l'elettrodo al polo negativo di un generatore di tensione DC (1-2 V, polo positivo: filo d'argento o platino) e osservare la formazione di bolle sulla punta sotto un microscopio di dissezione (> ingrandimento 60x).
  9. Il riferimento cavi nel vano di fetta e posizionare l'elettrodo di stimolazione di testata a resina epossidica-isolato tungsteno nel supporto manipolatore.
  10. Aggiungere un secondo elettrodo di riferimento alla camera e collegarlo alla presa di riferimento del headstage dell'elettrodo di registrazione (Figura 4A).
  11. L'amplificatore software di controllo, fare clic sulla casella "modalità zero morsetto" e procedere facendo doppio clic la casella "elenco di guadagno di output". Scegliere un guadagno di "100", fare doppio clic su "passa-alto filtro casella di riepilogo (Bessel)," scegliere "0,1 Hz" e fare doppio clic su "passa-basso filtro casella di riepilogo (AC)" per scegliere "3kHz."
  12. Nel software di registrazione, fare clic sulla su "Acquire | Aprire il protocollo". Scegliere un protocollo che dispone di impostazioni che consentono per stimolazioni episodiche e la digitalizzazione dei potenziali amplificati a 10-20 kHz per 50-100 ms e che si innesca automaticamente un isolatore di stimolo 10 ms dopo l'inizio di una registrazione episodica.
  13. Posizionare la stimolazione ed elettrodi di registrazione in linea e parallela il corneum pyramidale, ad esempio (Figura 4B e Figura 5).
  14. Fare clic su "acquisire | Modificare il protocollo"e scegliere la scheda"trigger"(nella finestra pop-up). Fare clic sulla casella "fonte di innesco" e scegliere "barra spaziatrice" come la fonte di innesco. Fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante "record" per avviare l'acquisizione e notare la finestra popup con un pulsante di trigger.
  15. Nel software di isolatore di stimolo, fare clic sulla casella "controllo tensione" e inserire "0". Clicca sul pulsante "Scarica". Fare clic sulla finestra "software di registrazione" e premere la barra spaziatrice. Ripetere questo ciclo immettendo valori in sequenza da 1 a 8, ad esempio, a passi di mV 1 nella casella "controllo di tensione".
  16. Correlare l'intensità di stimolazione con valori fEPSP-pendio e determinare la forza di stimolazione necessaria per ottenere il 40% della fEPSP-pendenza massima. Fare clic sulla casella"controllo tensione" e immettere il valore determinato. Clicca sul pulsante "Scarica".
    Nota: Un isolatore di stimolo viene utilizzato per applicare tensione breve o impulsi di corrente al tessuto cerebrale. Gli impulsi bifasici possono avere 100 µs per fase.
  17. Nel software di registrazione, fare clic sul pulsante stop e poi il menu di "Acquisire". Clicca su "Edit protocollo" e scegliere la scheda "grilletto" nella finestra pop-up. Fare clic sulla casella origine trigger e abbiamo scelto il "timer interno" come la fonte di innesco. Fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante record che inizia la registrazione automatica dei potenziali di campo ogni 30 s, per esempio. Fare clic sul pulsante "stop" dopo 30-60 min.
  18. Fare clic sul menu "Acquisire", fare clic su "Open Protocol," Scegli il protocollo di induzione desiderata della plasticità sinaptica e fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante "Registra" per attivare automaticamente la stimolazione ad alta frequenza e la registrazione. Fare clic sul pulsante "stop".
    Nota: Nel caso di studi relativi alla plasticità sinaptica, applicare uno dei paradigmi induzione standard per potenziamento a lungo termine o la depressione a lungo termine dopo la registrazione prolungata della linea di base. Esempi rappresentativi della conseguente modulazione della trasmissione sinaptica sono raffigurati nella Figura 7 e Figura 8.
  19. Nel software di registrazione, fare clic su "Acquire | Aprire il protocollo"e scegliere il protocollo stesso come descritto al punto 4.12. Fare clic sul pulsante "OK" e quindi fare clic su "Registra". Mantenere automaticamente in esecuzione le registrazioni potenziali del campo per 2-4 h, per esempio. Fare clic sul pulsante "stop" per terminare la registrazione.
  20. Nel caso di studi farmaceutici, applicare il composto direttamente per il aCSF serbatoio se amministrazione permanente composto è desiderato (Figura 6).

5. pulizia del Setup e suggerimenti

Nota: Vedi sotto per i consigli generali.

