UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Analisi di Aversione di rame basata sullo stato nutrizionale

Sommario

Qui presentiamo un esame specifico di Caenorhabditis elegans progettato per valutare i cambiamenti nel comportamento avversione di rame e la capacità di individuare una fonte di cibo comune, in quanto l'organismo progredisce da uno stato alimentare ben nutrito e affamato.

Abstract

Per garantire la sopravvivenza, gli organismi devono essere in grado di evitare habitat sfavorevoli pur garantendo una fonte alimentare coerente. Caenorhabditis elegans altera i loro modelli locomotori sulla rilevazione di diversi stimoli ambientali e può modulare la loro suite di risposte comportamentali in risposta alle condizioni di fame. I nematodi presentano tipicamente una diminuzione della risposta avversa quando vengono rimossi da una fonte alimentare per oltre 30 minuti. L'osservazione dei cambiamenti comportamentali in risposta a un cambiamento dello stato nutrizionale può fornire una visione dei meccanismi che regolano la transizione da uno stato ben nutrito allo stato affamato.

Abbiamo sviluppato un saggio che misura una capacità del nematode di attraversare una barriera avversaria ( cioè rame) e quindi raggiungere una fonte di cibo per un lungo periodo di tempo. Questo protocollo si basa sul lavoro precedente integrando più variabili in modo tale da consentire una continua raccolta dei dati quando gli organismi si spostano verso unN condizioni sempre più affamate. Inoltre, questo esame consente una maggiore dimensione del campione in modo che le popolazioni più grandi di nematodi possano essere valutate simultaneamente.

Gli organismi difettosi per la capacità di rilevare o reagire al rame attraversano immediatamente la barriera chimica, mentre i nematodi di tipo selvatico vengono inizialmente respinti. Poiché i vermi di tipo selvaggio sono sempre più affamati, iniziano a attraversare la barriera e raggiungere la fonte alimentare. Abbiamo progettato questo test per valutare un mutante incapace di rispondere a varie indicazioni ambientali, tra cui la sensazione di cibo o la rilevazione di sostanze chimiche avverse. Quando vengono valutati tramite questo protocollo, gli organismi difettosi hanno subito attraversato la barriera, ma sono stati anche incapaci di rilevare una fonte di cibo. Quindi, questi mutanti attraversano ripetutamente la barriera chimica nonostante temporaneamente raggiungono una fonte di cibo. Questo test può testare in modo diretto le popolazioni di vermi per valutare i possibili difetti di percorso correlati all'avversione e alla fame.

Introduzione

Caenorhabditis elegans è stato usato come modello per lo studio della neurobiologia da decenni a causa della relativa facilità nell'analisi della circuiteria di un sistema nervoso composto da soli 302 neuroni ¹ . Fintanto che l'organismo è affidato a rispondere alle indicazioni ambientali, gran parte del sistema nervoso è dedicato a regolare l'integrazione dei segnali ambientali ² . Nonostante la semplicità del suo sistema nervoso, C. elegans può rilevare e rispondere a diversi segnali ambientali, compresi repellenti ³ , attrattivi ⁴ , temperatura ⁵ e persino umidità ⁶ . Un fallimento per integrare correttamente i segnali ambientali è stato collegato a una serie di disturbi del comportamento e delle condizioni neurodegenerative in sistemi modello di mammiferi ^{7- 9.} Con una gamma di modelli di malattie neurali disponibili ¹⁰ in C. elegans e lo sviluppo di schermi farmaceutici nematodi ¹¹ , questo organismo si è rivelato un utile sistema per lo studio della neurobiologia. Dato la disponibilità di un mappato connettorio ¹ e mutazioni a quasi tutti i genomi del genoma nematode ¹² , la nostra comprensione del sistema nervoso nematode, e per estensione la nostra, è parzialmente limitata dalla progettazione di test creativamente appropriati.

