Viene presentato un protocollo per la creazione di un modello di topi geneticamente modificato del cancro del colon-retto mediante infezione adenocarica segmentale e la sua sorveglianza mediante colonscopia ad alta risoluzione.
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Articolo metodologico
Un modello di mouse geneticamente modificato del cancro colorettale sporadico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante i vantaggi di una facile applicabilità e di un rapporto costo-efficacia, i modelli del topo tumorale colorato a base di iniezione di cellule tumorali hanno gravi limitazioni e non simulano accuratamente la biologia tumorale e la diffusione delle cellule tumorali. I modelli del mouse geneticamente modificati sono stati introdotti per superare questi limiti; Tuttavia, tali modelli sono tecnicamente impegnativi, specialmente in grandi organi come il colon in cui è desiderato un solo tumore.
Di conseguenza, è stato sviluppato un modello di topo immunocompetente, geneticamente modificato del cancro del colon-retto, che sviluppa tumori altamente uniformi e può essere utilizzato per studi di biologia tumorale, nonché studi terapeutici. Lo sviluppo del tumore è iniziato dall'infezione chirurgica, segmentale del colon distale con virus adeno-cre in topi condizionati condizionatamente mutanti. I tumori possono essere facilmente rilevati e monitorati tramite colonscopia. Qui descriviamo la tecnica chirurgica dell'infezione segmentale di adeno-creIl colon, la sorveglianza del tumore mediante colonscopia ad alta risoluzione e presentare i tumori colorettali risultanti.
Introduzione
Il cancro del colon-retto (CRC) continua ad essere una delle cause principali della morte correlata ai tumori nei paesi occidentali. 1 Mentre la prognosi dei pazienti con malattia precoce è buona, molti tumori vengono diagnosticati in fasi successive in cui, nonostante numerose opzioni di trattamento, la prognosi è limitata. 2 , 3 , 4 , 5
La maggior parte dei modelli di mouse correnti del CRC si basa sull'impianto di cellule tumorali derivate da linee cellulari o tumori del paziente in topi immunodeficienti. 6 , 7 , 8 Questo porta a locali e, a seconda del sito di iniezione e delle cellule tumorali utilizzate per l'iniezione, a volte tumori metastatici. 9 , 10 Tuttavia, i modelli risultanti di xenograft hanno majoR limitazioni. Devono essere stabiliti in topi immunodeficienti, eliminando così l'interazione complessa tra il tumore e il sistema immunitario ospitante. Inoltre, poiché lo stroma tumorale è derivato da cellule ospitanti, l'interazione tra parenchima tumorale umana e stroma murina è difettosa e quindi non rappresentativa della malattia. Queste carenze possono essere evitate con l'uso di linee cellulari murine per l'iniezione. Tuttavia, solo alcune linee di cellule CRC murine sono disponibili e, simili alla maggior parte delle linee cellulari CRC umane disponibili, sono monoclonali e altamente anaplatiche. 11 In sintesi, la maggior parte dei modelli CRC attualmente disponibili sono altamente artificiali e non rappresentano pienamente rappresentativi della malattia umana.
I modelli di topi geneticamente modificati (GEMM) di CRC possono evitare questi inconvenienti in quanto presentano tumori di mouse genuini che vengono creati attraverso l'induzione di mutazioni chiave del CRC nel colon. 12 , 13 ,14 Ciò può essere ottenuto mediante l'attivazione di mutazioni della germinazione condizionale (floxed) mediante la ricombinasi all'interno della mucosa colorettale. Mentre in GEMM di molte altre entità del tumore si utilizza l'espressione germinale (inducibile) creata da promotori specifici del tessuto, la creazione di germline cre non può essere utilizzata nel colon come questo porta ad un gran numero di adenomi in tutto il colon causando la morte per carico tumorale benigno Un'età molto giovane. Pertanto, nel modello qui descritto, un virus adenovirale che esprime l'espressione cre è usato per infettare un segmento corto di due punti. Ciò porta all'induzione della tumorigenesi all'interno di questo segmento della mucosa in un punto temporale definito dall'individuo, con conseguente adenoma in ultima analisi che procede al carcinoma invasivo e metastatico. I tumori sono tumori genuini del topo, crescono in un microambiente intatto e quindi sono in grado di simulare l'intero oncogenesis del colon-retto, tra cui l'interazione tumor-host e la cascata metastatica. Questo modello èQuindi una piattaforma interessante per studi sulla biologia del cancro e sulle prove terapeutiche precliniche.
