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Articolo metodologico

Sequestri di Electroconvulsive in ratti e frazionamento dei loro ippocampi di esaminare grippaggio-indotto cambiamenti nella densità postsinaptica proteine

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DOI:

10.3791/56016

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15 agosto 2017

 ,  , 
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

In questo articolo

Sommario

Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello sperimentale animale della terapia electroconvulsive per la depressione grave. ECS globalmente stimola l'attività nell'ippocampo, che conduce a sinaptogenesi e plasticità sinaptica. Qui, descriviamo i metodi per induzione ECS in ratti e per frazionamento subcellulare dei loro ippocampi per esaminare le modifiche grippaggio-indotto proteine sinaptiche.

Abstract

Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello animale sperimentale di terapia elettroconvulsiva, il trattamento più efficace per la depressione grave. ECS induce i grippaggi tonico-clonic generalizzati con bassa mortalità e morte neuronale ed è un modello ampiamente usato ai farmaci antiepilettici schermo. Qui, descriviamo un metodo di induzione ECS nel quale viene erogata una corrente di 55-mA breve per 0,5 s per uomo ratto 200-250 g di peso tramite elettrodi clip orecchio. Tale stimolazione bilaterale prodotto fase cloniche 4-5 che è durato circa 10 s. Dopo la cessazione dell'ECS acuta o cronica, maggior parte dei ratti ha recuperati per essere relativamente al comportamento indistinguibile da sham ratti "nessuna crisi". Perché ECS eleva a livello globale l'attività cerebrale, è stato utilizzato anche per esaminare le alterazioni di attività-dipendente di proteine sinaptiche e loro effetti sulla forza sinaptica utilizzando più metodi. In particolare, frazionamento subcellulare della densità post-sinaptica (PSD) in combinazione con Western blotting consente la determinazione quantitativa dell'abbondanza di proteine sinaptiche presso questa struttura sinaptica specializzata. In contrasto con un precedente metodo di frazionamento che richiede grandi quantità di cervello del roditore, descriviamo qui un metodo di frazionamento su piccola scala per isolare il PSD da ippocampi di un singolo ratto, senza centrifugazione in gradiente di saccarosio. Utilizzando questo metodo, mostriamo che le frazioni isolate di PSD contiene proteine di membrana postsinaptica, tra cui PSD95, GluN2B e GluA2. Presinaptici marcatore synaptophysin e proteina citoplasmatica solubile α-tubulina sono stati esclusi dalla frazione PSD, dimostrando il successo isolamento PSD. Inoltre, ECS cronica diminuita espressione di GluN2B in PSD, che indica che il nostro metodo di frazionamento PSD su piccola scala può essere applicata per rilevare i cambiamenti nelle proteine PSD hippocampal da una singolo ratto dopo trattamenti genetici, farmacologici o meccanici .

Introduzione

Terapia di Electroconvulsive è stata utilizzata per trattare pazienti con disturbi depressivi maggiori, tra cui grave depressione farmaco-resistenti, depressione bipolare, malattie di Parkinson e schizofrenia1,2. In questa terapia, il sequestro viene generato da stimolo elettrico consegnato alla testa dei pazienti anestetizzati via epicranica elettrodi1,2,3. Ripetitivo di ECS è stato clinicamente utile per i disturbi depressivi resistenti alla droga1,2,3. Tuttavia, l'esatto meccanismo alla base dell'efficacia a lungo termine dell'effetto antidepressivo in esseri umani è rimanere evasivo. ECS è un modello animale della terapia electroconvulsive ed è ampiamente utilizzato per studiare il meccanismo terapeutico. Nei roditori, ECS acuta sia cronico trattamento ECS promuovere neurogenesi adulta negli ippocampi e riorganizzare la rete neurale4,5, che rischia di contribuire al miglioramento della flessibilità cognitiva. Inoltre, global elevazione dell'attività cerebrale di ECS altera l'abbondanza delle trascrizioni, come un cervello derivato fattore neurotropo6e più proteine, tra cui metabotropici del glutammato recettore 17 e la N-metil-D-aspartato (NMDA) tipo glutammato recettore subunità7. Questi cambiamenti sono coinvolte nel mediare la modifica a lungo termine del numero di sinapsi, la struttura e la forza in ippocampo7,8,9.

