Il sistema di cocultivazione idroponico descritto supporta piante intatte con schermi a maglie metalliche e cocultivala con batteri. I tessuti vegetali, i batteri e le molecole secrete possono quindi essere raccolte separatamente per analisi a valle, consentendo contemporaneamente le risposte molecolari di entrambi gli host vegetali e dei microbi o dei microbiomi interattivi.
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Articolo metodologico
Un sistema di co-coltivazione idroponica per l'analisi simultanea e sistematica delle interazioni molecolari e della segnalazione delle piante / microbe
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un disegno sperimentale che imita le interazioni microbi-vegetali naturali è molto importante per delineare i complessi processi di segnalazione plant-microbe. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Fornisce un eccellente sistema di modelli per studiare la patogenesi batterica e le interazioni vegetali. Studi precedenti sulle interazioni plant- Agrobacterium si sono basate in gran parte sulle colture di sospensione delle cellule vegetali, la ferita artificiale delle piante, o l'induzione artificiale di fattori di virulenza di microbi o difese vegetali da sostanze chimiche sintetiche. Tuttavia, questi metodi sono distinti dalla naturale segnalazione in pianta , dove le piante e i microbi riconoscono e reagiscono in maniera spaziale e temporale. Questo lavoro presenta un sistema di cocultivazione idroponica in cui le piante intatte sono supportate da schermi di maglie metalliche e cocultivate con Agrobacterium . In questo sistema di cocultivazione, nessun fitotormone sintetico o chimico che induce micrÈ integrata la virulenza o la difesa vegetale. Il sistema di cocultivazione idroponica somiglia molto alle interazioni microbi-vegetali naturali e alla homeostasi di segnalazione in planta . Le radici delle piante possono essere separate dal mezzo contenente Agrobacterium e la segnalazione e le risposte sia degli host vegetali che dei microbi interagenti possono essere studiati contemporaneamente e sistematicamente. In qualsiasi momento / intervallo di tempo, i tessuti vegetali oi batteri possono essere raccolti separatamente per varie analisi "omiche", dimostrando il potere e l'efficacia di questo sistema. Il sistema di coltivazione idroponica può essere facilmente adattato per studiare: 1) la segnalazione reciproca di diversi sistemi vegetali-microbici, 2) la segnalazione tra un host vegetale e più specie microbiche ( cioè consorzi microbiali o microbiomi), 3) come sono implicati i nutrienti e le sostanze chimiche Nella segnalazione di microrganismi vegetali e 4) come i microbi interagiscono con gli host vegetali e contribuiscono alla tolleranza vegetale a bioticiR sollecitazioni abiotiche.
Introduzione
I microbi associati all'impianto svolgono un ruolo importante nel ciclo biogeochimico, nella bioremediazione, nella mitigazione del cambiamento climatico, nella crescita vegetale e nella salute, e nella tolleranza alle tensioni alle tensioni biotiche e abiotiche. I microrganismi interagiscono con le piante sia direttamente attraverso il contatto cellulare a parete cellulare che indirettamente tramite secrezione chimica e segnalazione 1 , 2 , 3 . Come organismi sessili, le piante hanno sviluppato meccanismi diretti e indiretti per resistere all'infezione da agenti pat....
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Protocollo
1. Pianificazione sperimentale
- Determinare gli obiettivi specifici dell'esperimento.
- Leggete l'intero protocollo di seguito. Determinate quali sezioni sono rilevanti per gli obiettivi specifici e se è necessario apportare qualsiasi modifica. Vedere sotto per esempi.
- Considerate se gli esperimenti utilizzeranno le piante A. thaliana e il batterio A. tumefaciens , come sotto, o un'altra combinazione plant-microbe.
NOTA: Mentre possono essere utilizzate varie specie vegetali, lo spessore delle radici vegetali può richiedere una maglia di diversa grandezza (fase 3.3) ei parametri di cresc....
- Considerate se gli esperimenti utilizzeranno le piante A. thaliana e il batterio A. tumefaciens , come sotto, o un'altra combinazione plant-microbe.
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Risultati
Crescita nel sistema di coltivazione idroponica
La curva di crescita di A. tumefaciens C58 ha dimostrato una fase di ritardo significativa nelle prime 16 ore di cocultivazione, seguita da una crescita molto stabile quando co-coltivata con A. thaliana Col-0, fino ad un massimo di OD 600 di circa 0.9 a partire da 48 h postinoculation. Al contrario, essenzialmente nessuna crescita batterica è stata osser.......