Uno svantaggio maggiore dei modelli di topi geneticamente modificati del CRC è la loro complessità tecnica. La distribuzione locale cre crea con clistere rettale adeno-cre nei topi che trasportano alleli APc floccati è stata descritta prima; Tuttavia, l'incidenza, la molteplicità e l'ubicazione dei tumori intestinali possono essere molto variabili con questa tecnica. Pertanto, è stata sviluppata la tecnica di limitare l'infezione da adeno-cre mediante bloccaggio chirurgico del segmento da indurre. 13 Abbiamo modificato questa procedura per migliorare il benessere degli animali, ridurre la mortalità e il numero di tumori che ne derivano. Con questo protocollo, tutti i laboratori con esperienza in piccole chirurgia di roditori dovrebbero poter riprodurre il modello e produrre tumori altamente riproducibili e facilmente accessibili alla colonscopia. A seconda del condizionale mSi possono osservare utature utilizzate per tumorigenesi, l'intero spettro di adenoma, carcinoma invasivo e metastasi. Poiché i tumori si trovano nel colon distale, la valutazione endoscopica seriale è facilmente possibile in questo modello.
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Protocollo
Gli esperimenti animali qui presentati sono stati riesaminati e approvati in maniera indipendente da un comitato istituzionale e governativo per la cura degli animali e sono stati condotti secondo le linee guida dell'Associazione federale delle scienze animali animali (FELASA). Tutte le misure possibili sono state prese per ridurre al minimo la sofferenza, inclusa l'anestesia e l'analgesia o, se necessario, l'eutanasia precoce.
1. Induzione tumorale locale attraverso l' infezione da Adeno-crea chirurgica
- Preparazione degli animali per la chirurgia
NOTA: Virtualmente qualsiasi mutazione condizionale ("floccata") può essere indotta dal metodo qui descritto. Si raccomanda l'uso di mutazioni nei geni rilevanti nel cancro del colon-retto come ad esempio Apc, Kras o Tp53. L'efficienza della ricombinazione crea dipende dalla dimensione del costrutto da escludere. Le grandi sequenze floccate vengono escluse in modo meno efficiente. La ricombinazione di tutti gli alleli deve essere confermata nei tumori da parte del PCR.- Per lo sviluppo di tumori del colon-retto, utilizzare una croce dei seguenti alleli condizionali per un modello di base di CRC (numero di database MGI tra parentesi):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Se è richiesto un allele reporter di fluorescenza ( ad esempio , per rilevare micrometastasi), utilizzare il seguente allele:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
NOTA: Tutti i ceppi sopra sono disponibili tramite il repository NCI Mouse o il laboratorio di Jackson. Nessun digiuno è necessario perché tutta la materia fecale rimanente può essere svuotata prima dell'infezione adenovirale. Il digiuno preoperatorio conduce a una maggiore mortalità perioperatoria e costituisce un tremendo stress per i piccoli roditori. - Utilizzare sevoflurano a 3 - 3,5 vol% per l'anestesia generale. Una perdita di tIl suo toe ripiegamento pizzico indica un'anestesia sufficiente.
- Prima della prima incisione, iniettare 0.05 mg / kg di buprenorfina sottocutanea.
- Coprire gli occhi del mouse anestetizzato con unguento oculare per evitare la desquamazione della cornea.
- Posizionare il mouse in posizione supina su un piccolo tavolo. Utilizzare nastri adesivi non traumatici per trattenere il mouse.
- Rasare l'addome con un rasoio elettrico (crema depilatoria può essere usato alternativamente) e disinfettare con tamponi di alcol o iodio. Utilizzare il tempo di contatto raccomandato dal produttore.
- Coprire il campo chirurgico con tende sterili.
NOTA: l'uso di antibiotici perioperatori è facoltativo e soggetto a linee guida istituzionali. - Utilizzare sterili singoli usi o strumenti sterilizzati per tutte le procedure chirurgiche.
- Per lo sviluppo di tumori del colon-retto, utilizzare una croce dei seguenti alleli condizionali per un modello di base di CRC (numero di database MGI tra parentesi):
- Laparotomia midline e esposizione del colon
- Utilizzare forbici (possono essere usati alternativamente scalpelli) per eseguire un'incisione midline(~ 15 mm) della pelle sull'addome inferiore.
- Raccogliete la muscolatura della parete addominale con le pinze e incisi con cura con forbici, aprendo così la cavità addominale.