Nei modelli ECS, stimolazione elettrica viene consegnata ai roditori tramite elettrodi impiantati stereotassicamente, elettrodi corneali o elettrodi auricolari per evocare i grippaggi tonico-clonic generalizzati10,11. Stereotassica impianto di elettrodi comporta un'operazione al cervello e richiede tempi significativi per migliorare le abilità chirurgica dello sperimentatore per minimizzare il danno. Meno invasivi elettrodi corneali potrebbero causare secchezza e abrasione corneale e richiede anestesia. L'uso di elettrodi clip orecchio ignora queste limitazioni perché può essere utilizzati su roditori senza chirurgia o anestesia e causare lesioni minime. Infatti, abbiamo trovato che corrente consegnati a sveglio ratti tramite clip orecchio elettrodi attendibilmente induce grippaggi tonico-clonic fase 4-5 e altera le proteine sinaptiche nel loro ippocampi10.

Per esaminare l'ECS indotte abbondanza di proteine sinaptiche nelle regioni specifiche del cervello dei roditori, è importante scegliere i metodi sperimentali che sono più adatti per la loro rilevazione e quantificazione. Frazionamento subcellulare del cervello consente l'isolamento grezza delle proteine citosoliche solubili; proteine di membrana; proteine dell'organello-limiti; e anche proteine in speciali strutture subcellulari, come ad esempio le PSD12,13,14. Il PSD è un dominio subcellulare denso e ben organizzato in neuroni in cui proteine sinaptiche sono altamente concentrati e vicino la membrana postsinaptica12,13,15. L'isolamento del PSD è utile per lo studio di proteine sinaptiche, arricchito il PSD, dal cambiamenti dinamici nell'abbondanza e nella funzione dei recettori postsinaptici del glutammato, ponteggi proteine e proteine di transduction del segnale nel PSD12 , 15 , 16 , 17 sono correlati con plasticità sinaptica e la synaptopathy osservata in diversi disturbi neurologici17,18. Un precedente metodo di frazionamento subcellulare utilizzato per purificare il PSD ha coinvolto l'isolamento della frazione detersivo-insolubili dalla frazione grezza della membrana del cervello tramite la centrifugazione differenziale di saccarosio gradienti14, 19. la grande sfida con questo metodo tradizionale è che richiede grandi quantità di roditore cervelli14,19. Preparazione dei roditori di 10-20 per isolare la frazione PSD per ogni trattamento richiede costi vasto e investimento di tempo e non è praticamente fattibile se ci sono molti trattamenti.

Per superare questa sfida, abbiamo adattato un metodo più semplice che direttamente consente di isolare la frazione PSD, senza saccarosio mediante centrifugazione in gradiente20,21e rivisto per essere applicabile all'isolamento PSD da ippocampi di un singolo ratto cervello. Il nostro metodo di frazionamento PSD su piccola scala produce circa 30-50 µ g di proteine PSD da 2 ippocampi, sufficiente per l'impiego in diversi saggi biochimici, tra cui immunoprecipitazione e Western blotting. Macchiarsi occidentale dimostra il successo del nostro metodo per isolare il PSD rivelando l'arricchimento della proteina di densità postsinaptica 95 (PSD-95) e l'esclusione di marcatore presinaptici synaptophysin e proteina citoplasmatica solubile α-tubulina. Nostra induzione ECS e metodi di frazionamento PSD su piccola scala sono facilmente adattabili ad altre regioni del cervello del roditore e consentono di valutare gli effetti di ECS sull'espressione di proteine PSD in modo relativamente semplice e affidabile.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali tra cui animali soggetti sono state approvate dal comitato di utilizzo presso la University of Illinois a Urbana-Champaign e istituzionali animali cura.

1. mantenere una colonia di ratto

  1. Allevare ratti Sprague-Dawley (Vedi la Tabella materiali) e mantenerli in condizioni standard con un ciclo luce-buio 12 h e ad libitum accesso a cibo e acqua.
  2. Svezzare i cuccioli di ratto al giorno postnatale (P) 28 e ospitarli in gruppi di 2-4 littermates maschio o femmina.
  3. Contrassegnare le code dei ratti maschii con un pennarello nero permanente non tossico per l'identificazione.
  4. Pesare i ratti maschii 3 volte a settimana e registrare il loro bodyweights.

