Qui, presentiamo un protocollo raffinato per rivelare efficacemente biotinilati ammina di destrano (BDA) etichettatura con una colorazione metodo attraverso un reciproco percorso neurale fluorescente. È adatto per analizzare la struttura fine del BDA etichettatura e distinguerlo da altri elementi neurali sotto un microscopio a scansione confocale del laser.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Migliorare l'applicazione di alto peso molecolare del dextrano Biotinylated ammina per proiezione Thalamocortical traccia nel ratto
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ammina di alto peso molecolare biotinilati destrano (BDA) è stato utilizzato come tracciante neuroanatomical altamente sensibile per molti decenni. Poiché la qualità della relativa etichettatura è stata influenzata da vari fattori, qui, forniamo un protocollo raffinato per l'applicazione ad alto peso molecolare BDA per studiare ottimale etichettatura neurale nel sistema nervoso centrale. Dopo l'iniezione stereotactic del BDA nel nucleo posteromedial ventrale (VPM) del talamo nel ratto mediante una pipetta di vetro delicato, BDA era macchiata con fluorescente streptavidina-Alexa (AF) 594 e controcolorato con fluorescente di Nissl AF500/525. Sullo sfondo di colorazione di Nissl verde, il rosso BDA etichettatura, tra cui corpi delle cellule neuronali e assonali terminali, è stata dimostrata più distintamente nella corteccia somatosensoriale. Inoltre, doppia colorazione fluorescente per BDA e la parvalbumina di proteine leganti il calcio (PV) è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA e interneuroni PV-positivi nella destinazione corticale, fornendo l'opportunità di studiare il locale neurale circuiti e le loro caratteristiche chimiche. Così, questo metodo raffinato non è solo adatto per la visualizzazione di alta qualità neurali etichettatura con l'alto peso molecolare BDA attraverso percorsi neurali reciproci tra il talamo e la corteccia cerebrale, ma anche permetterà la dimostrazione simultanea di altri marcatori neurali con istochimica fluorescente o immunochimica.
Introduzione
Ad alto peso molecolare BDA (10.000 peso molecolare), un tracciante altamente sensibile, è stato utilizzato per tracciare i percorsi neurali nel sistema nervoso centrale per oltre 20 anni1. Anche se l'uso del BDA è un comune delle vie neurali, analisi tecnica, la qualità del BDA etichettatura può risentire in animali vari fattori1,2,3. Il nostro studio recente ha indicato che la struttura ottima del BDA etichettatura è non solo connesso con un tempo di sopravvivenza post-iniezione corretta, ma anche correlata con la colorazione metodo....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico presso la Cina cinese medico Accademia (numero di riferimento 20160014). Tutte le procedure sono state condotte in conformità della istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati quattro ratti del maschio adulto (250-280 g di peso). Tutti gli animali erano alloggiati in un ciclo luce/buio di 12 h con temperatura e umidità controllate e consentiti il libero accesso al cibo e acqua. Gli strumenti e i materiali utilizzati nel presente studio sono stati ha mostrati nella Figura 1<....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Sopravvivenza di 10 giorni dopo l'iniezione del BDA nel VPM era sufficiente per la produzione di intenso neurale etichettatura sulle aree corticali corrispondenti ipsilateral al lato di iniezione (Figura 2). ABC sia procedure di colorazione per BDA fluorescenti convenzionali hanno rivelato il modello simile di etichettatura neurale su S1, tra cui anterograda denominata thalamocortical assoni e retrogradely neuroni corticothalamic (Figura .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Selezionando un elemento tracciante corretto è un passo fondamentale per un esperimento di successo analisi neurale. Nella famiglia del BDA, ad alto peso molecolare BDA (10.000 peso molecolare) è stato consigliato di essere preferenzialmente trasportato attraverso il percorso neurale anterograda contrariamente a basso peso molecolare BDA (peso molecolare 3.000)2,3 , 11 , 12 ,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato dal National Foundation scienze naturali della Cina (progetto codice n. 81373557; n. 81403327).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Destrano ammina biotinilata (BDA) | Sonde molecolari | D1956 | 10.000 peso molecolare |
| Streptavidina-Alexa Fluor 594 | Sonde molecolari | S32356 | Proteggere dalla luce |
| 500/525 verde fluorescente Nissl | colorazione Sonde molecolari | N21480 | Proteggere dalla luce |
| Strumento per stereotassi cerebrale | Narishige | SR-50 | |
| Microtomo di congelamento | Thermo | Microm International GmbH | |
| Imaging confocale | Sistema Olympus | FV1200 | |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Accademia cinese delle scienze mediche | SCKX (GIUGNO) 2012-004 | |
| Vectastain Kit ABC | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost più vetrini per microscopio | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop e illustrazione | Adobe | CS5 |
Riferimenti
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
