Method Article

Un metodo basato sulla filtrazione per preparare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico incrociato per l'immunoprecipitazione cromatina

DOI:

10.3791/56013

⸱

July 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Health Science Center at Houston

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo basato sulla filtrazione per isolare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico del mouse a croce, in cui abbiamo rimosso la necessità di ultracentrifugazione, rendendola facilmente applicabile. Mostriamo che la cromatina preparata dai nuclei è adatta per l'immunoprecipitazione di cromatina e probabilmente gli studi di sequenza di immunoprecipitazione cromatina.

Abstract

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L'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è un metodo potente per determinare la legame delle proteine ​​al DNA cromatina. Il muscolo scheletrico ricco di fibre, tuttavia, è stato una sfida per ChIP a causa di difficoltà tecniche in isolamento di nuclei di alta qualità con minima contaminazione dei miofibri. I protocolli precedenti hanno tentato di purificare i nuclei prima di incrociare, il che comporta il rischio di alterazione dell'interazione tra proteine ​​del DNA durante il prolungato processo di preparazione del nucleo. Nel protocollo attuale, abbiamo prima incrociato il tessuto muscolare scheletrico raccolto dai topi, ei tessuti vennero macinati e sottoposti a sonicazione. Dal momento che abbiamo scoperto che l'ultracentrifugazione non era in grado di separare i nuclei dai miofibri usando tessuti muscolari reticolati, abbiamo elaborato una procedura di filtrazione sequenziale per ottenere nuclei di alta qualità privi di contaminazione myofibra significativa. Successivamente abbiamo preparato la cromatina usando un ultrasonicator, e i test di ChIP con anti-BMAL1 anticorpo hanno rivelato robusto legame circadianoPattern di BMAL1 a destinare i promotori del gene. Questo protocollo di filtrazione costituisce un metodo facilmente applicabile per isolare nuclei di alta qualità dal tessuto muscolare scheletrico reticolato, consentendo un'elaborazione costante del campione per studi circadiani e altri sensibili ai tempi. In combinazione con sequenziamento di nuova generazione (NGS), il nostro metodo può essere impiegato per vari studi meccanici e genomici incentrati sulla funzione muscolare scheletrica.

Introduction

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Il muscolo scheletrico gioca un ruolo importante nella fisiologia e nel comportamento. La fibra muscolare multi-nucleata è costituita da miofibri in cui l'actina e la myosina formano unità funzionali chiamate sarcomeri per generare forza contrattile. Il muscolo scheletrico è anche il più grande organo metabolico del corpo, che rappresenta l'assunzione postprandiale del glucosio> 80% e regola la risposta dell'insulina e l'omeostasi metabolica 1 , 2 . La fisiologia muscolare e il metabolismo sono strettamente regolamentati dall'orologio circadian, un timer biologico intrinseco 3 , 4 , 5 , 6 . Ad esempio, la delezione muscolare-scheletrica di Bmal1 , uno dei principali componenti orologi circadiani, ha determinato una resistenza all'insulina e una riduzione della somministrazione di glucosio nel muscolo scheletrico e gli animali sono stati individuati per sviluppare il diabete di tipo 2 7 . ioInoltre, il muscolo scheletrico è sempre più apprezzato come un organo endocrino 8 , secreto le miokine per regolare il metabolismo sistemico e la fisiologia. Studi meccanici sono necessari per comprendere appieno queste funzioni regolatrici nel muscolo scheletrico.

ChIP è un approccio potente per delineare il reclutamento del promotore delle proteine ​​legate al DNA. ChIP è stato inizialmente sviluppato per identificare l'organizzazione dei nucleosomi nel DNA cromatina 9 , 10 . Una varietà di metodi sono da allora riportati alle proteine ​​a croce e al cromatin DNA utilizzando formaldeide, dimetilsolfato o irradiazione ultravioletta (UV) 11 , 12 . Il cross-linking di formaldeide è la struttura più comunemente utilizzata per la conservazione della cromatina e le interazioni tra DNA e proteine 9 , 13 , 14 . Cromatico reticolatoIn è triturata dalla sonicazione e immunoprecipitato con anticorpo contro la particolare proteina legante del DNA di interesse 15 , 16 . Negli ultimi anni, il ChIP-sequenza (ChIP-seq), un metodo che unisce ChIP con NGS, è stato sviluppato per interrogare il legame di genitia di fattore di trascrizione 17 e in alcuni casi per monitorare le variazioni dinamiche su un corso di tempo 18 , 19 , 20 . Ad esempio, gli studi circadiani ChIP-seq hanno rivelato una sequenza altamente orchestrata di legame genomico dei componenti dell'orologio circadiano e dei marcatori istoni, che conduce un'espressione genica precisa in tutto il ciclo circadian 24 h.