2. preparazione di una macchina ECS

  1. Alle 7:30, disinfettare la panchina nella stanza di preparazione degli animali e posizionare una macchina ECS (Generatore di impulsi) sul banco.
  2. Posto un ratto maschio singolo peso di 200-250 g in una gabbia pulita, vuota con un coperchio. Ripetere l'operazione per tutti i ratti maschii di essere trattati con induzione ECS. Lasciate che i ratti habituate per 30 min.
  3. Mentre i ratti sono habituating nelle loro gabbie, impostare un generatore di impulsi per induzione ECS alla frequenza di 100 impulsi/s, una larghezza di impulso di 0,5 ms, una durata di scossa di 0,5 s e una corrente di 55 mA (Figura 1A).
  4. Preparare il generatore di impulsi spingendo il pulsante di "RESET" e assicurando che il pulsante "Pronto" è acceso. Assicurarsi che le clip orecchio non sono collegate ad un generatore di impulsi e quindi premere il pulsante di "SHOCK" per pochi secondi.
    Nota: A questo punto, il generatore di impulsi è pronto / a per induzione ECS.
  5. Collegare la clip orecchio il generatore di impulsi.

3. induzione di ECS acuta

Nota: Vedere Figura 1B, pannello superiore.

  1. Bagnare le clip orecchio con soluzione salina sterile e garantire che sono saturi.
  2. Bagnare le orecchie di un topo con soluzione salina sterile inserendole in una garza imbevuta di soluzione fisiologica. Una volta che sono bagnati, rimuovere la garza.
  3. Allegare una clip per orecchio, posizione oltre la band principale della cartilagine.
  4. Confermare sulla macchina ECS che è stabilito un vero ciclo; in caso contrario, verrà visualizzato un messaggio di errore o una lettura di "1" sulla macchina.
  5. Indossare un guanto di spesso, non-metallo. Mentre si tiene il ratto delicatamente in una mano guantata, premere il pulsante "SHOCK" per pochi secondi e rilasciare lentamente la presa sul ratto per osservare il sequestro. Per la farsa "nessuna crisi" (NS) controllare, gestire in modo identico il ratto ma non fornire la corrente.
  6. Scollegare le clip orecchio come clono comincia e registrare il comportamento di sequestro secondo una rivista di Racine scala22 che include "movimenti della bocca e del viso" (fase 1), "testa annuendo" (fase 2), "clono forelimb" (fase 3), "allevamento con il clonus arto anteriore" (fase 4) e "allevamento e cade con il clonus forelimb" (fase 5). Il sequestro dovrebbe durare circa 10 s; registrare la durata di sequestro utilizzando un timer.
  7. A seguito del termine grippaggio, tornare ratto alla sua gabbia a casa. Monitorare il ratto per un altro 5 minuti per assicurarsi che il recupero del ratto dai grippaggi. Keep it singolarmente ospitato nella gabbia e restituire la gabbia nella stanza di recupero.
  8. Ripetere l'induzione ECS su ratto successivo.
  9. Monitorare i ratti per tutto il resto della giornata e almeno una volta al mattino e una volta nel pomeriggio il giorno seguente fino a quando essi sono euthanized per esperimenti.
    Nota: Il metodo di induzione ECS potrebbe portare a segni clinici come effetto secondario incidentale, che richiede attenzione. Ad esempio, il protocollo di induzione ECS potrebbe indurre i grippaggi che durano più a lungo 15 s e causa inutili sofferenze ai ratti. In questo caso, terminare il sequestro usando diazepam (10 mg/kg, i.p.) o pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Se i topi sviluppano afflizione respiratoria o gravi anomalie comportamentali dopo la cessazione del sequestro, li eutanasia per inalazione di anidride carbonica seguita dalla decapitazione.

4. induzione di ECS cronica

Nota: Vedere la Figura 1B, pannello inferiore.

  1. Indurre un ECS al giorno allo stesso tempo la mattina come descritto nei passaggi 1-3, in precedenza, per sette giorni consecutivi.
  2. Monitor i ratti due volte al giorno dopo sono rientrato a casa loro gabbie.

5. omogeneizzazione e frazionamento di ratto ippocampi

Nota: Vedere la Figura 2.