- Identificare il colon distale, toccarla solo con pinze atraumatiche. Morsetti il colon con un morsetto delicato ( ad es . Un morsetto vascolare Micro Serrefine) circa 15 mm in prossimità dell'ano.
NOTA: prestare particolare attenzione alla vulnerabilità del colon in ogni momento. La perforazione porta inevitabilmente alla peritonite e alla sepsi e richiede l'eutanasia dell'animale.
- Infezione segmentale del colon con virus Adeno-cre
- Inserire un tubo flessibile di Teflon in modo transanale e accuratamente avanzarlo fino a raggiungere l'occlusione del lumen raggiunta dal morsetto precedentemente posizionato a 15 mm dall'orlo anale. Non utilizzare una forza eccessiva in quanto ciò può portare alla perforazione.
- Canottare il tubo con una cannula da 30G, collegare una siringa standard da 1 ml e scuotere il coloN con normale soluzione salina per evacuare la restante materia fecale. Ciò può richiedere diversi ml di soluzione salina.
- Una volta che il colon distale è vuoto togliere il tubo e sostituirlo con un nuovo tubo in teflon e posizionarlo nuovamente distalmente al morsetto come sopra descritto.
- Collocare il colon con un secondo morsetto distanziato di circa 3 mm dal morsetto prossimale ( cioè sopra il tubo inserito, ~ 12 mm dal bordo anale), con conseguente infezione di un segmento isolato da 3 mm.
NOTA: per l'occlusione distale del segmento Le clip di arterie coronarie di Fogarty si sono dimostrate più idonee in quanto sono gommate, portando ad una occlusione stretta del colon nonostante il tubo intralumino tra i rami del morsetto. - Usare una seconda siringa (standard 1 mL con una cannula da 30G) per iniettare con cura 50-80 μL di 0,25% di Trypsin-EDTA nel segmento del colon bloccato e incubare per 10 minuti. Lasciare la cannula e la siringa attaccata al tubo in teflon per evitare che il liquido venisse ripreso.
NOTA: il colon deve essere gonfiato per rompere la barriera della mucosa e per raggiungere le cellule staminali della cripta, ma non troppo gonfiato per evitare la perforazione del segmento bloccato. - Primo rimuovere il morsetto distale e poi il tubo di tripsina.
- Spurgare il colon distale con ~ 500 μl di soluzione salina normale per rimuovere la restante tripsina.
- Inserire un nuovo tubo di Teflon, mettere il morsetto distale in posizione e gonfiare il segmento del colon con 50-80 μL di soluzione adenovirale (10 11 unità di formazione di placche (PFU) / mL in soluzione salina fosfata) e incubare per 30 min Figura 2A ).
NOTA: Non versare la soluzione virale come contatto con adeno-cre può portare allo sviluppo del tumore in qualsiasi tessuto di topi condizionatamente condizionati. - Rimuovere i morsetti e il tubo.
- Chiusura dell'addome e recupero postoperatorio
- Chiudere la parete addominale con 6-0 rapidamente assorbibili su su(Ad esempio , polidioxanone (PDS)).
- Chiudere la pelle con le ferite chirurgiche.
- Posizionare il mouse sul pannello di riscaldamento impostato a 38 ° C finché non sia completamente recuperato dall'anestesia.
- Amministrare un altro bollo di 0,05 mg / kg di buprenorfina ip 12 ore dopo l'intervento chirurgico, seguita da bolus addizionali di buprenorfina ogni 12 ore se necessario.
- Monitorare i topi almeno una volta al giorno per segni di sofferenza a causa della crescita del tumore.
2. Colonscopia
NOTA: A seconda delle mutazioni condizionali utilizzate, l'infezione adenovirale porta a tumori endoscopicamente visibili entro 2 - 4 settimane. Pertanto eseguire la prima colonscopia postoperatoria 2 settimane dopo l'induzione adenovirale e ripetere ogni 2 settimane. Si raccomanda un sistema commercialmente disponibile per la colonscopia murina. 20
- Preparazione degli animali per colonscopia
NOTA: nessun digiuno è richiestoed. La rimanente materia fecale è generalmente ben formata nel colon distale e può essere spinta al di là del tumore durante la colonscopia, rendendo così inutile il processo stressante del ripetuto digiuno.- Utilizzare sevoflurano a 3 - 3,5 vol% per l'anestesia generale. Una perdita del riflesso del pizzico del piede indica un'anestesia sufficiente.
- Coprire gli occhi dei topi anestetizzati con unguento oculare per evitare la desquamazione della cornea.
- Restringere i topi in posizione supina su un piccolo tavolo.