  1. Pulire ogni settimana il sistema di riciclaggio 10% H2O2 per non più di 20 minuti, seguito da lavaggio con deionizzata H2O.
    Nota: Etanolo non è raccomandato per la pulizia. Non allo stesso modo si consiglia di immergere i fili di riferimento e obiettivo in H2O2.
  2. Rimuovere il sale precipitato sulla superficie della lente dell'obiettivo o dintorni di camera con acqua e poi 0,1 N HCl.
  3. Lavare la vasca di gorgogliamento di carbogen in acqua distillata o 0,1 N HCl.
  4. Immergere la camera di incubazione fetta 10% H2O2 per 5 min una volta a settimana e poi risciacquare accuratamente la camera di incubazione con deionizzata H2O.
  5. In caso di elettrodi di stimolazione del metallo, risciacquare la punta dell'elettrodo stimolante con acqua deionizzata dopo ogni esperimento e strofinare delicatamente la punta dell'elettrodo stimolante con un batuffolo di cotone imbevuto con etanolo per rimuovere il tessuto residuo.
  6. Ridurre la resistenza di elettrodi di stimolazione del metallo commerciale rimuovendo l'isolamento sulla punta attraverso un'attenta sfiora con carta vetrata.
  7. Ridurre la perdita di carbogen dal aCSF mentre riciclaggio attraverso i tubi, sostituendo i tubi in silicone con tubi di politetrafluoroetilene.
  8. Tenere i fili d'argento dell'elettrodo di registrazione e dell'elettrodo di riferimento in candeggina per diversi giorni per formare AgCl sulla superficie del filo.

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Risultati

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Nella sezione protocollo, abbiamo descritto la preparazione di fettine ippocampali acute dalla parte ventrale e intermedi della formazione hippocampal (Figura 1) del maschio C57BL/6 topi e ratti maschii di Wistar (5-8 settimane). La posizione degli emisferi sulla piattaforma affettatrice aiuta a tenerli stabili ed elimina la necessità di stabilizzazione con agar o dell'agarosi. Il sistema di perfusione stesso è basato su una pompa peristaltica operata su alta...

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Discussione

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Anche se Colombo fetta interfaccia esibiscono più robusto Risposte sinaptiche25,26,27,28, alloggiamenti di sommersione forniscono ulteriore comodità per la registrazione di patch-clamp e fluorescenza di imaging. Così, abbiamo descritto diversi aspetti di field recordings potenziali in fettine ippocampali acute utilizzando una camera di fetta di sommersione commerciale che può essere facilmente ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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W.W. condotto, analizzato e progettato gli esperimenti e ha scritto il manoscritto. D.X. e C.P. assistito nella preparazione di figura e condotti gli esperimenti. Questo lavoro è stato supportato da NSFC (31320103906) e 111 Project (B16013) a T.B.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagents required
NaClSinopharm Chemical Reagent, Cina10019318
KClSinopharm Chemical Reagent, Cina10016318
KH2PO4Sinopharm Reagente chimico, Cina10017618
MgCl2 &punto medio; 6H2OReagente chimico Sinopharm, Cina10012818
CaCl2Sinopharm Reagente chimico, Cina10005861
NaHCO3Sinopharm Reagente chimico, Cina10018960
GlucosioSinopharm Reagente chimico, Cina10010518
NaH2 Reagente chimico PO4Sinopharm, Cina20040718
HEPESSigmaH3375
Piruvato di sodioSigmaA4043
MgSO4Sinopharm Reagente chimico, Cina20025118
Reagente chimico NaOHSinopharm, Cina10019718
Strumenti e materiali per la dissezione
DecapitatoriApparecchio Harvard55-0012per la decapitazione del ratto
Forbici per bendeSCHREIBER12-4227per la decapitazione del topo
lama a doppio taglioFlying Eagle, Cina74-C
IRIS ForbiciRWD, CinaS12003-09
Bone RongeursRWD, CinaS22002-14
CucchiaioHammacher HSN 152-13
spatola per cemento dentaleHammacher HSN 016-15
escavatore dentale a doppia estremitàFabbro chirurgico, USABS-415-017
Microtomo vibranteLeica, GermaniaVT1200S
lama chirurgicaRWD, CinaS31023-02
supporto chirurgicoRWD, CinaS32007-14
Attrezzature e materiali per elettrofisiologia
Estrattore verticale per pipetteNarishige, GiapponePC-10
Tabella di isolamento dalle vibrazioniMeirits, GiapponeADZ-A0806
registrazione di tipo sommerso cameraWarner InstrumentsRC-26GLP
Micromanipolatore a 4 assiSutter, USAMP-285, MP-225
Filo di platinoWorld Precision InstrumentsPTP406
AmplifierMolecular Devices, USAMulticlamp 700B
Sistema di acquisizione datiMolecular Devices, USADigidata 1440A
Anaysis softwareMolecular Devices, USAClampex 10.2
Nikon, GiapponeSorgente luminosa a LED FN1
Lumen Dynamics Group, CanadaMicropipette X-cite 120LED
ApparecchioHarvardGC150TFa registrazione extracellulare
Sutter, USA PinzapatchBF150-86
elettrodo di tungstenoA-M Systems, USA575500
pompa peristalticaLonger, CinaBT00-300T
tubi per pompa peristalticaISMATEC, Wertheim, GermaniaSC03091x afflusso, ID: 1,02 mm
tubi per pompa peristalticaISMATEC, Wertheim, GermaniaSC03192x tubi per deflusso, ID: 2,79 mm
CCD cameraPCO, Germaniapco.edge sCMOS
carta per la pulizia delle lentiKodak
50 mL provetta da centrifuga conicaThermo scientific339652
PrecameraWarner InstrumentsBSC-PC
SF-28
Regolatore di temperaturaWarnerInstruments TC-324B
Microscopio a fluorescenza micropipette borosilicate Riscaldatore in linea Warner Instruments

Riferimenti

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