  1. Preparare un tampone fresco omogeneizzazione (soluzione A) che contiene saccarosio di 320 mM, pirofosfato di sodio di 5 mM, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 200 acido okadaico nM e inibitori della proteasi. Filtro-sterilizzare il buffer utilizzando filtri con un diametro dei pori 0,22 µm per filtrazione sotto vuoto e posizionarlo sul ghiaccio.
  2. In un dato momento punto seguito ECS acuta o cronica ECS (Figura 1), eutanasia ratto per CO2 inalazione per 5-10 min, seguita dalla decapitazione usando una ghigliottina.
  3. Rimuovere il cervello e sezionare ippocampi sulla placca di metallo posizionato su ghiaccio, come descritto in precedenza23,24.
  4. Posizionare due ippocampi da un ratto su una cultura di tessuto 30 mm piatto e tritateli in piccoli pezzi con le forbici.
  5. Trasferimento ippocampi macinati a un omogeneizzatore manuale vetro utilizzando una pipetta da 1 mL e aggiungere 1 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciata (soluzione A, punto 5.1). Inserire un pestello rotondo in un omogeneizzatore di vetro. Mentre l'omogeneizzatore di vetro è il ghiaccio, delicatamente e costantemente corsa su e giù il pestello 10 - 15 volte per 1 min, in fino a piccoli pezzi di tessuto ippocampale scompaiono.
  6. Trasferire l'omogeneizzato a un tubo del microcentrifuge 1,7 mL utilizzando una pipetta 1 mL e centrifugare l'omogeneizzato a 800 x g per 10 min a 4 ° C per separare il surnatante postnuclear (frazione di S1) dal pellet contenente tessuto insolubile e nuclei (frazione di P1). Trasferire 50 µ l e 950 µ l della frazione S1 a due per microcentrifuga separata, nuovo 1,7 mL utilizzando una pipetta da 1 mL e memorizzare questi tubi su ghiaccio. Salvare il pellet di frazione P1 sul ghiaccio.
  7. Centrifugare la frazione di S1 (950 µ l) per 10 min a 13.800 x g e a 4 ° C per separare il surnatante (S2 frazione), arricchito con proteine citosoliche solubili, e il pellet (frazione di P2), arricchita con proteine di membrana-limita, tra cui proteine sinaptosomiali. Trasferire la frazione S2 a una nuova 1,7 mL microcentrifuga utilizzando una pipetta 1 mL e memorizzarlo sul ghiaccio.
  8. Risospendere il pellet (frazione di P2) in 498 µ l di acqua purificata ghiacciata usando una pipetta 1 mL. Aggiungere 2 µ l di 1 M HEPES (pH 7.4) usando una pipetta di 20 µ l per ottenere una concentrazione finale di 4 mM HEPES (pH 7.4). Incubare a 4 ° C con agitazione per 30 min. Store la frazione di P2 sedimento sul ghiaccio.
  9. Determinare la concentrazione di proteina delle frazioni S1, S2 e P2 usando un'analisi BCA. Aggiungere 50 mM HEPES (pH 7.4) per ogni frazione di raggiungere una concentrazione di 1 mg/mL e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo, o la frazione di P2 per isolare il PSD di processo.

6. isolamento del PSD da frazione di proteina (P2) della membrana grezzo

  1. Centrifugare la frazione di P2 (500 µ l) per 20 min a 25.000 x g e a 4 ° C per separare il surnatante lisato (frazione di LS2) e il pellet lisato (LP1 frazione). La frazione di LS2 di trasferimento ad un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL utilizzando una pipetta da 1 mL e memorizzarlo sul ghiaccio.
  2. Risospendere il pellet LP1 in 250 µ l di 50 mM HEPES (pH 7.4) mescolato con 250 µ l di 1% detergente in 1x tampone PBS utilizzando una pipetta da 1 mL. Incubare a 4 ° C con agitazione delicata per 15 min.
  3. Centrifugare il sedimento risospeso LP1 per 3 h a 25.000 x g e a 4 ° C per separare il surnatante (frazione non-PSD) dal pellet (frazione di PSD). Rimuovere il surnatante di un tubo del microcentrifuge 1,7 mL e risospendere il pellet PSD in 100 µ l di 50 mM HEPES (pH 7.4) usando una pipetta 200 µ l.
  4. Determinare la concentrazione nella proteina della LS2, non-PSD e frazioni PSD usando un'analisi BCA. Aggiungere 50 mM HEPES (pH 7.4) per ogni frazione di raggiungere una concentrazione di 1 mg/mL e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Tutte le soluzioni utilizzate nei passaggi 5-6 (cioè, soluzione A, tampone HEPES e tampone PBS) dovrebbero essere fatta con acqua purificata privo di particelle e contaminanti ionici e organici.

