Determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri

I cianobatteri accumulano glicogeno come il principale deposito di carboidrati del carbonio da CO ₂ fissato alla luce attraverso la fotosintesi. Il glicogeno è un glicano costituito da glucano lineare α-1,4 collegato con rami creati da legami glucosilici legati al α-1,6. La biosintesi dei glicogeni nei cianobatteri inizia con la conversione di glucosio-6-fosfato in glucosio ADP attraverso l'azione sequenziale di fosfoglucomutasi e di pirosfosforilasi di glucosio ADP. La parte del glucosio in glucosio ADP viene trasferita all'estremità non riducente del globulo di α-1,4-glucano del glicogeno mediante una o più sintasi glicogene (GlgA). Successivamente, un enzimi ramificanti introducono il legame glucosilico legato al α-1,6, che viene ulteriormente esteso per generare la particella del glicogeno. Nel buio, il glicogeno viene suddiviso in glicogeno fosforilasi, enzimi di gengogeno debrange, α-glucanotransferasi e fosforilasi di malto-dextrina in glucosio fosforilato e glucosio libero. Questi feed intPercorsi catabolici, compreso il percorso ossidativo del fosfato pentoso, il percorso Embden-Meyerhof-Parnas (glicolisi) e il percorso Entner-Doudoroff ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Il metabolismo dei glicogeni nei cianobatteri ha riscosso un crescente interesse negli ultimi anni a causa del potenziale per i cianobatteri a svilupparsi in fabbriche di cellule microbiche azionate dalla luce solare per produrre sostanze chimiche e combustibili. Il metabolismo del glicogeno potrebbe essere modificato per aumentare la resa dei prodotti, perché il glicogeno è la più grande raccolta di carbonio flessibile in questi batteri. Un esempio è il cianobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, che è stato progettato geneticamente per produrre mannitolo; La rottura genetica della sintesi del glicogeno aumenta la resa del mannitolo 3 volte ⁵ . Un altro esempio è la produzione di bioetanolo da glicogeno-caricato wildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . Il contenuto di glicogeno delle cellule di tipo selvatico può essere fino al 60% del peso secco della cellula durante la fame di azoto ⁶ .

La nostra comprensione del metabolismo e della regolazione del glicogeno si è ulteriormente ampliata negli ultimi anni. Mentre il glicogeno è noto per accumulare alla luce e per essere catabolizzato nella buia, la cinetica dettagliata del metabolismo del glicogeno durante il ciclo di diel è stata solo recentemente rivelata in Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Inoltre, sono stati identificati diversi geni che influenzano l'accumulo di glicogeno. Un esempio notevole è la scoperta che l'istidina kinasi PmgA e l'RNA non codificante PmgR1 formano una cascata regolatrice e controllano l'accumulo di glicogeno. È interessante notare che i mutanti di delezione pmgA e pmgR1 accumulano due volte il maggior numero di glicogeni come il ceppo selvatico di Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . Altri elementi regolatori sono noti anche per influenzare l'accumulo di glicogeno, compreso il fattore sigma alternativo E e il fattore trascrizionale CyAbrB2 ^{10 , 11} .

Poiché l'interesse per la regolazione del glicogeno e il metabolismo cresce, è garantito un protocollo dettagliato che descrive la determinazione del contenuto di glicogeno. Diversi metodi sono usati nella letteratura. L'idrolisi acida seguita dalla determinazione del contenuto di monosaccharide mediante cromatografia liquida a scambio ad anione ad alta pressione accoppiata con un rilevatore amperometrico a pulsazione o una determinazione spettrometrica dopo trattamenti con acido e fenolo sono ampiamente utilizzati per approssimare il contenuto di glicogeno ^{9 , 10 , 12 , 13} . Tuttavia, un cromatografo liquido di scambio anionico ad alta pressioneC è molto costoso e non discrimina il glucosio derivato dal glicogeno da quello derivato da altri glicoconjugati contenenti glucosio, come la saccarosio ¹⁴ , il glucosilglicerolo ¹⁵ e la cellulosa ^{16 , 17 , 18} , notoriamente accumulati in alcune specie di cianobatteri. Il metodo acido-fenolo può essere eseguito utilizzando attrezzature standard di laboratorio. Tuttavia, utilizza reagenti altamente tossici e non distingue il glucosio derivato da diversi glicoconjugati, né distingue il glucosio da altri monosaccharidi che costituiscono materiali cellulari, come i glicolipidi, i liposolucaridi e le matrici extracellulari ¹² . In particolare, il saggio acido-fenolo caldo viene spesso utilizzato per la determinazione del contenuto totale di carboidrati anziché per la determinazione specifica del tenore di glucosio ¹² . Ili enzimaticiLa drolicosi del glicogeno al glucosio da parte di α-amiloglucosidasi seguita dalla rilevazione del glucosio attraverso un dosaggio accoppiato enzima genera una lettura colorimetrica altamente sensibile e specifica al glucosio derivato dal glicogeno. La specificità può essere ulteriormente migliorata con la precipitazione preferenziale di glicogeno da cellule lisati mediante etanolo ^{5 , 8 , 19} .