- Colonscopia
- Inserire il campo d'azione (diametro 1,9 mm, lunghezza 10 cm) nel tratto intestinale attraverso l'ano e con aria accuratamente insufflato sotto controllo visivo per distendere il colon. Non insufflate più aria di quanto richiesto per l'esame.
NOTA: per l'insufflazione dell'aria, può essere utilizzata la pompa dell'aria anti-nebbia del sistema di colonscopia. Se non è disponibile una pompa dell'aria anti-nebbia, è possibile utilizzare qualsiasi altro pompa ad aria con impostazioni di pressione molto basse o preAria compressa con una delicata valvola di riduzione della pressione. L'anidride carbonica (CO 2 ) porta facilmente all'acidosi nei piccoli roditori e deve quindi essere evitato. - Spingere con attenzione la portata in avanti fino a individuare una lesione mucosa nel distro distale ( Figura 1A - 1D ).
- Salva immagini endoscopiche per una valutazione successiva. Un sistema di punteggio endoscopico per tumori intraluminali è stato descritto in precedenza. 20
- Rimuovere attentamente la portata e posizionare il mouse sul pannello di riscaldamento impostato a 38 ° C finché non sia completamente recuperato dall'anestesia.
- Inserire il campo d'azione (diametro 1,9 mm, lunghezza 10 cm) nel tratto intestinale attraverso l'ano e con aria accuratamente insufflato sotto controllo visivo per distendere il colon. Non insufflate più aria di quanto richiesto per l'esame.
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Risultati
Se eseguita adeguatamente,> 85% degli animali sviluppa tumori. La mortalità della procedura chirurgica qui presentata è <5%, la mortalità della colonoscopia è praticamente inesistente. Nella maggior parte dei topi è stata individuata una singola lesione; In circa il 30% possono essere rilevati 2 - 3 piccoli adenomi che si fondono di solito in un unico tumore entro 2-3 settimane dall'insorgenza del tumore.
Il fenotipo...
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Discussione
Mentre sono generalmente facili da generare e mantenere, i modelli classici di CRC basati sull'iniezione della linea cellulare sono artificiali e non sono in grado di ricapitolare completamente la malattia umana. Di conseguenza, i GEMM sono stati sviluppati. Il primo GEMM CRC era il mouse Apc Min , che ospita una mutazione null eterozigote nel gene Apc, quindi imitando la poliposi adenomatica familiare familiare (FAP) della malattia ereditaria umana. Tuttavia, i topi Apc Min sviluppano invariab...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è dedicato alla memoria del professor Moritz Koch.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti / materiali di consumo | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Soluzione salina normale 0,9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa | ||
| 15 mL, 50 mL provette per centrifuga | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Provette Eppendorf 1,5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.695.400 | |
| Piastra di Petri PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| Siringa da 1 mL (senza volume morto) - Injekt-F SOLO Braun | /neoLab | 194291661 | |
| 30G ago per iniezione | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Analgesia / anestesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Ossigeno | ||
| medico | Air Liquide Medical | ||
| (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - unguento oftalmico | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Macchina per anestesia da tavolo x / O2 Flush con vaporizzatore di sevoflurano | Parkland Scientific | V3000PS / PK | |
| strong> Nome< / strong > | < strong> Azienda< / strong > | Numero di catalogo< / strong > | Comments< / strong > |
| Attrezzature chirurgiche | |||
| Tamponi di cellulosa | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Siringa da insulina EMG 1 mL (con cannula da 30 G) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Tubo a foro fine (alesaggio: 0,28 mm/ diametro: 0,61 mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Forcipe Micro-Adson | Strumenti per la scienza fine | 11018-12 | |
| Forbice per iride - Strumenti per | scienza fine | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Portaaghi | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip | Kit Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (sutura chirurgica) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Morsetto vascolare curvo Micro Serrefine | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Clip a molla Fogarty Edwards | CDSAFE 6 | ||
| Piastra riscaldante 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Rasoio per capelli | Aesculap - Braun | - | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Colonscopia | |||
| Fontana a luce fredda XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Cavo a fibra ottica | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Testa telecamera a tre chip | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Unità di controllo telecamera | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Monitor a schermo piatto da 15" EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Telescopio dritto HOPKINS diametro 1,9 mm; lunghezza 10 cm autoclavabile trasmissione della luce in fibra ottica incorporata | Karl Storz | 64301AA | |
| Guaina di protezione e visita | Karl Storz | 61029C |
Riferimenti
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