7. Western Blotting

  1. Sciolga ogni frazione proteica su ghiaccio. Trasferire 12 µ l di ogni frazione (S2, P2 e PSD a 1 mg/mL) ad un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL utilizzando una pipetta 20-µ l.
  2. 3 µ l di tampone di campione 5 x SDS e incubare a 75 ° C per 30 min in un bagno d'acqua. Raffreddare il campione a temperatura ambiente (RT).
  3. Caricare 10 µ l del campione della proteina in ciascun pozzetto della sfumatura 15-pozzo pettine di 4-20% gel di SDS-poliacrilammide gel di elettroforesi (SDS-PAGE) usando una pipetta di 20 µ l. Esegua il gel nell'apparato di SDS-PAGE e a 80-100 V in tampone di corsa (25 mM Tris, glicina 190 mM e 0,1% SDS; pH 8.3).
    Nota: Ogni gel dovrebbe contenere campioni proteici da ECS ratti in diversi momenti dopo ECS acuta o cronica e NS.
  4. Trasferimento delle proteine da SDS-PAGE gel in una membrana difluoruro di polivinile (PVDF) nell'apparato di trasferimento a 25-30 V (60 mA) per 9-12 h in tampone di trasferimento (25 mM Tris, glicina 190 mM e 20% metanolo; pH 8.3).
  5. Rimuovere la membrana PVDF dall'apparato di trasferimento e lavarlo in soluzione fisiologica tamponata (TBS) per 5 min in un rotatore multiuso a TA.
  6. Bloccare la membrana nel latte del 5% e 0.1% Tween-20 in TBS per 1 h. Incubare in anticorpi primari (tabella 1) in tampone di lavaggio (latte 1% e 0.1% Tween-20 in TBS) sull'agitatore multiuso a 4 ° C durante la notte (Vedi la Tabella materiali per diluizioni).
  7. Lavare la membrana 4 volte per 10 minuti ciascuno, nel tampone di lavaggio e quindi viene quindi incubato con perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpi secondari in buffer per 1h di lavaggio in un rotatore multiuso a TA.
  8. Lavare la membrana 4 volte per 10 minuti ciascuno, nel tampone di lavaggio e poi con TBS per 5 min.
  9. Incubare la membrana con substrato di chemifluorescence avanzata per 1 min ed esporlo alla pellicola di raggi x. Sviluppare la pellicola esposta con un processore di pellicola.

8. quantificazione dei Western blot

  1. Scansione il Western blot come file TIFF e salvare questo file sul computer.
  2. Aprire il file di Western blot nel programma ImageJ come un'immagine in scala di grigi, sotto "File", "Apri immagine" freccia destra "scala di grigi".
  3. Scegliere lo strumento di selezione rettangolare dalla barra ImageJ e disegnare un rettangolo che copre una banda singola macchia occidentale di una proteina di interesse.
  4. Sotto "Analizza," colpire "Misura" per ottenere la zona e la densità media di una banda selezionata.
  5. Spostare il rettangolo in un'area di sfondo senza cambiare la sua forma e dimensione. Ripetere il passaggio 8,4 per la zona e la densità media di uno sfondo.
  6. Sottrarre il valore di densità media di una banda di sfondo da quello di una banda di Western blot, dà la densità di sfondo-sottratto banda della proteina di interesse.
  7. Ripetere i passaggi 8.2-8.6 per tutte le bande di Western blot di interesse.
  8. Dividere la densità di sfondo-sottratto banda della proteina di interesse per la densità di banda sottratto a sfondo di un prodotto del gene le pulizie, come α-tubulina; Questo passaggio produce il valore normalizzato della proteina di interesse.

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Risultati

Utilizzando la procedura dettagliata presentato qui, una scossa elettrica (55 mA, 100 impulsi/s per 0,5 s) consegnati tramite clip orecchio elettrodi indotti non ricorrenti fase 4-5 grippaggi tonico-clonic in ratti (Figura 1A-B). Un totale 8 di ratti ha ricevuto induzione ECS acuta e visualizzato grippaggi tonico-clonic fase 4-5. I grippaggi è durato circa 10 s e tutti i ratti hanno recuperati entro 1-2 min di cessazione di sequestro. Ratti s...