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per un dosaggio enzimatico del contenuto di glicogeno in due delle specie cianobatteriche più diffuse, Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, nelle specie selvatiche e mutanti. Al fine di garantire un'idrolisi efficiente, viene utilizzato un cocktail di α-amilasi e α-amiloglucosidasi ⁸ . L'α-amilasi ad azione endo idrolizza i legami α-1,4 in vari glucani in dextrine, che vengono ulteriormente idrolizzatiO glucosio mediante eso-azione α-amyloglucosidase ²⁰ . Gli effetti sinergici di questi enzimi sono ben noti e questi enzimi vengono utilizzati abitualmente per l'idrolisi selettiva dell'amido, che è un glicogeno a glucano associato a α, senza influenzare altri glicoconjuganti, come la cellulosa, nella biomassa vegetale ²¹ . Il glucosio rilasciato viene rilevato quantitativamente in seguito a un dosaggio enzimatico composto da glucosio ossidasi che catalizza la riduzione dell'ossigeno al perossido di idrogeno e l'ossidazione del glucosio a un lattone e alla perossidasi che produce un colorante quinoneimina rosa colorato di perossido di idrogeno, Un composto fenolico e 4-aminoantipirina ²² .

1. Preparazione

1. Culture cianobatteriche
   1. Crescere Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C in mezzo liquido BG11 ⁸ , con un'alimentazione costante di aria integrata con 1% (v / v) CO ₂ . Illuminare le culture in modo continuo con la luce ad una densità di flusso fotonico fotonico di 50 μmol fotone / m ² / s.
   2. Crescere Synechococcus sp. PCC 7002 in liquido A + medium ²³ (può anche essere utilizzato il medium BG11), con un'alimentazione costante di aria integrata con CO _{2 di} 1% (v / v). La temperatura dovrebbe essere di 37 ° C. Illuminare le colture in modo continuo con la luce ad una densità di flusso fotonico fotonico di 150 μmol fotone / m ² / s.
   3. Misurare la densità ottica (OD) della coltura a 730 nm usando una cuvetta con un percorso leggero di 1 cm. Se il valore OD è superiore a 0,8, fare le diluizioni appropriate per ottenere misure OD che sono proporzionali a thE.
      NOTA: I protocolli presentati di seguito sono idonei per colture a liquido, con una densità di cella corrispondente ad un valore OD _730nm di 2 o superiore. Quando si desiderano colture nella fase di crescita esponenziale, che in genere hanno un valore OD _730nm inferiore a 1, concentrano la densità cellulare mediante centrifugazione e resuspensione in un tampone o mezzo per ottenere un valore di OD _730nm di 2 o superiore.
2. Tamponi e reagenti
   1. Realizzare 50 mM di Tris-HCl tampone a pH 8.
   2. Realizzare un tampone di acetato di sodio 50 mM a pH 5.
   3. Preparare una soluzione di base di 8 U / mL di amiloglucosidasi in 50 mM di tampone di acetato di sodio, pH 5.
   4. Preparare una soluzione di stock di 2 U / mL α-amilasi in 50 mM di tampone di acetato di sodio, pH 5.
   5. Utilizzando acqua distillata, soluzioni standard macroclucose a concentrazioni che vanno da 0 a 100 μg / ml.
   6. Preparare il reagente GOD-POD dal kit di analisi D-glucosio (formato GODPOD), fSeguendo l'istruzione del produttore.