La maggior parte dei protocolli ChIP disponibili sono progettati per i tessuti molli ( ad es. Fegato, cervello, ecc. ) E pochissimi sono stati pubblicati per tessuti duri, tra cui scafoTal muscolo. È tecnicamente impegnativo per omogeneizzare i muscoli scheletrici ricchi di fibre e isolare nuclei di alta qualità 21 , specialmente per gli esperimenti ChIP che richiedono un collegamento incrociato. In un recente studio muscolo ChIP 22 , le cellule satellitari sono state separate da miofibere e nuclei sono stati preparati da entrambi i tipi di cellule attraverso una prolungata procedura che coinvolge la digestione tissutale. L'intero processo ha richiesto circa tre ore per completare prima che la fusione di formaldeide sia stata eseguita su nuclei isolati. Mentre questa procedura evitava la creazione di fibre muscolari incrociate, rendendo il tessuto muscolare ancora più refrattario per un'efficace omogeneizzazione ed è stato in grado di produrre nuclei di alta qualità, il significativo tempo trascorso dalla raccolta dei tessuti ai reticolazione dei nuclei comporta il rischio di alterato DNA -interazione tra proteine. Al contrario, la maggior parte degli studi ha effettuato la reticolazione immediatamente dopo il trattamento sperimentale o la raccolta dei tessuti al fine di preservare le proteine ​​del DNA in tempo realeN vincolante 12 . Un secondo inconveniente dell'isolamento del nucleo prima della connessione incrociata è che preclude applicazioni sensibili al tempo come ad esempio la raccolta di campioni circadiani che si presenta tipicamente a intervalli di 3 - 4 ore. Senza incrociare i nuclei, l'isolamento deve proseguire immediatamente dopo la dissezione, mentre campioni reticolati possono essere elaborati insieme dopo l'intero ciclo di tempo completato, garantendo così una maggiore consistenza sperimentale.

Sono stati inoltre riportati altri protocolli per l'isolamento del nucleo da muscoli scheletrici non rettangolari. Due studi hanno descritto l'utilizzo di ultracentrifugazione gradiente a nuclei separati da residui di miopi e detriti cellulari 23 , 24 . Mentre il saccarosio o l'ultracentrifugazione a gradiente colloidale sono efficaci con i tessuti muscolari non rettilineati, i nostri esperimenti hanno rivelato che dopo il reticolazione, l'ultracentrifugazione di gradiente non è riuscita a separare i nuclei dalla cella dEbris sul gradiente.

Abbiamo quindi sviluppato una procedura per isolare nuclei di alta qualità usando tessuti muscolari scheletriche a croce. Piuttosto che l'ultracentrifugazione gradiente, abbiamo elaborato un metodo di filtrazione seriale per separare efficacemente i nuclei dai detriti. Dopo l'ultrasonografia, i campioni di cromatina sono stati applicati con successo per gli studi di ChIP che hanno mostrato un pattern circadiano di proteina BMAL1 legato ai promotori di bersaglio. Il nostro metodo può essere generalmente applicabile a vari studi meccanici dei tessuti muscolari.

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Protocol

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La cura degli animali è stata eseguita in base alle linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e le procedure sono state condotte secondo un protocollo animale approvato dall'Università del Texas Health Science Center di Houston.