Negli ultimi 40 anni sono stati sviluppati diversi test di chemotaxis per valutare la reattività del nematode a diversi stimoli avversi ^{3 , 4 , 13 , 14 , 15} . La sperimentazione iniziale ha comportato l'introduzione di uno stimolo ambientale acuto, mentre un singolo worm ha percorso un piatto di agar= "Xref"> 3 ^{, 14 , 16} . Sono state registrate modifiche immediate alle risposte locomotorie. Ad esempio, l'odorante volatile dell'ottanolo può essere applicato a un capello e si è spostato di fronte a un naso di nematode per stimolare l'inizio della locomozione all'indietro nei vermi di tipo selvatico ¹⁷ . Sono stati inoltre sviluppati test più complessi per incorporare più variabili come mezzo per valutare la scelta comportamentale ¹⁸ . Una variante di questo dosaggio comporta l'impiego di una soluzione di rame per creare una barriera avversaria della linea mediana ⁴ . Un attraente, vale a dire diacetilico, è stato posto su un lato della barriera chimica con vermi trasferiti lontani dalla fonte di diacetile. I vermi difettosi per le risposte aversive di rame immediatamente attraversarono la barriera per raggiungere il diacetil, mentre i vermi di tipo selvaggio furono inizialmente respinti dalla barriera. Le risposte sono state rilevate quando i vermi hanno avvicinato la barriera al rameSenza osservazioni a lungo termine.

Quando i vermi vengono valutati dopo essere stati sottoposti a fame, la loro sensibilità agli stimoli ambientali diminuisce ¹⁹ . Quando l'ottanolo chimico avversivo viene distrutto davanti al naso nematode, gli organismi di tipo selvatico stimolano il movimento all'indietro entro 3 - 5 s quando sono al cibo. Dopo che questi organismi sono stati rimossi dal cibo per 10 minuti, presentano una risposta ritardata di 8-10 s ²⁰ . Così, con una maggiore fame, i nematodi mostrano una diminuita risposta avversa a segnali ambientali nocivi, poiché la ricerca di cibo diventa più essenziale per la sopravvivenza. Viceversa, i nematodi che il recettore neuropeptidico 9 ( esim-9) eccessivamente esprimono, non rispondono all'ottanolo in o fuori dal cibo e presentano un'incapacità di rispondere ad un certo numero di stimoli avversi ²¹ . Questi organisms ego-9 (GF) non modulano anche la loro frequenza di inversione in presenza di cibo, ma possonoReverse in risposta a stimoli di tocco duro che indicano che sono in grado di una locomozione indietro ²¹ . Abbiamo anche valutato i Mutanti z1-9 (LF) dato che presentano una frequenza di inversione anormalmente ridotta al di fuori del cibo, ma possono modulare il loro comportamento in presenza di cibo ²¹ . Accoppiare lo stato nutrizionale del verme con l'introduzione di stimoli esterni acuti ha contribuito a spiegare i meccanismi attraverso i quali un percorso alimentare può ampiamente modulare i percorsi sensoriali di segnalazione ^{22 , 23} . La presenza di cibo nell'ambiente nematodi è stata utilizzata anche per valutare le risposte di prelievo di etanolo ²⁴ . In questo esperimento, i vermi sono stati incubati in varie concentrazioni di etanolo e poi sono state poste su un piatto di agar con una patch di alimento conosciuto come un "assaggio della corsa alimentare". La patch alimentare è stata posta su un bordo della piastra mentre i nematodi wEretta lontano dalla fonte alimentare. Il ritiro di etanolo è stato valutato misurando la durata del tempo necessario per i worm per raggiungere la zona di cibo.

Questo test di avversione di rame basata sulla nutrizione si basa sul test sulla corsa alimentare per integrare ulteriori variabili ambientali, vale a dire cibo e rame, valutando nel contempo i cambiamenti comportamentali. Questo è un adattamento di un protocollo di uso comune in tutta la comunità C. elegans ⁴ . Questo protocollo è stato utilizzato per valutare le risposte avversarie e la rilevazione del cibo durante un periodo di quattro ore ²¹ . Poiché i vermi mostrano comportamenti di fame dopo 30 minuti di deprivazione alimentare ²⁵ , siamo anche in grado di valutare come le modifiche allo stato nutrizionale possano influenzare le risposte ambientali. Le condizioni di questo dosaggio misurano come gli organismi sperimentali cambino la risposta a stimoli avversi nel tempo, quindi valuta i cambiamenti comportamentaliGli organismi avanzano verso uno stato affamato (e continue misurazioni di fame di lunga durata). Dal momento che gli animali da zo-9 (GF) non alterano il loro comportamento in risposta a cibo oa molti segnali avversi, abbiamo cercato di identificare se questi disfunzioni comportamentali continuerebbero a persistere nel contesto della fame. In definitiva, questo progetto di dosaggio è stato formulato per valutare in modo specifico i mutanti z1-9 (GF), ma può essere ulteriormente adattato anche a caratterizzare nuovi ceppi.