2. Determinazione del peso a secco della cellula (opzionale)

1. Trasferire 2 mL di una coltura o una risospensione cellulare (vedere la fase 1.1) in un tubo da 2,0 mL e centrifugare a 6,000 xg e 4 ° C per 5 minuti. Scartare il surnatante.
2. Resispendere il pellet in 1 ml di acqua e centrifugare a 6000 xg e 4 ° C per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di acqua.
3. Trasferire la sospensione in un vassoio di alluminio pre-pesato. Trasferire il vassoio ad un forno a secco a 105 ° C per un essiccamento notturno (circa 18 h).
   CRITICI: È importante che il vassoio venga trattato con pinze per evitare il trasferimento di materiale dalle dita. Asciugare un vassoio in alluminio vuoto pre-pesato sotto le stesse condizioni per determinare qualsiasi perdita di peso dai vassoi durante l'essiccazione.
4. Dopo l'essiccazione, rimuovere il vassoio dal forno e lasciarlo equilibrare a conditi ambientaliOns per 5 minuti prima di pesarlo con una precisione di 0,0001 g.
   NOTA: il valore può essere utilizzato per normalizzare il contenuto di glicogeno su base cellulare a secco.

3. Lisi delle cellule cianobatteriche

1. Trasferire 1 mL di una coltura o una resuspensione cellulare (vedere la fase 1.1) in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 6,000 xg e 4 ° C per 10 minuti. Scartare il surnatante.
2. Resuspendere il pellet in 1 ml di 50 mM Tris-HCl, pH 8 e centrifugare a 6000 xg e 4 ° C per 10 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone Tris-HCl. Ripetere il processo.
3. Riposizionare completamente il pellet in 500 μl di 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.
   CRITICI: Resuspendere il pozzetto di pellet per una lisi di cellule efficiente. Tenere la resuspensione in ghiaccio.
4. Lyse le cellule resuscitate a 4 ° C eseguendo 30 cicli di ultrasonografia, ogni ciclo composto da 30 s ad una frequenza di 20 kHz con l'ampiezza massima,Seguito da 90 s senza.
   NOTA: Questo metodo può efficacemente lire Synechococcus sp. PCC 7002.
   1. In alternativa, trasferire la resuspensione delle cellule in un tubo a vite e aggiungere branelli di ossido di zirconio al tubo, seguendo le istruzioni del produttore. Impostare il tubo in un omogeneizzatore tissutale e liscivare le cellule a 4 ° C eseguendo 2 cicli di battitura, ciascun ciclo consistente di 5 minuti alla regolazione di frequenza di 5.
      NOTA: Questo metodo può efficacemente lire Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002.
5. Centrifugare il tubo contenente il lisato per 10 min a 6.000 xg e 4 ° C.
   NOTA: Il pellet dovrebbe consistere principalmente in grandi detriti di celle. Se c'è un numero significativo di cellule ininterrotte, ripetere il passo 3.4. Tenere il surnatante sul ghiaccio.
6. Determinare la concentrazione proteica usando un kit di analisi della proteina BCA commerciale.
   NOTA: il valore può essere utilizzato per normalizzare il contenuto di glicogenoSu base di proteine.

4. Precipitazione di glicogeno

1. Togliere la clorofilla a dal lisato cellulare mescolando 900 μl di etanolo al 96% (v / v) e 100 μL del supernatante dal punto 3.5 in un tubo a vite a 1,5 ml. Dopo aver chiuso il coperchio, riscaldare il tubo a 90 ° C per 10 minuti usando un blocco di riscaldamento standard di laboratorio.
2. Incubare il tubo sul ghiaccio per 30 min.
3. Centrifugare il tubo a 20.000 xg e 4 ° C per 30 minuti e rimuovere attentamente il surnatante; Il pellet contiene glicogeno. Asciugare leggermente il pellet in aria per rimuovere l'etanolo in eccesso.
   CRITICA: Si deve evitare l'essiccazione eccessiva del pellet, altrimenti diventa difficile da solubilizzare nel punto 5.1.
4. OPTIONAL: Misurare l'assorbanza del surnatante ottenuto nello stadio 4.3 a 664 nm per determinare la clorofilla un contenuto. Usare un coefficiente di assorbimento di 84,6 L / g / cm ²⁴ .
   NOTA: il valore può essere utilizzato per normalizzareE il contenuto di glicogeno.

