Abbiamo descritto un protocollo per l'esecuzione di epatectomia parziale (PHx) e trapianto di cellule via della milza nel cenno del capo. SCID (CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/j) topi. In questo protocollo, un'incisione è fatta per esporre e resecare il lobo sinistro del fegato seguito da un'altra incisione per il trapianto di cellule intrasplenic.
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Articolo metodologico
Intrasplenic trapianto di epatociti dopo epatectomia parziale in NOD. Topi SCID
In questo articolo
Sommario
Abstract
Hepatectomy parziale è un metodo versatile e riproducibile per studiare la rigenerazione del fegato e l'effetto di terapeutica delle cellule basata in varie circostanze patologiche. Epatectomia parziale facilita anche la maggiore attecchimento e la proliferazione delle cellule trapiantate da neovascolarizzazione accelerante e migrazione delle cellule verso il fegato. Qui, descriviamo un semplice protocollo per eseguire 30% hepatectomy e trapianto di cellule nella milza di un diabetico non obeso/grave combinata NOD immunodeficienti. SCID (CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/j) mouse.
In questa procedura, due piccole incisioni sono fatte. La prima incisione è quello di esporre e resecare il lobo sinistro del fegato, e un'altra piccola incisione è fatta per esporre la milza per il trapianto di cellule intrasplenic. Questa procedura non richiede alcuna abilità chirurgiche specializzate, e può essere completato in 5-7 minuti con meno stress e dolore, recupero più veloce e migliore sopravvivenza. Abbiamo dimostrato il trapianto di epatociti isolati da una proteina fluorescente verde (GFP) esprimendo mouse (transgenici C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), come pure dell'epatocita come cellule di origine umana (NeoHep) in parzialmente epatectomizzati NOD. Topi SCID.
Introduzione
Attualmente, il trapianto dell'epatocita è proposto come alternativa al trapianto d'organo intero per trattare i pazienti con gravi disturbi del fegato. Si ritiene che esso possa colmare pazienti per trapianto di organo intero1. Oltre il trapianto allogenico epatociti2, epatociti xenogenica3 ed epatociti derivati da cellule staminali4 sono anche indagati in modelli animali. In questo contesto, l'homing e attecchimento potenziale delle cellule trapiantate nel destinatario è un criterio importante per la terapia cellulare basata nell'insufficienza epatica acuta (AHF).
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Protocollo
Le procedure presentate in questo protocollo sono state approvate dal comitato di etica animale istituzionale dell'Istituto nazionale di immunologia, Nuova Delhi. Il numero di riferimento seriale dell'approvazione è IAEC n. 319/13.
Nota: Ci sono ottime risorse su procedure di chirurgia generale20 e protocolli specifici per la chirurgia del roditore21. Per quelli che fanno chirurgia animale per la prima volta, è consigliabile per ampiamente pratica procedure chirurgiche su manichini prima di operare sugli animali.
1. preparazione
- Prima dell'esperim....
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Risultati
Proliferazione degli epatociti dopo hepatectomy parziale del 30%: La proliferazione degli epatociti nei rimanenti del fegato dopo epatectomia 30% è stata esaminata secondo immunoistochimica (IHC) per un indicatore di proliferazione delle cellule, Ki-67. Un giorno post epatectomia, i topi sono stati sacrificati, i lobi del fegato restanti sono stati asportati e sezioni della paraffina sono state ottenute. Le sezioni sono state macchiate con anticorpo Ki-67, seguita da etichettatura con anticorpo secondari.......
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Discussione
Hepatectomy parziale è una tecnica consolidata per inquirenti rigenerazione del fegato e hepatectomy eccessivo è segnalato per imitare il modello AHF. Tra modelli animali di AHF, roditori, soprattutto topi, sono il modello più ricercato. Per ottenere un modello di disturbo al fegato in topi, fino a un hepatectomy di 70% è stato segnalato con una buona sopravvivenza tasso25,26. Tuttavia in altri mouse immunodeficiente e nudo, un hepatectomy di 70% è stato segnalat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla concessione core ricevuta dal dipartimento di biotecnologia, governo dell'India per l'Istituto nazionale di immunologia, Nuova Delhi. Indirizzo attuale di Dr. Bhattacharjee è divisione di gastroenterologia, Epatologia e nutrizione, Ospedale Los Angeles dei bambini.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema di Anestesia Gas | Ugo Basile; Italia | 211000 | |
| Pesatrice | Goldtech ; India | Appalti locali | |
| Cabina di sicurezza biologica (Classe I) | Kartos international; India | Locale | |
| Rifornimento Capelli Trimmer | Panasonic ; Giappone | ER-GY10 | |
| Forbice operativa diritta con lame affilate/affilate | Major Surgicals; Pinze | l'approvvigionamento locale | |
| con dentellature | Major Surgicals; Acquisti locali in India | ||
| Micro portaaghi dritti e curvi | Mercian ; Inghilterra | BS-13-8 | |
| Siringa da insulina da 1 ml con aghi da 30G *5/16 | Dispo Van; India | ||
| Siringa da 1 ml con 26 G * 1/2 ago | BD ; NOI | REF 303060 | |
| Fili di nylon | potente; India | (1-0) Approvvigionamento locale | |
| MERSUTURES 4-0 Sutura chirurgica sterilizzata con ago | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 sutura chirurgica assorbibile | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sutura chirurgica agugliata sterilizzata Catgut Cotton Buds cromico |
| Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Approvvigionamento locale | ||
| nastro chirurgico | 3M India ; India | 1530-1 | Microtomo a nastro chirurgico per micropori |
| Histo-Line Laboratories, Italia | MRS3500 | ||
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; Microscopio | ||
| Carl Zeiss ; Germania | LSM 510 META | ||
| Microscopio a campo chiaro | Olympus, Giappone | LX51 | |
| Analizzatore automatico | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Analizzatore biochimico per test funzionale epatico |
| Citometro a flusso | BD ; NOI | BD FACSverse | Valutazione della presenza di cellule dopo il trapianto |
| Crema depilatoria Veet | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; Isoflurano USA | USP 99,9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxima iniezione di sodio | |
| Soluzione di iodio povidone | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldeide | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Saccarosio | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T composto |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-albumina capra policlonale | Thermo Scientific, Pierce, Stati Uniti | PA126081 | |
| anti-connessina 32/GJB1 abcam policlonale | , Regno Unito | ab64609-500 | |
| antiGFP coniglio policlonale... | biotecnologie di Santa Cruz; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 asino anti-capra | Sonde Molecolari , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 asino anti-pecora | Sonde Molecolari , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 pollo anti coniglio | Sonde Molecolari , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Capra anti coniglio IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; NOI | 65-6120 | |
| anticorpo anti-Ki67 | abcam, UK | ab15580 | |
| Soluzione di smascheramento dell'antigene, Laboratori vettoriali a base di acido citrico | , US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific; US | P36966 | |
| KIT SGOT (ASAT) | Sistema clinico Coral, India | ||
| KIT SGPT (ALAT) | Sistema clinico Coral, Kit India | ||
| Fosfatasi alcalina (DEA) | Sistema clinico Coral, Soluzione di | ||
| di Mayer | ; US | MHS16 | |
| Eosin Y soluzione, Sigma alcolico | ; Montaggio DPX HT110132 | ||
| sigma; US | 6522 | ||
| Melonex (antidolorifico) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam iniezione | |
| sistema di substrato liquido potenziato DAB tetracloridrato | Sigma ; Stati Uniti | D3939 |
Riferimenti
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and f....
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Ristampe e permessi
