Migliorare l'applicazione di alto peso molecolare del dextrano Biotinylated ammina per proiezione Thalamocortical traccia nel ratto

Summary

Qui, presentiamo un protocollo raffinato per rivelare efficacemente biotinilati ammina di destrano (BDA) etichettatura con una colorazione metodo attraverso un reciproco percorso neurale fluorescente. È adatto per analizzare la struttura fine del BDA etichettatura e distinguerlo da altri elementi neurali sotto un microscopio a scansione confocale del laser.

Abstract

Ammina di alto peso molecolare biotinilati destrano (BDA) è stato utilizzato come tracciante neuroanatomical altamente sensibile per molti decenni. Poiché la qualità della relativa etichettatura è stata influenzata da vari fattori, qui, forniamo un protocollo raffinato per l'applicazione ad alto peso molecolare BDA per studiare ottimale etichettatura neurale nel sistema nervoso centrale. Dopo l'iniezione stereotactic del BDA nel nucleo posteromedial ventrale (VPM) del talamo nel ratto mediante una pipetta di vetro delicato, BDA era macchiata con fluorescente streptavidina-Alexa (AF) 594 e controcolorato con fluorescente di Nissl AF500/525. Sullo sfondo di colorazione di Nissl verde, il rosso BDA etichettatura, tra cui corpi delle cellule neuronali e assonali terminali, è stata dimostrata più distintamente nella corteccia somatosensoriale. Inoltre, doppia colorazione fluorescente per BDA e la parvalbumina di proteine leganti il calcio (PV) è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA e interneuroni PV-positivi nella destinazione corticale, fornendo l'opportunità di studiare il locale neurale circuiti e le loro caratteristiche chimiche. Così, questo metodo raffinato non è solo adatto per la visualizzazione di alta qualità neurali etichettatura con l'alto peso molecolare BDA attraverso percorsi neurali reciproci tra il talamo e la corteccia cerebrale, ma anche permetterà la dimostrazione simultanea di altri marcatori neurali con istochimica fluorescente o immunochimica.

Introduction

Ad alto peso molecolare BDA (10.000 peso molecolare), un tracciante altamente sensibile, è stato utilizzato per tracciare i percorsi neurali nel sistema nervoso centrale per oltre 20 anni¹. Anche se l'uso del BDA è un comune delle vie neurali, analisi tecnica, la qualità del BDA etichettatura può risentire in animali vari fattori^1,2,3. Il nostro studio recente ha indicato che la struttura ottima del BDA etichettatura è non solo connesso con un tempo di sopravvivenza post-iniezione corretta, ma anche correlata con la colorazione metodo^....

Protocol

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico presso la Cina cinese medico Accademia (numero di riferimento 20160014). Tutte le procedure sono state condotte in conformità della istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati quattro ratti del maschio adulto (250-280 g di peso). Tutti gli animali erano alloggiati in un ciclo luce/buio di 12 h con temperatura e umidità controllate e consentiti il libero accesso al cibo e acqua. Gli strumenti e i materiali utilizzati nel presente studio sono stati ha mostrati nella Figura 1<....

Results

Sopravvivenza di 10 giorni dopo l'iniezione del BDA nel VPM era sufficiente per la produzione di intenso neurale etichettatura sulle aree corticali corrispondenti ipsilateral al lato di iniezione (Figura 2). ABC sia procedure di colorazione per BDA fluorescenti convenzionali hanno rivelato il modello simile di etichettatura neurale su S1, tra cui anterograda denominata thalamocortical assoni e retrogradely neuroni corticothalamic (Figura .......

Discussion

Selezionando un elemento tracciante corretto è un passo fondamentale per un esperimento di successo analisi neurale. Nella famiglia del BDA, ad alto peso molecolare BDA (10.000 peso molecolare) è stato consigliato di essere preferenzialmente trasportato attraverso il percorso neurale anterograda contrariamente a basso peso molecolare BDA (peso molecolare 3.000)^{2,3 , 11 , 12 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Destrano ammina biotinilata (BDA)	Sonde molecolari	D1956	10.000 peso molecolare
Streptavidina-Alexa Fluor 594	Sonde molecolari	S32356	Proteggere dalla luce
500/525 verde fluorescente Nissl	colorazione Sonde molecolari	N21480	Proteggere dalla luce
Strumento per stereotassi cerebrale	Narishige	SR-50
Microtomo di congelamento	Thermo	Microm International GmbH
Imaging confocale	Sistema Olympus	FV1200
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Accademia cinese delle scienze mediche	SCKX (GIUGNO) 2012-004
Vectastain Kit ABC	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost più vetrini per microscopio	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop e illustrazione	Adobe	CS5