Method Article

Purificazione del compartimento di membrana per la degradazione del reticolo endoplasmatico-collegata di antigeni esogeni in Cross-presentazione

DOI:

10.3791/55949

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August 21st, 2017

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1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

In This Article

Summary

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Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione dei compartimenti cellulari dove antigeni esogeni vengono elaborati dal reticolo endoplasmatico-collegata di degradazione in cross-presentazione.

Abstract

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Le cellule dendritiche (DCs) sono altamente capace di elaborare e presentare antigeni esogeni interiorizzati su classe di istocompatibilità (MHC) sono molecole conosciuto anche come cross-presentazione (CP). CP svolge un ruolo importante non solo nella stimolazione dell'ingenuo CD8+ T cellule e memoria CD8+ T cellule per infettive e immunità del tumore ma anche nell'inattivazione di self-acting le cellule T naive di anergia delle cellule T o l'eliminazione delle cellule T. Sebbene il meccanismo molecolare critico del CP rimane essere delucidato, raccogliendo la prova indica che antigeni esogeni vengono elaborati tramite associati al reticolo endoplasmatico degradazione (ERAD) dopo l'esportazione da Tronchetti endocitosi scomparti. Fino a poco tempo, caratterizzazioni di questi comparti endocitosi sono stati limitati perché non c'erano specifici marcatori molecolari diversi da antigeni esogeni. Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione di questi comparti endocitosi. Utilizzando questo microsoma purificato, abbiamo ricostituito il ERAD-come trasporto, ubiquitinazione e l'elaborazione del antigene esogeno in vitro, suggerendo che il sistema ubiquitina-proteasoma elaborato l'antigene esogeno dopo l'esportazione da questo compartimento cellulare. Questo protocollo possa essere applicato ad altri tipi di cella per chiarire il meccanismo molecolare di CP.

Introduction

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Il MHC sono molecole sono espresse sulla superficie di tutte le cellule nucleate, con brevi peptidi antigenici derivati da antigeni endogeni, che vengono elaborati dal sistema ubiquitina-proteasoma nel cytosol1. Dopo l'elaborazione, peptidi antigenici sono trasportati nel lume del reticolo endoplasmatico (ER) del trasportatore di peptidi TAP. Nel lume dell'ER, una serie di specifiche chaperoni assistere il caricamento del peptide e il corretto ripiegamento del MHC I complessi. Questa serie di molecole è chiamato il complesso peptide-caricamento (PLC), che indica che l'ER è un vano centrale per peptide caricamento su MHC I2

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Protocol

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1. crescere cellule e aggiunta di antigeni esogeni

  1. preparare bOVA utilizzando un contrassegno di biotina-della proteina kit seguendo il produttore ' protocollo s.
    Nota: Normalmente, bOVA contiene biotina di 2 M per 1 M OVA mediamente.
  2. DC2.4 crescere le cellule in RPMI-1640 completate con 2 mM L-Glutammina, piruvato di sodio di 1 mM, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 100 U/mL penicillina-streptomicina, 55 mM 2-mercaptoetanolo, 10 mM HEPES (pH 7.5) e 10% siero fetale del vitello (d'ora in avanti RPMI) a 37 ° C in 5 % CO 2 in un incubatore (d'ora in avanti senza menzione, le cellule vengono incubate a questa condizione). È anche....

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Results

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Per delucidare il meccanismo molecolare di CP, è necessario identificare i compartimenti cellulari, dove antigeni esogeni subiscono ERAD-come trasporto e la lavorazione. Mentre le osservazioni da microscopia di immunofluorescenza o da microscopia elettronica identificato il compartimento cellulare dove antigeni esogeni accumulato16,17,18,19

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Discussion

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Negli studi precedenti di CP, gli antigeni esogeni incorporati accumulato nell'area riservata del tardo endosoma o ER da microscopia immunofluorescente16,30,31,32. Si stima che ERAD-come trasporto e la lavorazione di antigeni esogeni sono effettuate in queste aree specialistiche dell'ER o endosoma tardivo, come il compartimento cellulare è stato identificato da saccarosio o centrifugazione su g.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è supportato da Takasaki Università di salute e del benessere.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640gibco di life technologies11875-093
Siero fetale bovinoEquitech bioSFB30
Piruvato di sodiogibco di life technologies11360-070
MEM aminoacidi non essenzialigibco di life technologies11140-050
HEPES gibco di life technologies15630-080
2-mercaptoetanologibco di life technologies21985-023
L-glutamminagibco di life technologies25030-164
Penisicillina-sreptomicinagibco di life technologies15140-122
DMEMgibco di life technologies12100-46
OVASIGMAA5503
Biotina-proteina kit di etichettaturaThermo Fisher ScientificF6347
MG-132Santa Cruz Biotechnology201270
lattacistinaSIGMA L6785
Omogeneizzatore a discendenzaIUCHI131703
cocktail inibitori della proteasiSIGMAP8340
iodixanolCosmo bio1114542
Perle magnetiche SANew England Biolabs201270
perle magnetiche di controlloChemagenM-PVA012
supporto magneticoBD Biosciences552311
Kit per il dosaggio delle proteine BCAThermo Fisher Scientific23225
kit di colorazione dell'argentoCosmo bio423413
Reticolocyte LysatePromega
Flag-taged ubiquitinaSIGMAU5382
anti-ovalbumina (OVA, topo)Antibody ShopHYB 094-06
ant-multi-ubiquitina (topo)MBLD058−
anti-Flag (mouse)SIGMAF3165
tripsinaSIGMA85450C
17307143

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
  3. McDevitt, H. O.

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Cross presentationEndoplasmic Reticulum associated DegradationExogenous Antigen ProcessingDendritic Cell IsolationVesicle Purification ProtocolMicrosome PreparationERAD like TransportUbiquitination AssayAntigen PresentationCellular Compartment Purification

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