Protocollo

1. Preparazione degli organismi sperimentali

1. Prelevare 10 nematodi in scatola L4 per ceppo 24 h prima di iniziare il test per assicurare che gli organismi siano giovani adulti quando sono stati sottoposti a test. Per ogni mutato o nematodo di controllo sperimentato, scegliere 10 L4s (10 per il controllo e 10 per il saggio).
   1. Mantenere gli organismi L4 utilizzando metodi standard ^{26 , 27} per 24 ore su piatti standard di agar seminati con OP50 Escherichia coli . Se gli organismi si perdono durante i passi successivi di lavaggio, compensare aumentando la dimensione del campione iniziale ( cioè scegliere 20 worm più che 10).
      Nota: Il comportamento è un fenotipo variabile innaturale. Eseguire il metodo in triplice copia per ogni ceppo in tre giorni separati. Includere i ceppi di controllo aggiuntivi e le condizioni per i nuovi ceppi, come evidenziato nella sezione di discussione.
2. Immediatamente prima del dosaggio, trasferire l'organo sperimentaleIn un piatto di agar senza batteri e permettere ai nematodi di muoversi liberamente per 1 min per rimuovere batteri in eccesso.
   1. Se gli organismi sperimentali hanno sperimentato condizioni di contaminazione durante le 24 ore prima del dosaggio, scartarle.
3. Pipettare 1 ml di M9 sulla piastra priva di batteri per lavare i vermi in un tubo di microcentrifuga.
4. Centrifugare a 3.000 xg per 1 min. I vermi dovrebbero formare un pellet nella parte inferiore del tubo. Aspirare la soluzione M9 senza interrompere il pellame di verme. Aggiungere 1 ml di M9 alla pellicola del verme, invertire il tubo per mescolare i vermi con la soluzione.
5. Ripetere i passaggi 1.4 ancora tre volte.
   1. Se i batteri in eccesso sono stati inizialmente trasferiti con i vermi, ripetere per un totale di 5 volte. Nessun batterio dovrebbe essere trasferito alle piastre di corsa alimentare in rame. Se il cibo viene trasferito sulla piastra di dosaggio, interferirà con una raccolta precisa dei dati.
6. Dopo il lavaggio finale, aspirare il surnatante fino al 10081, L di M9 e il pellet verme rimane.
   Attenzione: i comportamenti legati alla fame risultano evidenti dopo 30 minuti. Di conseguenza, i vermi dovrebbero essere immediatamente trasferiti dalla soluzione una volta completati i passaggi di lavaggio.

2. Preparazione delle lastre di analisi

1. Preparare le piastre standard di agar NGM due giorni prima del dosaggio.
   1. Se le lastre sono tenute in un ambiente umido, fare piastre agar 3 giorni prima del dosaggio. In alternativa, rimuovere il coperchio della piastra per 3 - 6 h per garantire una corretta secchezza (se in ambiente sterile).
2. Con un marcatore permanente lungo, fare una linea sul lato inferiore della piastra lungo il bordo esterno e un altro per formare una barriera intermedia ( figura 1 ). La barriera intermedia dovrebbe essere equidistante da ogni bordo della piastra. Utilizzare un righello per garantire misurazioni precise. Queste linee serviranno come guida durante il trasferimento di batteri e la soluzione di rame. PurchéE. coli viene trasferito prima della soluzione di rame, queste linee serviranno come indicatori.
3. Piastra di semi con 50 μl di OP 50 E. coli su un solo lato della barriera di rame per creare un prato uniforme ( Figura 2 ). La concentrazione batterica dovrebbe rimanere coerente in tutti i dosaggi; Tuttavia, è stata osservata una piccola variabilità in risposta a lievi differenze di concentrazione.
   1. Utilizzare le linee contrassegnate sulla parte inferiore della piastra per assicurare che i batteri non vengano a contatto con la soluzione di rame. Fintanto che la soluzione di rame allinea il bordo della piastra e forma una barriera di media linea, trasferire i batteri in modo che la soluzione di rame non venga a contatto con la fonte alimentare.
4. Segna un secondo set di piastre e non trasferisce OP50 E. coli a loro ( Figura 2 ). Queste lastre serviranno a valutare il controllo negativo. Queste piastre dovrebbero anche avere unMarcatura su una metà della piastra per indicare l'origine di trasferimento iniziale.
5. Lasciare asciugare i batteri e incubare le piastre a 37 ° C per una notte. Assicurarsi che le patch batteriche non siano disturbate quando si trasferisce ad un incubatore oa una camera di 37 ° C. Il disturbo eccessivo potrebbe alterare la posizione o la forma della patch alimentare.

