Articolo metodologico

Nanotubi di DNA come un Versatile strumento per lo studio di polimeri semiflessibili

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DOI:

10.3791/56056

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25 ottobre 2017

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1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Polimeri semiflessibili visualizzano proprietà meccaniche uniche che sono ampiamente applicato da sistemi viventi. Tuttavia, gli studi sistematici sui biopolimeri sono limitati poiché proprietà quali la rigidità del polimero sono inaccessibili. Questo manoscritto descrive come questa limitazione è aggirata mediante nanotubi di DNA programmabili, permettendo studi sperimentali sull'impatto della rigidità del filamento.

Abstract

Proprietà meccaniche del complessa, a base di polimeri materia soffice, come cellule o reti di biopolimero, può essere inteso in né la cornice classica di polimeri flessibili né di barre rigide. Filamenti sottostante rimangono tese a causa della loro rigidità non vanishing di spina dorsale, che è quantificato tramite la lunghezza di persistenza (lp), ma sono anche soggetti a forti fluttuazioni termiche. Loro rigidità alla flessione finiti conduce delle reti di massa, permettendo la formazione di ponteggi stabile alle frazioni di volume basso fornendo al contempo maglie di grandi dimensioni meccaniche collettivo unico, non banale. Questo principio di fondo è prevalente in natura (ad esempio, in cellule o tessuti), riducendo al minimo l'alto contenuto molecolare e facilitando in tal modo diffusivo o trasporto attivo. Grazie alla loro implicazioni biologiche e potenziali applicazioni tecnologiche in idrogel biocompatibile, polimeri semiflessibili sono state oggetto Studio considerevole. Tuttavia, le indagini comprensibile è rimasto impegnative poiché hanno contato su polimeri naturali, quali i filamenti dell'actina, che non sono liberamente sintonizzabili. Nonostante queste limitazioni e a causa della mancanza di polimeri sintetici, meccanicamente sintonizzabile e semiflessibili, filamenti di actina sono stati stabiliti come sistema modello comune. Una limitazione importante è che la quantità centrale lp non può essere liberamente ottimizzato per studiare il suo impatto sulle strutture macroscopiche alla rinfusa. Questa limitazione è stato risolto impiegando strutturalmente programmabili nanotubi di DNA, attivazione controllata alterazione della rigidezza del filamento. Essi sono formati attraverso progetti basati su mattonelle, dove un insieme discreto di fili parzialmente complementari si ibridano in una struttura ad anello con una discreta circonferenza. Questi anelli presentano estremità appiccicosa, consentendo la polimerizzazione efficace in filamenti alcuni micron di lunghezza e visualizzare simile cinetica di polimerizzazione come biopolimeri naturali. A causa della loro meccanica programmabile, questi tubi sono strumenti versatili, romanzo per studiare l'impatto di lp sulla singola molecola così come la scala di massa. In contrasto con i filamenti dell'actina, rimangono stabili nel corso di settimane, senza degenerazione notevole, e la loro gestione è relativamente semplice.

Introduzione

A causa di comportamenti complessi abilitati di loro proprietà meccaniche uniche, polimeri semiflessibili sono elementi costitutivi fondamentali della materia vivente. In contrasto con polimeri flessibili, polimeri semiflessibili adottano una configurazione tesa a causa della loro rigidità di spina dorsale non vanishing pur rimanendo soggetti a forti fluttuazioni termiche1. Così, modelli puramente stocastici non possono applicarsi ai loro comportamenti, come con gli estremi di polimeri completamente flessibile o rigide. La cosiddetta catena di vite senza fine-come modello2,3,4 è stato sviluppato per quantificare questa rigidità tramite lp, che è la costante di decadimento della correlazione tangente-tangente lungo il filamento4. Se lp è paragonabile alla lunghezza del contorno (l.c) del filamento, il polimero è considerato semiflessibili1. Loro organizzazione in reti o fasci analoga ai poli di una tenda, si stabilizza l'intero sistema collettivo alle frazioni di volume basso, che conduce a viscoelastico insolite proprietà5,6,7, 8,9. Queste strutture forniscono alta elasticità al grande maglia dimensioni10, mantenendo l'integrità meccanica pur facilitando diffusivo e processi di trasporto attivo. Questa proprietà è particolarmente adatta per sistemi biologici come il citoscheletro o la matrice extracellulare, ma è anche ampiamente usato in alimento ingegneria1,11,12.

