Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

Summary

Questo protocollo descrive come effettuare esperimenti automatici con patch-cluster guidati dall'immagine utilizzando un sistema recentemente sviluppato per apparecchiature elettrofisiologiche standard in vitro .

Abstract

Il morsetto di patch a cellule intere è il metodo standard gold per misurare le proprietà elettriche delle singole cellule. Tuttavia, il morsetto di patch in vitro rimane una tecnica impegnativa e di bassa produttività grazie alla sua complessità e all'alta dipendenza dal funzionamento e dal controllo da parte degli utenti. Questo manoscritto dimostra un sistema di bloccaggio automatico delle patch per le esperienze di morsetti di patch a cellule in vitro in fette acute del cervello. Il nostro sistema implementa un algoritmo basato su visione informatica per rilevare le celle con etichette fluorescenti e per indirizzarle per la patch completamente automatica usando un micromanipulator e un controllo interno della pressione della pipetta. L'intero processo è altamente automatizzato, con requisiti minimi per l'intervento umano. Le informazioni sperimentali in tempo reale, tra cui la resistenza elettrica e la pressione interna della pipetta, sono documentate elettronicamente per analisi futura e per ottimizzazione a diversi tipi di cellule. Anche se il nostro sistema è descritto nel contesto di brai acutiN può essere applicato anche alla messa a punto automatizzata di patch di neuroni dissociati, culture di fetta organotipica e altri tipi di cellule non neuronali.

Introduction

La tecnica della pinzetta patch è stata sviluppata da Neher e Sakmann negli anni '70 per studiare i canali ionici delle membrane eccitabili ¹ . Da allora, il bloccaggio della patch è stato applicato allo studio di molti soggetti diversi a livello cellulare, sinaptico e a livello di circuito sia in vitro che in vivo, in diversi tipi di cellule, inclusi neuroni, cardiomiociti, oociti Xenopus e liposomi artificiali ² . Questo processo prevede la corretta identificazione e il targeting di una cella di interesse, il controllo di micromanipulatore intricato per spostare la pipetta patch in prossimità del....

Protocol

1. Impostazione del sistema

1. Costruire l'unità di controllo della pressione.
   1. Montare l'unità di controllo della pressione in base alla mappa del circuito ( Figura 1 ). Saldare le parti necessarie sul circuito stampato (PCB) realizzato secondo gli schemi dei circuiti elettrici ( figura 1b ). Utilizzare resistori standard, LED, transistori campo-effetto (Semiconductor Metal-Oxide Semiconductor), condensatori e connettori (vedi tabella dei materiali ). Le elettrovalvole a saldare sul PCB. Collegare il sensore della pompa dell'aria e della pressione dell'aria a....

Results

Il nostro sistema è stato testato sulla sua capacità di patch delle cellule in fette cerebrali acute, cellule staminali pluripotenti indotte da mouse (iPSCs) differenziate in neuroni e cellule HEK 293 artificialmente esprimendo canali di interesse. La Figura 3 mostra un esperimento che usa i topi transgenici Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) targeting neuroni piramidali strati 5 fluorescenti etichettati nella corteccia visiva. La cellula.......

Discussion

Qui descriviamo un metodo per le registrazioni automatiche delle morsetti di patch guidate dall'immagine in vitro . I passi chiave di questo processo sono riepilogati come segue. Innanzitutto, la visione informatica viene utilizzata per riconoscere automaticamente la punta della pipetta usando una serie di immagini acquisite tramite un microscopio. Queste informazioni vengono poi utilizzate per calcolare la funzione di trasformazione delle coordinate tra il microscopio ei sistemi di coordinate del manipolat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Telecamera	CCD QImaging	Rolera Bolt
Impianto di elettrofisiologia	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscopio e manipolatori. Il software di controllo del manipolatore fornito dal produttore dimostrato in questo manoscritto è " Linlab2".
Amplificatore	Molecular Devices	MultiClamp 700B	Amplificatore per microelettrodi controllato da computer
Digitalizzatore	Molecular Devices	Sorgente luminosa LED Axon Digidata 1550
	Cool LED	pE-100	lunghezza d'onda di 488 nm
Scheda di acquisizione dati	Calcolo di misura	USB1208-FS	DAQ. Vedere il manuale all'indirizzo: http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Elettrovalvole	The Lee Co.
Pompa dell'aria	Industria virtuale	VMP1625MX-12-90-CH
Sensore di pressione dell'aria	Semiconduttore Freescale	MPXV7025G
Slice hold-down Warner	instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Kit di ancoraggio Slice, piatto per camera RC-40, 2,0 mm, 19,7 mm
Python	Anaconda	versione 2.7 (32 bit per Windows)
Morsetti a vite	Sparkfun	PRT - 08084	Terminali a vite passo 3,5 mm (2 pin)
(2 pin)
MOSFET a canale N 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
Prese DIP Coda a saldare - 8 pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Base Rosso 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Verde di base 5mm	Sparkfun	COM-09592
/ connettore di alimentazione cilindrico CC (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Alimentatore adattatore da parete - 12 V CC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Cavo di collegamento - Assortimento (nucleo solido, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Rubinetto di bloccaggio maschio x femmina x femmina	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Tubi flessibili	Fisher scientific	14-171-129	Diametro esterno: 1/8 Diametro interno: 1/16 in.
Cavo coassiale BNC maschio a BNC maschio	Belkin Components	F3K101-06-E
Resistenza da 560 Ohm (tolleranza del 5%)	Radioshack	2711116
Picospritzer Valvola	generale	Picospritzer II