1. Isolamento delle nuclei dal muscolo scheletrico incrociato

  1. Pesare e schiacciare i muscoli scheletrici degli arti posteriori, isolati da topi maschii C57BL / 6 di circa 20 settimane, in salina fosfata tamponata ghiacciata (PBS) come descritto dettagliatamente in precedenza 22 .
    NOTA: di solito ottieniamo 1,0 - 1,5 g di muscolo scheletrico da un solo topo.
    1. Posizionare il tessuto muscolare scheletrico macinato in un tubo conico da 50 mL contenente 10 ml di PBS sul ghiaccio.
  2. Centrifugare a 300 xg a 4 ° C per 5 min.
  3. Rimuove attentamente il sopranatante di PBS per aspirazione.
  4. Stimate il volume di pellet in ogni tubo da 50 ml utilizzando tubi di riferimento con 1, 2, 3 e 4 ml di acqua.
  5. Aggiungere 7 volumi diFormaldehide 1% di ghiaccio freddo in PBS e omogeneizzare i campioni sul ghiaccio usando un omogeneizzatore di tessuti di sonda (vedere tabella dei materiali ).
    NOTA: Opzionale: La procedura di omogeneizzazione può essere condotta in una stanza fredda.
  6. Incrociare il campione incubando a temperatura ambiente per 10 min.
  7. Spegni la reazione di reticolazione mediante l'aggiunta di 1 M glicina a una concentrazione finale di 0,125 M e incuba per 5 minuti a temperatura ambiente.
  8. Centrifugare i campioni a 3.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante attraverso l'aspirazione.
  9. Sciacquare con 10 mi di base di ghiaccio freddo (10 mM HEPES-KOH a pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT) contenenti inibitori della proteasi appena aggiunti (0,2 mM fenilmetilsolfonilfluoruro (PMSF) , E 10 μg / mL di leupeptina). Centrifugare a 3.000 g per 5 min a 4 ° C e rimuovere con cura il surnatante mediante aspirazione.
  10. Resuspendere il pellet in 6 ml di tampone di lisi (10 mM HEPES-KOH a pH 7.3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) contenenti inibitori della proteasi appena aggiunti (0,2 mM PMSF e 10 μg / mL leupeptina).
  11. Trasferire il campione in un omogeneizzatore Dounce di 15 ml preincollato e incubare per 10 minuti su ghiaccio. Eliminare omogeneizzare ogni campione su ghiaccio con 15 colpi lenti utilizzando pestello sciolto e seguire 15 colpi con pestello stretto per liberare i nuclei.
  12. Filtrare l'omogenato (6 mL) attraverso il filtro delle cellule (dimensione del pori: 100 μm) e risciacquare con 4 mL di tampone di lisi. Centrifugare i campioni a 1.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Riposizionare in 5 mL di tampone di base ghiacciato e sfocare 10 volte con pestello stretto per rilasciare i nuclei.
    1. Rimuovere una aliquota di 20 μL per la misurazione della concentrazione del DNA con uno spettrofotometro (OD260 / OD280) e osservazione microscopica con blu di trypan, se necessario (vedi sotto) ( Figura 1 A ).
  13. Filtrare la sospensione attraversoUn filtro di cellule (dimensione della parete: 70 μm), sciacquare il tubo e filtrare nuovamente con 2 mL di base di tampone come sopra.
  14. Ripetere la filtrazione come nel punto 1.13 con filtri a cellule di dimensione gradualmente ridotta dei pori (40 μm, 30 μm, 20 μm e 10 μm).
    NOTA: In totale, i passaggi di 6 pori sono stati utilizzati nei passaggi 1.12-1.14.
  15. Centrifugare a 1000 g a 4 ° C per 10 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 μl di tampone di base.
  16. Misurare la concentrazione del DNA come sopra.
    NOTA: Circa 200 μg di DNA nucleico è stato ottenuto dal combinare entrambi gli arti posteriori da un animale. Facoltativamente, salva 20 μL per l'osservazione microscopica con la colorazione del trypan blu (concentrazione di riserva 0,4%, diluizione 1: 5); I nuclei saranno macchia blu ( Figura 1 B ).
  17. Centrifugare a 1000 g a 4 ° C per 10 minuti e scartare il surnatante. Conservare il pellet a -80 ° C.