Andando oltre il loro significato per la materia vivente, è fondamentale esaminare completamente le proprietà fisiche di queste strutture al fine di avere gli strumenti per sviluppare materiali biomimetici o idrogel romanzo. In termini di polimeri semiflessibili, ciò implica la determinazione sistematica delle proprietà collettiva delle reti derivanti dalle proprietà del singolo filamento come lp e lo sviluppo di un quadro teorico descrittivo. In studi pionieristici, l'actina cellulare biopolimero nasce come sistema modello per polimeri semiflessibili e ancora ampiamente è considerato il gold standard5,13,14,15 , 16 , 17. Tuttavia, gli studi esaustivi sono limitati con questo sistema poiché vengono associati per le proprietà intrinseche di questa proteina. Vari approcci teorici hanno mirato a costruire una descrizione dei comportamenti meccanici non banale a livello di singolo-filamento e hanno portato a in particolare diverse stime scala per la dipendenza del modulo di taglio lineare elastico altopiano, G 0 (vale a dire, il "elasticità" della rete), per quanto riguarda la concentrazione (c) e lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mentre la scala di concentrazione è facilmente accessibile in esperimenti con l'actina-basato o altri sistemi di modello e previsioni teoriche sono state rigorosamente verificati13,16,24, 25, la scala per quanto riguarda lp è rimasta sperimentalmente inaccessibile. Questo, tuttavia, è una limitazione importante poiché lp è anche una variabile indipendente che è la definizione quantità di polimeri semiflessibili.

Questa centrale, naturale limitazione imposta dalla fissa lp di actina o altri polimeri derivati biologicamente come il collagene è stato recentemente risolto impiegando tubi di DNA basato su mattonelle, che sono sintonizzabili in loro proprietà meccaniche 9 , 26 , 27 , 28. lievi variazioni nelle architetture dei tubi (per esempio, diverso numero di costituenti del DNA strands all'interno dell'anello di unità) resa valori distinti per lp, che può essere valutato tramite microscopia a fluorescenza, analizzando un tubo fluttuante o valutando le configurazioni curve dei tubi aderiti diversi, come descritto in precedenza9,28. Queste analisi hanno rivelato che i valori dip ldelle popolazioni differenti del tubo variano nel corso di più di un ordine di grandezza e che le tecniche di valutazione differenti producono risultati coerenti9,28.

Sorprendentemente, il ridimensionamento complessivo del taglio lineare elastico altopiano modulo G0 per quanto riguarda la concentrazione e lp è stato segnalato per essere in contrasto con tutti i precedenti approcci teorici 9, in particolare dimostrando una molto più forte del previsto dipendenza lp. Questi risultati sottolineano il valore di un nuovo sistema di modello per studiare le proprietà centrale di polimeri semiflessibili. Che impiegano n-tubi di helix DNA drammaticamente amplia l'ambito di queste indagini. Non solo può lp essere variato liberamente senza cambiare il materiale di base, ma la natura intrinseca programmabile del DNA può attivare l'esame sistematico di elementi aggiuntivi, come le reticolazioni o processi cinetici di commutazione. Inoltre, questi tubi sono solubili in acqua e, a differenza della maggior parte delle proteine, stabile a pH adeguato e condizioni ioniche per diverse settimane, senza degrado rilevabili9.

Per assemblare questi tubi, viene utilizzato un insieme discreto di oligonucleotidi di DNA, ognuna delle quali contiene due domini che condividono sequenze di basi complementari ai due fili vicini (a causa di specifiche sequenze, un singolo filamento non può formare strutture quali i perni di capelli). Le sequenze complementari ibridano in modo ciclico, formando anelli chiusi, metà-sovrapposizione dei segmenti doppia elica n interconnessi (Figura 1A e B). Questi formano anelli presso un discreto diametro (Figura 1) e la loro configurazione metà sovrapposte espone assiale estremità appiccicosa complementari alle estremità appiccicose di un altro anello. Questa aggiunta selettiva di corrispondenti oligonucleotidi innesca un accatastamento degli anelli, che conduce la polimerizzazione efficace di filamentose tubi di elica di DNA di dimensione n (nHT). Loro lunghezze contorno in genere misurano alcuni micron di lunghezza, e la loro distribuzione di lunghezza è paragonabile a quella di actina filamenti9,26,27,28. È stato dimostrato per nanotubi di DNA simili che esibiscono infatti la cinetica di polimerizzazione simile a quelli dei microtubuli e i filamenti dell'actinaClasse p = "xrif" > 29. A seconda il numero n di singoli filamenti di DNA che compongono la struttura di anello di base, l'architettura nHT, nonché sua circonferenza e diametro, può essere variate controllably. Utilizzando più filamenti di DNA aumenta la circonferenza dei anelli/tubi, e il corrispondente cambiamento architettonico sposta le proprietà meccaniche a valori più elevati dip l(Figura 1), corrispondente a una maggiore rigidità. Sulla scala mesoscopica, questi valori dip lpiù grandi si traducono in meno piegati conformazioni grazie alla rigidità superiore (Figura 1 ed E).

