Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

Sommario

Geni essenziali per la sopravvivenza pongono ostacoli tecnici per la creazione di linee mutanti. Rincorsa aggira la letalità combinando genoma editing con trapianto di cellule germinali primordiali per creare animali portatori di mutazioni di germline. Rincorsa consente anche la generazione efficiente di omozigoti mutanti nella generazione₁ F. Qui, il passo di trapianto è dimostrato.

Abstract

La creazione di linee mutanti di editing genomico sta accelerando l'analisi genetica in molti organismi. Metodi CRISPR/Cas9 sono stati adattati per uso in Rana artigliata africana, Xenopus, un organismo di modello di vecchia data per la ricerca biomedica. Sistemi di allevamento tradizionali per la creazione di linee mutanti omozigoti con mutagenesi CRISPR/Cas9-mirate hanno diversi passaggi che richiede tempo e laboriosi. Per facilitare la creazione di embrioni mutanti, in particolare per superare gli ostacoli associati buttando giù geni che sono essenziali per l'embriogenesi, è stato sviluppato un nuovo metodo chiamato rincorsa. Questa tecnica sfrutta la robustezza degli embrioni di Xenopus di "taglia e incolla" Metodi embriologiche. Rincorsa utilizza il trasferimento di cellule primordiali germinali (PGC) da embrioni donati mutagenizzato efficientemente in fratelli germani PGC-ablazione wildtype. Questo metodo permette l'efficiente mutazione di geni essenziali creando animali chimerici con cellule somatiche wildtype che trasportano una mutante di germline. Quando due animali di₀ F che trasportano "leapfrog trapianti" (cioè, mutante cellule germinali) sono incrociate, producono composti o omozigoti, eterozigoti, null F₁ embrioni, risparmiando così un tempo di generazione completo per ottenere dati fenotipici. Rincorsa fornisce anche un nuovo approccio per l'analisi dei geni di effetto materno, che sono refrattari ad analisi fenotipica di F₀ dopo mutagenesi CRISPR/Cas9. Questo manoscritto descrive in dettaglio il metodo di rincorsa, con speciale enfasi su come effettuare con successo il trapianto di PGC.

Introduzione

Come genotipo Codifichi il fenotipo è stata una domanda importante nella biologia dato che la riscoperta delle leggi di Mendel. Una comprensione dei ruoli dei geni, la loro regolazione e interazioni all'interno di reti geniche e le funzioni delle promesse di prodotti codificati per fornire strumenti per scoprire nuova biologia e miglioramento degli Stati di malattia. Per oltre mezzo secolo¹, la Rana artigliata africana, Xenopus, è stato un modello di punta per gli studi su una vasta gamma di argomenti in biologia di base e la biomedicina, compreso il controllo genetico dello sviluppo. Storicamente, la maggior parte della ricerca su

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso dell'Università di California, Irvine e istituzionali Animal Care.

1. preparati per il trapianto di PGC

1. Preparare strumenti di dissezione in anticipo, come descritto in precedenza²³.
   Nota: Coltelli capelli sopracciglio vengono utilizzati per fare delle incisioni con l'assistenza di un ciclo di capelli per stabilizzare l'embrione durante gli interventi chirurgici. Peli delle sopracciglia e capelli cicli sono incollati in pipette Pasteur in vetro borosilicato che prima sono stati disegnati in una fiamma e rotti sulla parte assottigliata ....

Risultati

A seguito di trapianto, la determinazione qualitativa dell'efficacia di mutagenesi CRISPR/Cas9 deve essere eseguita prima di spendere lo sforzo in zootecnia per crescere e mantenere gli animali alla maturità sessuale. Poiché gli animali che trasportano leapfrog trapianti sono somaticamente wildtype e germinale è di difficile accesso per misure dirette, salvando le carcasse degli embrioni donati diventa importante. L'analisi del DNA dalle carcasse funge da proxy per il limite di mutagenesi.......

Discussione

Questo rapporto fornisce un protocollo dettagliato per il trapianto del tessuto vegetale contenente PGC. trapianto di PGC viene utilizzato in combinazione con tecnologie di editing genomico (ad es., CRISPR/Cas9) per modificare la linea germinale di un animale mentre mantenendo quasi tutti i suoi tessuti somatici come geneticamente wild-type. Per la rincorsa per avere successo, ci sono un numero di fattori critici da considerare prima di eseguire trapianti performanti.

Per garantire la.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dumont #5 pinze	Fine Science Tools	11252-20 o 11252-30
		per capelli per sopracciglia	Fatto in casa
Anello			Pipette Pasteur fatte in casa
, vetro borosilicato	Fisher Scientific	13-678-20A
Krazy Glue (a base di cianoacrilato)	Elmer's Products, Inc.	KG581	Per fissare i peli delle sopracciglia e gli anelli dei capelli nelle pipette Pasteur, è possibile utilizzare altre colle simili.
Oligodeossinucleotidi,	tecnologie di DNA integrate	su misura	Oligo modello ordinati su misura per la sintesi di sgRNA, vedi Nakayama et al., 2014 per i dettagli sulla progettazione.
Kit Megascript T7	Ambion/ThermoFisher	AM1334	Oppure usa il kit Megashortscript T7 (AM1354)
Fenolo, Tris tamponato	Fenolo distillato
Cloroformio Cloroformio			di alta qualità da qualsiasi fornitore commerciale
Etanolo			di alta qualità da qualsiasi fornitore commerciale
Dietilpirocarbonato (DEPC)	Sigma Chemical Co.	Proteina Cas9 D5758-50ML
con segnale di localizzazione nucleare	PNA Bio, Inc.	CP01	Ricostituito utilizzando acqua trattata con DEPC secondo le raccomandazioni del produttore
10X Marc's Modified Ringers soluzione			Homemade. La ricetta (rif. 26) per 1X MMR (privo di EDTA) è 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. La soluzione è regolata a pH 7,4.
Agarosio			Qualsiasi grado di biologia molecolare L'agarosio è sufficiente
Piastre di Petri da 60 X15 mm	Falcon	351007
Piastre a 24 pozzetti	Falcon	3047
L-Cysteine	Sigma Chemical Co.	C7352-100G	Base libera, non sale HCl
Proteinasi K	Roche	03 115 828 001	Tipicamente ~20mg/ml da Roche
sera Micron	sera		Tadpole food. Risospendere nel terreno di crescita. Può essere acquistato da una varietà di rivenditori online

Coltello per capelli ordinate di alta qualità da qualsiasi fornitore commerciale,