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Articolo metodologico

Nanotubi di DNA come un Versatile strumento per lo studio di polimeri semiflessibili

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DOI:

10.3791/56056

25 ottobre 2017

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Polimeri semiflessibili visualizzano proprietà meccaniche uniche che sono ampiamente applicato da sistemi viventi. Tuttavia, gli studi sistematici sui biopolimeri sono limitati poiché proprietà quali la rigidità del polimero sono inaccessibili. Questo manoscritto descrive come questa limitazione è aggirata mediante nanotubi di DNA programmabili, permettendo studi sperimentali sull'impatto della rigidità del filamento.

Abstract

Proprietà meccaniche del complessa, a base di polimeri materia soffice, come cellule o reti di biopolimero, può essere inteso in né la cornice classica di polimeri flessibili né di barre rigide. Filamenti sottostante rimangono tese a causa della loro rigidità non vanishing di spina dorsale, che è quantificato tramite la lunghezza di persistenza (lp), ma sono anche soggetti a forti fluttuazioni termiche. Loro rigidità alla flessione finiti conduce delle reti di massa, permettendo la formazione di ponteggi stabile alle frazioni di volume basso fornendo al contempo maglie di grandi dimensioni meccaniche collettivo unico, non banale. Questo principio di fondo è prevalente in natura (ad esempio, in cellule o tessuti), riducendo al minimo l'alto contenuto molecolare e facilitando in tal modo diffusivo o trasporto attivo. Grazie alla loro implicazioni biologiche e potenziali applicazioni tecnologiche in idrogel biocompatibile, polimeri semiflessibili sono state oggetto Studio considerevole. Tuttavia, le indagini comprensibile è rimasto impegnative poiché hanno contato su polimeri naturali, quali i filamenti dell'actina, che non sono liberamente sintonizzabili. Nonostante queste limitazioni e a causa della mancanza di polimeri sintetici, meccanicamente sintonizzabile e semiflessibili, filamenti di actina sono stati stabiliti come sistema modello comune. Una limitazione importante è che la quantità centrale lp non può essere liberamente ottimizzato per studiare il suo impatto sulle strutture macroscopiche alla rinfusa. Questa limitazione è stato risolto impiegando strutturalmente programmabili nanotubi di DNA, attivazione controllata alterazione della rigidezza del filamento. Essi sono formati attraverso progetti basati su mattonelle, dove un insieme discreto di fili parzialmente complementari si ibridano in una struttura ad anello con una discreta circonferenza. Questi anelli presentano estremità appiccicosa, consentendo la polimerizzazione efficace in filamenti alcuni micron di lunghezza e visualizzare simile cinetica di polimerizzazione come biopolimeri naturali. A causa della loro meccanica programmabile, questi tubi sono strumenti versatili, romanzo per studiare l'impatto di lp sulla singola molecola così come la scala di massa. In contrasto con i filamenti dell'actina, rimangono stabili nel corso di settimane, senza degenerazione notevole, e la loro gestione è relativamente semplice.

Introduzione

A causa di comportamenti complessi abilitati di loro proprietà meccaniche uniche, polimeri semiflessibili sono elementi costitutivi fondamentali della materia vivente. In contrasto con polimeri flessibili, polimeri semiflessibili adottano una configurazione tesa a causa della loro rigidità di spina dorsale non vanishing pur rimanendo soggetti a forti fluttuazioni termiche1. Così, modelli puramente stocastici non possono applicarsi ai loro comportamenti, come con gli estremi di polimeri completamente flessibile o rigide. La cosiddetta catena di vite senza fine-come modello2,3,....

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Protocollo

1. preparazione di n HTs

Nota: qui, n indica il numero di diversi singoli filamenti di DNA coinvolti nella formazione dei tubi elica di una certa dimensione. Per n = 8, otto diversi singoli filamenti di DNA formano un anello di unità.

  1. Sequenze di DNA di acquisto (grado di purezza HPLC o superiore) da una sintesi di DNA adatta di servizio o eseguire sintesi di alta qualità e purificazione (sequenze esemplari riportati nella tabella 1).
  2. Oligonucleotidi risospendere liofilizzato in acqua purificata e segui la risospensione ulteriori passaggi riportati nel manuale corrispondente ....

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Risultati

L'Assemblea di nanotubi di DNA tramite una rampa di temperatura (Figura 2) è un metodo molto affidabile per formare questi polimeri semiflessibili artificiali. Questi polimeri hanno caratteristiche paragonabili alle loro controparti naturali, quali i filamenti dell'actina, ma forniscono un quadro sperimentale molto più ampio, poiché le loro proprietà meccaniche può essere controllably alterato9,27 . C.......

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Discussione

Per ottenere reti adeguatamente formate, assemblaggio i nanotubi di DNA è un passo cruciale. Errori durante il processo di sintesi influiscono negativamente sulla qualità di tubo; Pertanto, è consigliabile che HPLC o un processo più rigoroso essere usato per purificare i oligonucleotides. Poiché la formazione di discreti piuttosto che aggregati nanotubi di DNA, come pure la loro distribuzione di lunghezza, dipende la stechiometria equimolare dei oligonucleotides costituente n all'interno del set, è necessario mi.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Riconosciamo che il finanziamento da DFG (1116/17-1) e la scuola di Lipsia di scienze naturali "BuildMoNa" (GSC 185). Questo lavoro è stato sostenuto attraverso il progetto di Fraunhofer Attract 601 683. T. H. riconosce finanziamenti del Fondo sociale europeo (FSE-100077106).

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AFM cantilever ACTAAppNano
AFM - NanoWizard 3JPK Instruments
Telecamera CCDAndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
DNA oligonucleotidiBiomers.netPer le sequenze vedere la Tabella 1
Oligonucleotidi marcati con DNA Cy3Biomers.netPer la sequenza vedere la Tabella 1
EDTASigma-AldrichE-9884
Microscopio a epifluorescenzaLeicaDM-IRB
MgCl2Sigma-AldrichM-8266
Mica "V1", 12 mm rotondoPlano GmbH50-12
MicroAmp® Piastra di reazione ottica veloce a 96 pozzettiThermo Fisher Scientific Inc.
MicroAmp® Pellicola adesiva otticaThermo Fisher Scientific Inc.
Spettrofotometro NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific Inc.
Obiettivo 100xLeica5506168
Acqua purificataMerk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire Provette PCRGreiner Bio-One683271
TProfessional Standard PCR ThermocyclerCore Life Sciences Inc.070-
Standard 7900HT Sistema di PCR in tempo reale veloceBiosistemi applicati4351405
ReometroTA StrumentiARES
SYBR® Colorazione gel per acido nucleico verde IThermo Fisher Scientific Inc.S7567
TrisSigma-AldrichT4661
Triton X-100Sigma-Aldrich Co.X-100Sopprime l'evaporazione del campione all'interfaccia aria-acqua
43469074306311

Riferimenti

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y.

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Ristampe e permessi

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Lunghezza di persistenzaMisurazione reologicaReometro a taglio dinamicoRilevazione di fluorescenzaIbridazione in termociclatorePCR in tempo realeCinetica di polimerizzazioneApplicazione di idrogel