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Discussione
Data la natura graduale della secrezione radicale, la concentrazione di sostanze chimiche che inducono la virulenza prodotta in planta ei loro effetti sulle interazioni dinamiche tra pianta e microbici si verificano in gradienti spaziali e temporali. In questo sistema di co-coltivazione idroponica, non è completato alcun fitotormone sintetico o chimico che induce virulenza di microbi o difese delle piante. Al contrario, utilizzando approcci convenzionali, l'aggiunta di sostanze chimiche sintetiche, come il .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Brian Weselowski e Alexander W. Eastman per il loro aiuto e la loro utile discussione. Ringraziamo anche i dottori. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui e Greg Thorn per il loro aiuto, discussioni utili e lettura critica del manoscritto. Questa ricerca è stata finanziata dall'Agricoltura e Agri-Food Canada, dal Growing Forward-AgriFlex (numero RBPI numero 2555) e dal progetto Growing Forward II numero 1670, condotto dagli autori come parte delle loro funzioni. Questo studio è stato anche parzialmente finanziato dalla ZC Yuan di Grant RGPIN-2015-06052 del Ricercatore di Scienze Naturali e di Ingegneria del Canada (NSERC).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| semi di piante (Arabidopsis thaliana Col-0) | Arabidopsis Biological Resource Centre | CS7000 https://abrc.osu.edu/order-stocks | |
| batteri (Agrobacterium tumefaciens C58) | Università di Washington | N/A | |
| batteri marcati | in-house | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| vortice | (vari) | ||
| provette per microcentrifuga | (varie) | ||
| microcentrifuga | (varie) | ||
| ipoclorito di sodio al 5% | (varie) | ||
| doppia acqua distillata | (varie) | ||
| autoclave | (varie) | ||
| micropipetta | (vari) | ||
| 70% etanolo | (vari) | ||
| Murashige e Skoog (MS) sali basali | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| saccarosio | (vari) | ||
| MES | (vari) | ||
| B5 vitamin mix | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| fitoagar | (vari) | ||
| Piastre di Petri profonde | (varie) | ||
| rete in acciaio inossidabile | Ferrier Wire Goods Company Ltd | N / A | grado: 304; conteggio delle maglie: 40 e volte; 40; filo DIA: 0,01 |
| nastro microporo, 1 " | 3M | 1530-1 | |
| camera di crescita diurna | (vari) | ||
| serbatoi cilindrici di vetro, 100 e volte; 80 mm. | Pyrex | 3250 | possono essere utilizzate altre dimensioni, nel qual caso potrebbe essere necessario regolare il contenuto del |
| liquido cappa | di flusso (vari) | ||
| forcepts | (vari) | ||
| estratto di lievito | (vario) | ||
| triptone | (vario) | ||
| MgSO4 | vario) | ||
| incubatore a tregua | (vari) | ||
| spettrofotometro | (vari) | ||
| NaCl | (vario) | ||
| agitatore | (vario) | ||
| forbici | (vario) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| microscopio a fluorescenza | (vario) | opzionale, dipende da downstream analisi | |
| vetrini per microscopio e vetrini coprioggetti | (vari) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| smalto per unghie | (vari) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| Kit di estrazione dell'RNA batterico | (vari) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| kit di estrazione dell'RNA delle piante (RNeasy Plant Mini Kit) | Qiagen | 74903 o 74904 | opzionale, dipende dalle analisi a valle |
| materiale e attrezzatura per qRT-PCR | (vari) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| materiale e attrezzature per l'analisi di microarray ( | vari) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| azoto liquido | (vario) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| mortaio e pestello | (vari) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| 0,2 & micro; m filtro dei pori | (vari) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| provette coniche da 50 mL | (varie) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| liofilizzatore | (varie) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| provette sigillabili | (varie) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| acetato di etile | (vario) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| azoto gassoso | (vario) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| materiale e attrezzature per HPLC | (varie) | opzionale, dipende dalle analisi a valle | |
| materiale e attrezzature per ESI-TOF-MS( | varie) | opzionale, dipende dalle analisi a valle |
Riferimenti
- Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799....
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Ristampe e permessi