2. Sonication

  1. Campeggiare campioni in 500 μl di buffer di lisi SDS e risospendere con pipetta gentile.
  2. Trasferire la sospensione del nucleo DNA a una fiala di vetro su ghiaccio.
  3. Eseguire la sonicazione con bruciature focalizzate di energia acustica ultrasonica da un trasduttore a forma di piatto. Vedere Tabella dei materiali per i dettagli dell'apparecchiatura. Utilizzare l'impostazione seguente: cicli per scoppio: 200; Intensità: 5; Ciclo di servizio: 20; Temperatura 4 - 6 ° C; 30 s acceso / spento.
    NOTA: Un esempio di valutazione dell'efficacia della sonicazione è mostrato in Figura 2 .
  4. Trasferire la cromatina sonica in un tubo da 1,5 ml. Centrifugare a 12.000 xg per 15 minuti e trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Trasferire 50 μl di campioni sonicati (~ 7-10 μg / campione muscolare) in un nuovo tubo da 1,5 ml per il reticolazione inverso per una notte a 65 ° C. Freeze i campioni rimanenti a -80 ° C.

3. Valutazione della Sonicazione e della Quantitazione

  1. Aggiungi 1.0ΜL di RNasi A (500 U / mL RNasi A: 20.000 U / mL RNasi T1) ai campioni sonicati salvati da 50 μL e incubare per 30 minuti a 37 ° C.
  2. Aggiungere 8 μl di proteasi K (10 mg / ml) e incubare per 30 minuti a 55 ° C.
  3. Raccogliete il DNA utilizzando un kit di estrazione del DNA.
    1. Aggiungere 5 volumi di buffer di legame, applicarlo alla colonna di rotazione e centrifugare a 4000 xg, 10 min.
    2. Applicare il pass-through sulla stessa colonna e centrifugare nuovamente.
    3. Lavare con tampone di lavaggio due volte a 13.000 xg, 1 min.
    4. Centrifugare di nuovo a 13.000 xg, 1 min per asciugare la colonna.
    5. Aggiungere 50 μl di H 2 O e centrifugare a 13.000 xg, 1 min per eluire il DNA.
    6. Applicare il pass-through sulla stessa colonna e centrifugare nuovamente.
  4. Quantificare la quantità di DNA con uno spettrofotometro (OD260 / OD280). Eseguire campioni su gel di 0,8% per valutare la dimensione e la quantità (1 μg) dei prodotti sonicati ( Figura 2 ).
    NOTA: La resa cromatica media è approssimativamente ~ 20%.

4. ChIP

  1. Sciogliere la cromatina salvata in precedenza a -80 ° C e far passare la cromatina a ~ 100-120 μg per tubo. Diluire 1:10 con il tampone di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (20mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM PMSF, 1x Cocktail inibitore della Proteasi (PIC), Na-deossossolato W / v), 1% Triton X-100).
    1. Se ci sono più campioni in ciascun gruppo, combinare uguali quantità di DNA cromatina alla quantità finale di ~ 100-120 μg / campione. Salva 10% come input.
  2. Aggiungere 40 μl (50% v / v slurry nel tampone RIPA) di agarosi proteica A / G pre-bloccata (~ 2 h, 4 ° C) o IgY (anticorpo di pollo) e incubare Un rotatore per 3 ore a 4 ° C.
  3. Centrifugare a 1000 xg, 10 minuti e trasferire con attenzione il surnatante ai nuovi tubi.
  4. Aggiungere gli anticorpi a 1 μg di anticorpi per ~25 - 100 μg di DNA cromatina.
  5. Ruotare delicatamente a 4 ° C per una notte a circa 15 giri / min.
  6. Aggiungere 10 μl di agarosi proteica A / G (~ 2 h, 4 ° C) pre-bloccata (~ 2 h, 4 ° C) o IgY perle (anticorpo di pollo) e ruotare in camera fredda per 2 ore.
  7. Lavare le perle come segue. Lavare con 1 ml di tampone RIPA per 3 min due volte, lavare con 3 ml di tampone di sale alto (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100) , Lavare con 3 ml di LiCl (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Na-deossicolato, 0,5% NP40) per 3 min due volte.
    1. Lavare con 1 ml di tampone Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) per 3 min una volta. Quindi eluire il DNA con il tampone di eluizione (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA e 0,5% SDS).
  8. Centrifugare a 1.000 g, 1 min e rimuovere accuratamente il surnatante.
  9. Riposizionare il tallone con 50 μl di tampone di eluizione.
  10. Incubare per 10Min a 65 ° C.
  11. Centrifugare a 12.000 g per 5 min.
  12. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo, aggiungere ancora 50 μl e centrifugare nuovamente a 12.000 g per 5 min. Il volume di eluizione finale sarà di 100 μL.
  13. Reverse crosslinking e DNA eluizione.
    1. Incubare la cromatina eluita per una notte a 65 ° C.
    2. Aggiungere 1,0 μL di RNasi A e incubare per 30 minuti a 37 ° C.
    3. Aggiungere 8 μl di proteasi K (10 mg / ml) e incubare per 30 minuti a 55 ° C.
    4. Raccogliere il DNA utilizzando un kit di pulizia PCR con volume di eluizione a 50 μL secondo il protocollo del produttore.
  14. Analizzare i profili di Real-time qPCR come descritto in precedenza 25 , 26 .
    NOTA: Le sequenze primer sono elencate nella Figura 3 Legenda . I dati sono presentati come media ± SEM ( Figura 3 ).