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Protocollo

1. preparazione di n HTs

Nota: qui, n indica il numero di diversi singoli filamenti di DNA coinvolti nella formazione dei tubi elica di una certa dimensione. Per n = 8, otto diversi singoli filamenti di DNA formano un anello di unità.

  1. Sequenze di DNA di acquisto (grado di purezza HPLC o superiore) da una sintesi di DNA adatta di servizio o eseguire sintesi di alta qualità e purificazione (sequenze esemplari riportati nella tabella 1).
  2. Oligonucleotidi risospendere liofilizzato in acqua purificata e segui la risospensione ulteriori passaggi riportati nel manuale corrispondente da parte della società. Regolare la quantità di acqua per ottenere una concentrazione finale di 200 µM.
  3. Determinare concentrazioni di DNA singolo fili per verificare i valori indicati dal distributore (ad es., tramite spettroscopia UV-Vis a 260 nm) poiché la stechiometria esatta è cruciale per il processo di assemblaggio. Calcolare la concentrazione di oligonucleotidi, tenendo conto del peso specifico molare e il coefficiente di estinzione per ogni oligonucleotide di DNA single-stranded.
    Nota: I valori del coefficiente di estinzione intrinsecamente variano per le diverse sequenze e sono indicati nella documentazione di DNA acquistato in commercio. Possono anche essere calcolati secondo il modello più simile utilizzando un numero di strumenti disponibili gratuitamente online. Per rispettare la gamma lineare dello spettrometro, considera diluendo il campione utilizzato per la determinazione di concentrazione.
  4. Utilizzando una micropipetta, mescolare il DNA fili-each allo stesso concentrazione-in un contenitore adatto per il termociclatore (ad es., un tubo PCR di 200 µ l) formare il desiderato n HTs (condizioni di buffer finale: 1xTE (10 mM Tris e 1 mM EDTA, pH 8) e 12,5 mM MgCl 2).
    Nota: I campioni di DNA finale n HT sono costituiti da n - 1 fili, U 1 − U n − 1 e una T n strand. La concentrazione per trefolo può variare da sub-micromolar per più di 10 µM, a seconda delle esigenze dell'utente (ad es., < 1 µm per trefolo per la successiva diluizione di osservare singoli filamenti o concentrazioni più elevate per l'esame di meccanica di rete fitta).
  5. Ibridare n HTs in un termociclatore (denaturazione per 10 min a 90 ° C, con un conseguente abbassamento rapido a 65 ° C; temperatura lenta diminuzione da 65 ° C a 55 ° C, con appaiamento complementare in 20 passaggi di temperatura di-0,50 K per 30 min ciascuna; e un rapido calo da 55 ° C a 20 ° C); vedere Figura 2A.
    Nota: La procedura lenta diminuzione da 65 ° C può essere allungata per aumentare la lunghezza del tubo medio; Tuttavia, il successivo abbassamento rapido a 20 ° C è fondamentale per evitare l'aggregazione dei tubi polimerizzate.
  6. Memorizzare l'ibridati n HTs per fino a 3 settimane a 4 ° C senza degrado rilevabile.
    Nota: Per fluorescenza, microscopia, etichettata n HTs sono ibridate sostituendo (parzialmente) U1 con la U1-Cy3 modificate (tabella 1). Per tempi più lunghi di osservazione, è consigliabile l'aggiunta di agenti anti-candeggio stabiliti.
  7. Attentamente diluire il campione fino alla concentrazione finale desiderata (ad es., 4 µM per reti o 20 nM per singolo filamento osservazioni) utilizzando il buffer di campione, se necessario. Per ridurre al minimo possibili fonti di errore, assemblare i campioni alla concentrazione finale desiderata.

