Determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri

Sommario

Qui presentiamo un test affidabile e facile per misurare il contenuto di glicogeno nelle cellule cianobatteriche. La procedura prevede precipitazione, depolimerizzazione selezionabile e rilevazione di residui di glucosio. Questo metodo è adatto sia per ceppi selvatici che geneticamente modificati e può facilitare l'ingegnerizzazione metabolica dei cianobatteri.

Abstract

I cianobatteri accumulano il glicogeno come un importante deposito intracellulare di carbonio e di energia durante la fotosintesi. I recenti sviluppi della ricerca hanno evidenziato meccanismi complessi di metabolismo del glicogeno, compreso il ciclo di biosintesi e catabolismo, la regolazione redox e il coinvolgimento di RNA non codificante. Allo stesso tempo, si stanno tentando di reindirizzare il carbonio dal glicogeno a prodotti desiderabili in cianobatteri geneticamente modificati per migliorare le rese dei prodotti. Diversi metodi sono usati per determinare il contenuto di glicogeno nei cianobatteri, con precisione variabile e complessità tecnica. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la determinazione affidabile del contenuto di glicogeno nei cianobatteri che può essere eseguito in un laboratorio di vita standard. Il protocollo prevede la precipitazione selettiva di glicogeno dal lisato cellulare e la depolimerizzazione enzimatica del glicogeno per generare monomeri di glucosio, rilevati da un gatto di glucosioIdase-perossidasi (GOD-POD). Il metodo è stato applicato a Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, due specie cianobatteriche di modello che sono ampiamente utilizzate nell'ingegneria metabolica. Inoltre, il metodo ha dimostrato con successo le differenze nel contenuto di glicogeni tra il tipo selvatico e mutanti difettosi in elementi regolatori o geni biosintetici al glicogeno.

Introduzione

I cianobatteri accumulano glicogeno come il principale deposito di carboidrati del carbonio da CO ₂ fissato alla luce attraverso la fotosintesi. Il glicogeno è un glicano costituito da glucano lineare α-1,4 collegato con rami creati da legami glucosilici legati al α-1,6. La biosintesi dei glicogeni nei cianobatteri inizia con la conversione di glucosio-6-fosfato in glucosio ADP attraverso l'azione sequenziale di fosfoglucomutasi e di pirosfosforilasi di glucosio ADP. La parte del glucosio in glucosio ADP viene trasferita all'estremità non riducente del globulo di α-1,4-glucano del glicogeno mediante una o più sintasi glicogene (GlgA). Successivamen....

Protocollo

1. Preparazione

1. Culture cianobatteriche
   1. Crescere Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C in mezzo liquido BG11 ⁸ , con un'alimentazione costante di aria integrata con 1% (v / v) CO ₂ . Illuminare le culture in modo continuo con la luce ad una densità di flusso fotonico fotonico di 50 μmol fotone / m ² / s.
   2. Crescere Synechococcus sp. PCC 7002 in liquido A + medium ²³ (può anche essere utilizzato il medium BG11), con un'alimentazione costante di aria integrata con CO _{2 di} 1% (v / v). La temperatura dovrebbe essere di 37 °....

Risultati

10 mi di wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 sono state coltivate in condizioni fotoautotrofiche fino a quando il valore OD _{730nm ha} raggiunto circa 0,8. Le cellule sono state raccolte e risospese in 50 mM Tris-HCl, pH 8. Il valore OD _{730nm è} stato regolato a 2-3. Il contenuto di glicogeno è stato analizzato seguendo il protocollo sopra descritto. Il contenuto di glicogeno per OD _730nm era di 13 ± 1,8 μg / mL / OD _730nm ( N = .......

Discussione

I punti critici all'interno del protocollo sono la precipitazione e la risospensione del glicogeno. Dopo la centrifugazione dopo la precipitazione dell'etanolo, il glicogeno forma un pallone traslucido che aderisce sciattamente alle pareti dei tubi di microcentrifuga. Pertanto, quando si rimuove il surnatante, è necessario prestare particolare attenzione per non rimuovere il pellet. Il pellet di glicogeno è appiccicoso e la solubilizzazione può essere difficile se si asciuga. Si noti che la solubilizzazione comp.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 Lettore di micropiastre	Molecular Devices	NA	Eliza lettore di piastre
Bullet Blender Storm	Next Advance	BBY24M-CE	Battitore di perline
Ultrospec 3100 pro Spettrofotometro UV/Visibile	Amersham Biosciences	NA	Spettrofotometro
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Tampone
HCl	Merck	1-00317	Adibitore pH
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	32319	Tampone
amiloglicosidasi (Rhizopus sp.)	Megazyme	E-AMGPU	Enzima per la depolimerizzazione del glicogeno
&alfa;-Amilasi, termostabile (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	Enzima per la depolimerizzazione del glicogeno
D-Glucosio	Merch	8337	Standard per il test del glucosio Kit per il dosaggio del glucosio
Pierce BCA Protein	Thermo Fisher scientific	23225	Per la determinazione delle concentrazioni proteiche
Vassoi di essiccazione in alluminio, monouso	VWR	611-1362	Per la determinazione dei pesi secchi cellulari Kit
per il dosaggio del D-glucosio (formato GODPOD)	Megazyme	K-GLUC	Per la determinazione delle concentrazioni di glucosio Pani in
ossido di zirconio, 0,15 mm	Next Advance	ZrOB015	Perle per lisi cellulare in a Provette Bullet Blendar
Storm RINO	Next Advance	NA	per la lisi cellulare in una tempesta Bullet Blendar