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Results

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Qui abbiamo eseguito cross-linking di formaldeide immediatamente dopo la raccolta dei tessuti per preservare l'interazione di DNA-proteine ​​in tempo reale. Tuttavia, abbiamo rilevato che il gradiente di saccarosio o colloidale, comunemente usato per l'isolamento del nucleo 23 , 24 , non era efficace nel separare i nuclei dai miofibri (dati non mostrati). La ragione può essere che la reticolazione conferisse una gravità simile pe...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo un metodo robusto dove i tessuti muscolari scheletrici reticolati sono stati utilizzati per isolare nuclei di alta qualità. La filtrazione sequenziale è stata effettuata per separare efficacemente i nuclei dai detriti e l'energia acustica ultrasonica dal trasduttore a forma di piatto ha tagliato la cromatina per l'analisi ChIP. I risultati hanno mostrato la correlazione temporale circadiana del BMAL1 ai promotori target.

ChIP può essere impiegato per catturare l'o...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Karyn Esser, Nobuya Koike e Noheon Park per consigli utili. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH / NIGMS (R01GM114424) a S.-HY e dalla Fondazione Robert A. Welch (AU-1731) e NIH / NIA (R01AG045828) a ZC

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiali
Soluzione di formaldeideSigma AldrichF8775 
GlycineFisher ScientificBP381-5
Soluzione di blu di tripano (0,4%)Fisher Scientific15250061
RNasi ASigma Aldrich10109142001
Proteasi KSigma Aldrich3115887001
Anticorpo anti-BMAL1di polloGenerato nel pollo (Cocalico Biologicals) contro l'antigene aa 318 - 579, e le IgY sono state purificate per affinità utilizzando lo stesso antigene.
Resina precipitante IgY di polloGenScriptL00405
Equipment
KINEMATICA  Polytron PT2100 Omogeneizzatore da bancoFisher Scientific08-451-178
15 mL Dounce macina tessutiWhearton357544
Falcon Cell Strainers 100 &; mFisher Scientific08-771-19
Filtri per cellule di falco 70 µ mFisher Scientific08-771-1
Filtri per cellulari di falco 40 µ mFisher Scientific08-771-2
pluriFiltro 30 µ mPluriSelect43-50030-03
pluriStrainer 20 µ mPluriSelect43-50020-03
pluriFiltro 10 µ mPluriSelect43-50010-03
Covaris S2 Ultrasuoni focalizzatiCovarisModello S2
Labquake Thermo ScientificC415110
Fotocamera per microscopio CCD  Leica MicrosystemsDFC3000
Kit di estrazione del DNAThermo ScientificK0691
Buffers
Tutti i componenti del tampone sono descritti nel protocollo. Ogni componente è stato acquistato da Sigma Aldrich
Kit di reagenti G

References

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