Specifica della destinazione sonde rappresenta uno strumento innovativo per l'analisi dei meccanismi molecolari, come espressione della proteina in vari tipi di malattia (ad es., infiammazione, infezione e tumorigenesi). In questo studio, descriviamo una valutazione tomografica tridimensionale quantitativa di infiltrazione del macrofago intestinale in un modello murino di colite usando la tomografia di fluorescenza-mediata specifica per F4/80.
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Articolo metodologico
Fluorescenza-mediata di tomografia per la rilevazione e la quantificazione di infiammazione intestinale murina del macrofago-correlati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Modelli murini di malattia sono indispensabili alla ricerca scientifica. Tuttavia, molti strumenti diagnostici quali l'endoscopia o formazione immagine tomografica non sono abitualmente impiegati nei modelli animali. Letture sperimentali convenzionali spesso si basano su analisi post-mortem ed ex vivo , che impediscono gli esami di follow-up intra-individuali e aumentano il numero di animali di studio necessari. Fluorescenza-mediata tomografia consente la valutazione non invasiva, ripetitiva, quantitativa e tridimensionale di sonde fluorescenti. È altamente sensibile e consente l'utilizzo di produttori di molecolare, che permette la rilevazione specifica e caratterizzazione di bersagli molecolari distinte. In particolare, sonde mirate rappresentano uno strumento innovativo per l'analisi di espressione genica della proteina e l'attivazione in infiammazione, malattia autoimmune, infezione, malattia vascolare, migrazione cellulare, tumorigenesi, ecc. In questo articolo, forniamo istruzioni dettagliate su questa sofisticata tecnologia di imaging per la rilevazione in vivo e la caratterizzazione di infiammazione (cioè, l'infiltrazione del macrofago di F4/80-positivo) in un modello murino ampiamente usato di infiammazione intestinale. Questa tecnica potrebbe essere utilizzata anche in altre aree di ricerca, quali il rilevamento delle cellule o cellule staminali immune.
Introduzione
Modelli animali sono ampiamente utilizzati nella ricerca scientifica, ed esistono molte procedure non invasive per monitorare l'attività della malattia e vitalità, come la quantificazione delle variazioni di peso corporeo o l'analisi del sangue, delle urine e le feci. Tuttavia, questi sono solo i parametri di surrogati indiretti che sono anche soggetti a variabilità inter-individuale. Essi frequentemente devono essere accompagnate da analisi post-mortem del campione di tessuto, che impedisce l'osservazione seriale in momenti ripetitivi e diretta osservazione del fisiologico o patologico elabora in vivo. Sofisticate tecniche di imaging di piccoli anim....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen secondo la legge di protezione animale tedesco (Tierschutzgesetz).
1. materiali e messa a punto sperimentale
- Cura degli animali.
- Utilizzare topi di pari età e del sesso di qualsiasi ceppo DSS-sensibili (ad es., C57BL/6) a 20-25 g di peso corporeo.
- Pianificare almeno cinque o più topi per ogni gruppo sperimentale e casa i topi secondo linee guida locale cura degli animali.
- Fornire un cibo del roditore standard dieta e sterilizzato nel....
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Risultati
Valutazione di colite:
Colite DSS indotta è un modello murino chimicamente indotto di infiammazione intestinale che assomiglia a IBD umana e conduce alla perdita di peso, sanguinamento rettale, ulcerazione superficiale e danno mucoso in topi suscettibili15. È particolarmente utile studiare il contributo del sistema immunitario innato per lo sviluppo di infiammazione intestinale
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Discussione
Anche se le tecniche di imaging medicale si sono evolute rapidamente negli ultimi anni, siamo ancora limitati nella nostra capacità di rilevare processi infiammatori o tumori, nonché altre malattie, nelle loro prime fasi di sviluppo. Tuttavia, questo è fondamentale per la crescita del tumore di comprensione, invasione, o lo sviluppo di metastasi e processi cellulari, nello sviluppo di patologie infiammatorie e malattie degenerative, cardiovascolari e immunologiche. Mentre le tecniche di imaging tradizionale si basano su .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la sig. ra Sonja Dufentester, Sig. ra Elke Weber e la signora Klaudia Niepagenkämper per l'eccellente assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Dieta senza erba medica | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Unguento per gli occhi Bepanthen | Bayer, Leverkusen, Germania | 80469764 | |
| destrano solfato di sodio (DSS) | TdB Consolato, Uppsala, Svezia | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania | E 4382 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germania | B506 | |
| Ematossilina | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tessuto Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Paesi Bassi | 4583 | Fissativo per analisi istologiche |
| Soluzione salina tamponata con fosfato, PBS | Lonza, Verviers, Belgio | 4629 | |
| Cloruro di sodio 0,9% | Braun, Melsungen, Germania 12211095 | /05/0411 | |
| Bicarbonato di sodio in polvere | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germania | S5761 | |
| Dieta standard | Altromin, Lage, Germania | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Paesi Bassi | 4566 | |
| Hemoccult (test della carta di guaiaco) | Beckmann Coulter, Germania | 3060 | |
| Biotina ratto-anti-topo anti-F4/80 anticorpo | Serotec, Oxford, Regno Unito | MCA497B | |
| Biotina ratto-anti-topo anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germania | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | , Darmstadt, Germania | S-11225 | eccitazione/emissione massima: 556/573nm |
| Anticorpo anti-CD11b ratto-anti-topo TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Anticorpo purificato F4/80 anti-topo | BioLegend, Londra, Regno Unito | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania | D9542 | |
| FITC-coniugato anti-Ly6C ratto-anti-topo | anticorpo BD Pharmingen, Heidelberg, Germania | 553104 | |
| tampone FACS | BD Pharmingen, Heidelberg, Germania | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europa, Friburgo, Germania | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germania | K 6631B | |
| Cy5.5 marcato anti-topo Anticorpo F4/80 | BioLegend, Londra, Regno Unito | 123127 | pronto all'uso Anticorpi marcati (alternativo) |
| Anti-topo F4/80 Antigene PerCP-Cianina5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | pronto all'uso Anticorpi marcati (alternativo) |
| DMSO (Dimetilsolfossido) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania | 67-68-5 | |
| Isoflurano | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania | 792632 | |
| Etanolo | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania | 64-17-5 | |
| Albumine sieriche bovine (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania | A4612 | |
| Soluzione salina tamponata Tris (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania | SRE0032 | |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germania | ||
| Sistema di imaging in vivo FMT 2000 | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| Software di analisi di imaging True Quant 3.1 | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | incluso nel microscopio fluorescente Leica | |
| Leica, 35578 Wetzlar, Germania | DMLB | ||
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlino, Germania | HD 2070 | omogeneizzatore ad ultrasuoni |
| bisturi monouso n. 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania | Z692395-10EA | |
| Forbici Metzenbaum 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germania | 22398330 | |
| siringa luer lock 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania | Z248010 | |
| aghi per siringhe | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania | Z192368 | |
| Falcon Tubo 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgio | 352070 |
Riferimenti
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J.
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Ristampe e permessi