2. Reologia di taglio

  1. Scegli un'appropriata geometria (piastrina-piastrina o cono-piatto) per il reometro di taglio dinamico. Per piccoli volumi (cioè, inferiore a 200 µ l), utilizzare la geometria del cono-piatto.
  2. Caricare l'esempio il taglio dinamico reometro.
  3. Passivare l'interfaccia aria-acqua del campione e l'ambiente attenendosi alla seguente procedura per evitare potenziali effetti evaporazione.
    1. Circondano il campione con 2,5 mL del bagno di tampone campione.
    2. Aggiungere un tensioattivo appena di sotto della concentrazione micellare.
    3. Utilizzare una siringa Hamilton per racchiudere il campione con un lipide per evitare il contatto diretto del campione con aria.
  4. Sigillo del pozzetto con un cappuccio dotato di spugne bagnate e, se possibile, con un bagno di acqua supplementare (non a contatto con il campione) per ulteriore sopprimere evaporazione.
  5. Avviare la misurazione utilizzando il software specifico reometro a temperatura ambiente; in alternativa, eseguire la misurazione a diverse temperature, come ad esempio 37 ° C (se sono necessarie condizioni fisiologiche).
    Nota: L'esempio di raffreddamento è spesso accompagnata dalla condensazione del vapore acqueo dall'aria circostante, mentre riscaldamento porta ad una maggiore evaporazione. Entrambi gli effetti in maniera incontrollata possono cambiare la concentrazione del campione, quindi tutte le misurazioni in serie devono essere eseguite ad una temperatura costante.
  6. Lasciare il campione equilibrare per 2 ore a temperatura ambiente. L'evoluzione temporale può essere monitorato con una spazzata di tempo (i dati di un punto al minuto; ceppo γ = 5%; frequenza f = 1Hz).
  7. Misurare le proprietà meccaniche con i protocolli di test desiderato. Iniziare con una serie di sweep di frequenza (f-spazza) perché lasciano intatto il campione e consentire ulteriori misurazioni.
    Nota: Inoltre, breve f-spazza dovrebbe essere effettuati prima e dopo misurazioni più lungo (ad esempio lungo f-spazza con una risoluzione molto più elevata) per verificare che il campione è rimasto invariato durante tutto il protocollo di misurazione completo.
    1. Eseguire un breve f-sweep (ad es., γ = 5%; f = 0,01 Hz a 30 Hz; punti di 5 dati ogni decennio).
    2. Eseguire una lunga f-sweep (ad es., γ = 5%; f = 0,001 Hz a 30 Hz; 21 punti dati per dieci anni); il regime di bassa frequenza può essere omesso se non è necessario per ridurre il tempo di misura.
    3. Eseguire un breve f-sweep.
    4. Eseguire un γ-sweep (ad es., f = 1 Hz; γ = 0,0125% a 100%; punti 20 dati ogni decennio).
      Nota: Utilizzare il breve f - sweep in primo luogo, come è solito incoerente con precedente f - spazza perché reti solitamente rottura durante γ-sweep o staccano dalle piastre. In alternativa, utilizzare γ-rampa (per esempio, = 0.025 s -1, t = 60 s); Tuttavia, le rampe richiedono solitamente cambiando la modalità motore, così successive breve f-spazza avrebbe falsificato.
  8. Bin e/o liscio i dati raw con un kernel gaussiano.

3. fluorescenza-assistita di ricottura analisi DNA

  1. 8 Preparare aliquote di 12 µ l per ogni campione utilizzando 1-4 µM DNA strand, 12,5 mM MgCl 2 in 1 x buffer di TE e 1 x gel di acido nucleico macchia da un DMSO di 10.000 x stock. Fare un controllo negativo con nessun DNA, ma includono acido nucleico gel macchia.
  2. Trasferire le aliquote a un piatto PCR in tempo reale e sigillare con pellicola adesiva (ad esempio, una piastra a 96 pozzetti di reazione).
    Nota: Le alte temperature utilizzate in termico ricottura protocolli evaporerà campioni. Così, assicurarsi che i pozzi sono ermeticamente chiusi con pellicola adesiva per impedire acqua aumento di evaporazione e concentrazione, specialmente durante gli esperimenti a lungo termine.
  3. Centrifugare la piastra a 100 x g per 1 min a temperatura ambiente per rimuovere le bolle di gas; se le bolle di gas si espandono, i pozzi non possono essere analizzati.
  4. Caricare la piastra sigillata in un sistema PCR quantitativo in tempo reale.
  5. Esegue un programma di ricottura. Denaturare il DNA a 90 ° C per 10 min goccia la temperatura rapidamente a 72 ° C. Quindi, ridurre la temperatura lentamente di 0,5 ° C ogni 30 min. Dopo che il segnale è decaduto, accelerare la rampa di temperatura.
    Nota: 72 ° C è sufficientemente di sopra della temperatura di ibridazione reale; così, il segnale viene registrato su un ampio intervallo di temperature adatto a determinare l'intervallo di temperatura necessaria.
  6. Assicurarsi che il coperchio del ciclatore riscalda per almeno 100 ° C per evitare la condensazione del campione evaporato sulla pellicola adesiva.
  7. Durante il montaggio, eccitare i campioni con un laser a ioni di argon a 488 nm e rilevare la fluorescenza a 550 nm quando usando una macchia di gel di acido nucleico (o spettralmente simili). Per altre sostanze coloranti, scegli una combinazione di eccitazione/emissione appropriato. Misurare il segnale di fluorescenza più spesso possibile per aumentare la complessiva qualità del segnale utilizzando la fotocamera integrata.
    Nota: Qui, le misurazioni sono state effettuate ogni 9 s.
  8. Se fusione preimpostato e ricottura programmi vengono applicati, è possibile utilizzare il software fornito per analizzare i dati. Se non, sottrarre il precedente valore medio il valore medio per ogni passaggio di temperatura ottenere la variazione relativa del segnale fluorescente.