3. Analisi chimotassi

1. Appena preparare una soluzione di solfato di rame (II) 0,5 M prima del tempo di inizio del test. A condizione che 125 μL di soluzione sia utilizzata per piastra, scalare questo volume in funzione del numero di piastre di dosaggio utilizzate ( ad es. 5 piastre di dosaggio, 625 μL).
2. Pipettare 100 μL della soluzione di solfato di rame (II) sul bordo dell'agar per creare una barriera esterna in rame. Il contrassegno sottostante della piastra dovrebbe servire da guida.
3. Pipettare 25 μL della soluzione di solfato di rame (II) per creare una barriera di medie linee.
   1. Assicurarsi che la soluzione di solfato di rame (II)Non entrare in contatto con la patch batterica. Utilizzare una tecnica macchiata poiché le striature possono influenzare la locomozione a causa di indentazioni / graffi sull'agar.
4. Lasciare asciugare la soluzione di rame sulla lastra. Il periodo di tempo può variare a seconda delle piastre e delle condizioni del laboratorio. Controllare visivamente la secchezza ogni 5 min dopo il trasferimento.
   Nota: la soluzione di rame mostra una tonalità blu e facilmente identificabile. Utilizzare un tessuto di laboratorio per abbassare leggermente la soluzione vicino al bordo della piastra per discernere la secchezza.
5. Pipettare 20 μL di pellet di worm dal fondo del tubo sulla metà libera dal batterio della piastra di dosaggio.
   1. Assicurarsi che 10 vermi siano trasferiti alla piastra di dosaggio. Se i worm extra sono stati inclusi accidentalmente, rimuoverli raccogliendo con l'olio di alogeno per assicurare che nessun batterio sia stato aggiunto alla piastra. Ogni dosaggio dovrebbe avere un numero consistente di nematodi durante il dosaggio.
      NOTA: se troppo pochi worm sono trasfErrato durante i test, incrementando la dimensione iniziale del campione, ridurrà le potenziali perdite durante le operazioni di lavaggio e trasferimento.
6. Rimuovere l'eccesso M9 dalla piastra con un tessuto di laboratorio. M9 non dovrebbe entrare in contatto con la soluzione di solfuro di rame (II).
   Attenzione: assicurarsi che i worm e la superficie del agar rimangano inalterati durante l'esecuzione di questo passaggio. Se usato troppo duro, il tessuto di laboratorio può creare indentazioni sulla superficie del piatto agar e può rimuovere i vermi. I worms eliminati accidentalmente via KimWipe dovrebbero essere scartati.
7. Una volta che la soluzione M9 è stata rimossa e tutti i vermi hanno iniziato motivi locomotori non liquidi, avviare il cronometro del dosaggio.
   1. Ottimamente, rimuovere la soluzione M9 entro un min. Il parametro essenziale è l'identificazione della locomozione sinusoidale. I worms si allontanano in modo diverso, ad esempio , se non liquido, piuttosto che sinusoidale. Avviare l'orologio di stop di analisi una volta l'organo sperimentaleGli ismi smettono di schiacciare.
8. Controllare le lastre di dosaggio ogni 30 min.
   1. Per le piastre di analisi con patch batteriche, positivamente punteggio gli organismi se raggiungono la patch alimentare per un periodo di 4 h. Per le piastre di controllo negativo, organizzano positivamente gli organismi se hanno attraversato la barriera.

Risultati

Utilizziamo il tipo selvatico (N2), npr-9 (tm1652) e un ceppo di sovraespressione npr-9 , cioè npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; -1 :: rfp), per valutare le risposte alla fame e all'avversione di rame. Gli organismi di tipo selvatico sono in grado di rilevare e rispondere alla barriera di rame avversa, mentre i mutanti z-9 (GF) non iniziano una risposta avversaria al rame nel corso del test di 4 ore

Discussione

Questo disegno del dosaggio modifica il test di corsa alimentare ²⁴ per includere una soluzione di rame per creare una barriera media lineare avversa e intorno al bordo della piastra per evitare una perdita di nematodi. Gli organismi sono testati per la loro capacità di attraversare la barriera avversaria e raggiungere una patch di cibo per un periodo di 4 h. Nel contesto di npr-9 (GF) abbiamo utilizzato questo test per valutare come le condizioni di fame potrebbero influenzare le rispos...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
M9 Soluzione [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O fino a 1 litro. Autoclavare per sterilizzare prima dell'uso.]			Prodotto in laboratorio
Solfato Cuprico	Sigma	C-1297	Utilizzare acqua per sospendere adeguatamente ad una concentrazione di 0,5M