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Discussione

Qui, descriviamo un metodo di induzione ECS in ratti che suscita la stimolazione globale dell'attività neuronale in loro ippocampi. ECS è un modello animale di elettroshockterapia, che è clinicamente utilizzato per trattare disturbi depressivi refrattario droga in esseri umani1,2,3. Nonostante l'uso della terapia di electroconvulsive per trattare la depressione severa, il preciso meccanismo di fondo rimane poco chiaro. Perché EC...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Eric C. Bolton per averci permesso di utilizzare la centrifuga per frazionamento e Dr. Graham H. Diering nel laboratorio del Dr. Richard L. Huganir di John Hopkins University per averci fornito il protocollo su piccola scala per il frazionamento di PSD.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Spargue-Dawley ratCharles River LaboratoriesECS fornisce
un generatore di impulsiUgo Bsile, Comerio, Italia57800ECS fornisce
sistema di purificazione dell'acqua MilliQEMD Z00Q0VWW MilliporeForniture per il frazionamento subcellulare
SucroseEm scienceSX 1075-3Forniture
per il frazionamento subcellulareNa4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Forniture per frazionamento subcellulare
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)SIGMA-ALDRICHE9884Forniture per frazionamento subcellulare
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Forniture per frazionamento subcellulare
Acido okadaicoTOCRIS1136Alimentatori di frazionamento subcellulare
ThermoScientific78429Forniture per frazionamento subcellulare
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Forniture per frazionamento subcellulare
EMD Millipore Sterito Filtri sterili per bottiglieScientificSCGPS05REForniture per frazionamento subcellulare
Forbici per irideWPI (World Precision Strumenti)500216-Gfrazionamento subcellulare fornisce
piatto di coltura tissutale da 30 mmFisher Scientific08-772BFornisce un
omogeneizzatore di vetro e un pestello in teflonVWR89026-384frazionamento subcellulare fornisce
una provetta per microcentrifuga da 1,7 mLDENVILLE SCIENTIFIC INC.C2170 (1001002)Alimenta il frazionamento subcellulare
Centrifuga Sorvall Legend XT/XF Thermo Fisher75004521Forniture per il frazionamento subcellulare
Reagente A per il dosaggio delle proteine Pierce BCA, 500 mLThermo Fisher#23228Forniture per Western blot
Pierce BCA Reagente B per il dosaggio delle proteine, 25 mLThermo Fisher#1859078Western blot fornisce
gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE)BIO-RAD#4561086SForniture per Western blot
In esecuzione TamponeProdotto in laboratorioForniture Western blot.
Cella di elettroforesi verticale Tetra Mini-PROTEAN per gel MiniPrecast, 4 gelBIO-RAD# 1658004Western blot fornisce
una membrana in difluoruro di polivinile (PVDF) MiliporeIPVH00010Western blot fornisce
Trasferimento BufferProdotto in laboratorioWestern blot forniture.
Tris-baseFisher ScientificBP152-1Western blot fornisce
GlycineFisher ScientificBP381-5Western blot fornisce
Sodio dodecil solfatoSIGMA-ALDRICH436143Western blot fornisce
Metanolo Fisher ScientificA454-4Western blot fornisce
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergente per isolamento PSD
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD# 1703935Western blot fornisce
latte secco istantaneo scrematodi grande valoreWestern blot fornisce
rotatore multiuso.Thermo ScientificModel-2314Western blot fornisce
Hyblot CL Autoradiografia FilmDENVILLE SCIENTIFIC INC.E3018 (1001365)Western blot fornisce
un substrato di chemifluorescenza migliorato Thermo Scientific32106Western blot fornisce
un processore di pellicole Konica SRX-101AKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot fornisce
Nome dell'anticorpo
PSD-95Segnalazione cellulare#2507Diluizione dell'anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 ° C, Specie ospite = Segnalazione
sinaptofisinaconiglio#4329Diluizione dell'anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 ° C, Specie ospite =
Alfa-TubulinaSantacruzSC-5286Diluizione dell'anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 ° C, Specie ospite = Topo
GluN2BNeuromab75-097Diluizione dell'anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 ° C, Specie ospite = Topo
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295Diluizione dell'anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 ° C, Specie ospite = Rabbit
STEPSantacruzSC-23892Diluizione dell'anticorpo = 1:200 - 500, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 ° C, Specie ospite =
Peroxidas Affini di topoIgG anti-topo dell'asino puro (H+L)Laboratorio di ricerca immunoscientifica Jackson715-035-150Diluizione degli anticorpi = 1:2.000-5.000, tempo = 1 ora, Temperatura di reazione = RT, Specie ospite = Perossida d'asino
AffiniIgG anti-coniglio dell'asino puro (H+L)Laboratorio di ricerca immunologica Jackson711-035-152Diluizione degli anticorpi = 1:2.000-5.000, tempo = 1 ora, Temperatura di reazione = RT, Specie ospite = Asino
il Fisher Il un Il il un cellulare di di coniglio

Riferimenti

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