4. AFM Imaging

  1. Cleave mica (per esempio, mica " V1 ") collegando commercialmente disponibile nastro adesivo e strappando; deve essere rimosso lo strato superiore della mica.
  2. Usando una micropipetta, deposito pre-formate n HT in Mg 2 + contenente tampone pieghevole sulla mica appena spaccata e lasciarlo accontentarsi di 10 min.
  3. Spin i campioni a intervalli brevi 3-s a 2.000 x g su una centrifuga di piccolo tavolo per rimuovere il liquido residuo. Diversi n HTs deve essere ancora attaccato alla superficie mica.
  4. Utilizzare un suggerimento a sbalzo con un'elevata rigidità (ad es., 54 Nm -1) e determinare la propria frequenza di risonanza con il software interno di AFM.
  5. Record il profilo di altezza con l'AFM in aria in toccando modalità al scansione basso prezzo (ad es., 1 linea/s) per evitare di danneggiare o spostando la n HTS.

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Risultati

L'Assemblea di nanotubi di DNA tramite una rampa di temperatura (Figura 2) è un metodo molto affidabile per formare questi polimeri semiflessibili artificiali. Questi polimeri hanno caratteristiche paragonabili alle loro controparti naturali, quali i filamenti dell'actina, ma forniscono un quadro sperimentale molto più ampio, poiché le loro proprietà meccaniche può essere controllably alterato9,27 . C...

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Discussione

Per ottenere reti adeguatamente formate, assemblaggio i nanotubi di DNA è un passo cruciale. Errori durante il processo di sintesi influiscono negativamente sulla qualità di tubo; Pertanto, è consigliabile che HPLC o un processo più rigoroso essere usato per purificare i oligonucleotides. Poiché la formazione di discreti piuttosto che aggregati nanotubi di DNA, come pure la loro distribuzione di lunghezza, dipende la stechiometria equimolare dei oligonucleotides costituente n all'interno del set, è necessario mi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Riconosciamo che il finanziamento da DFG (1116/17-1) e la scuola di Lipsia di scienze naturali "BuildMoNa" (GSC 185). Questo lavoro è stato sostenuto attraverso il progetto di Fraunhofer Attract 601 683. T. H. riconosce finanziamenti del Fondo sociale europeo (FSE-100077106).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AFM cantilever ACTAAppNano
AFM - NanoWizard 3JPK Instruments
Telecamera CCDAndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
DNA oligonucleotidiBiomers.netPer le sequenze vedere la Tabella 1
Oligonucleotidi marcati con DNA Cy3Biomers.netPer la sequenza vedere la Tabella 1
EDTASigma-AldrichE-9884
Microscopio a epifluorescenzaLeicaDM-IRB
MgCl2Sigma-AldrichM-8266
Mica "V1", 12 mm rotondoPlano GmbH50-12
MicroAmp® Piastra di reazione ottica veloce a 96 pozzettiThermo Fisher Scientific Inc.
MicroAmp® Pellicola adesiva otticaThermo Fisher Scientific Inc.
Spettrofotometro NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific Inc.
Obiettivo 100xLeica5506168
Acqua purificataMerk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire Provette PCRGreiner Bio-One683271
TProfessional Standard PCR ThermocyclerCore Life Sciences Inc.070-
Standard 7900HT Sistema di PCR in tempo reale veloceBiosistemi applicati4351405
ReometroTA StrumentiARES
SYBR® Colorazione gel per acido nucleico verde IThermo Fisher Scientific Inc.S7567
TrisSigma-AldrichT4661
Triton X-100Sigma-Aldrich Co.X-100Sopprime l'evaporazione del campione all'interfaccia aria-acqua
43469074306311

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