5. Idrolisi enzimatica e determinazione dei glicogeni

1. Solubilizzare il pellet ottenuto nel punto 4.3 in 100 μL di 50 mM acetato di sodio, pH 5, e aggiungere 50 μL di 8 U / ml amiloglucosidasi e 50 μL di 2 U / ml α-amilasi. Mescolare bene questi materiali usando un vortice.
   NOTA: La miscelazione mediante pipetta non è raccomandata perché il pellet glicogeno è viscoso.
2. Incubare la miscela a 60 ° C su un blocco di riscaldamento per 2 ore per consentire la digestione del glicogeno in molecole di glucosio.
3. Centrifugare il campione a 10.000 xg per 5 minuti e trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 mL.

6. Determinazione del contenuto totale di glucosio utilizzando il reagente GOD-POD

1. Misurare la concentrazione di glucosio nel supernatante ottenuto nel punto 5.3 utilizzando il reagente GOD-POD. Trasferire 100 μl del supernatante dalla fase 5.3 in un pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Come controllo negativo,Utilizzare 100 μL di 50 mM acetato di sodio, pH 5. Per generare una curva di calibrazione, misurare anche le soluzioni standard di glucosio.
2. Aggiungere 150 μl di reagente GOD-POD a ciascun campione e mescolare rapidamente pipettando.
3. Incubare la lastra staticamente a 25 ° C per 30 min. Registrare il valore di assorbanza a 510 nm utilizzando un lettore di piastre.
4. Calcolare la concentrazione del glucosio utilizzando una curva di calibrazione ottenuta dagli standard di glucosio.
   NOTA: La concentrazione di glicogeno nel lisato cellulare è espressa come concentrazione del glucosio (μg / mL).

10 mi di wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 sono state coltivate in condizioni fotoautotrofiche fino a quando il valore OD 730nm ha raggiunto circa 0,8. Le cellule sono state raccolte e risospese in 50 mM Tris-HCl, pH 8. Il valore OD 730nm è stato regolato a 2-3. Il contenuto di glicogeno è stato analizzato seguendo il protocollo sopra descritto. Il contenuto di glicogeno per OD 730nm era di 13 ± 1,8 μg / mL / OD 730nm ( N = 12). Il contenuto di glicogeno relativo al contenuto proteico era di 0,24 ± 0,03 ug / ug (N = 12), e il contenuto di glicogeno rispetto alla clorofilla un contenuto era 5,7 ± 0,6 ug / mg (N = 12). A causa della piccola quantità di materiale disponibile, la misura del peso secco della cellula è stata omessa. Dato che il contenuto proteico in cianobatteri coltivato in condizioni paragonabili è circa il 50% del peso secco della cellula 25 °/ Sup>, il contenuto di glicogeno è stimato pari al 12% del peso secco cellulare, che è coerente con gli studi precedenti 26 .

I limiti di rilevazione del dosaggio GOD-POD hanno mostrato una correlazione lineare tra la concentrazione di glucosio e l'assorbanza a 510 nm nella gamma di concentrazione di glucosio tra 10 e 100 μg / mL, corrispondente a valori di assorbanza di 0,08 e 0,7 a 510 nm. Il limite minimo è probabilmente dovuto al limite di rilevazione strumentale. Quando sono state impiegate concentrazioni di glucosio superiori a 150 μg / mL, si formano precipitazioni di colore verde scuro, provocando una grande variazione nella lettura dell'assorbanza. Per quanto riguarda la quantità di materiali cellulari utilizzati, abbiamo ottenuto regolarmente contenuti di glicogeno riproducibili quando il valore OD 730nm della resuspensione cellulare prima della lisi cellulare era tra 2 e 10. Le risospensioni delle cellule con un valore di OD 730nm di 1 o inferiore hanno dato origine a segnali vicini alla Minimo rilevamento limiT, portando a risultati molto variabili. La resuspensione delle cellule con un valore di OD 730nm superiore a 20 non era adatta perché la lisi cellulare era incompleta e sono state necessarie diluzioni o diluizioni estese.

La figura 1 mostra i risultati rappresentativi del contenuto di glicogeno in Synechocystis sp. PCC 6803 wildtype e due ceppi mutanti ( ΔpmgA e ΔpmgR1 ). Le cellule cresciute alla fase di crescita esponenziale sono state utilizzate. I contenuti del glicogeno sono stati normalmente normalizzati dal contenuto totale di proteine ​​e sono stati successivamente espressi rispetto al valore del tipo selvatico. I risultati mostrano che i ceppi mutanti hanno contenuto di glicogeno che sono almeno due volte più alti del ceppo di tipo selvatico.

Successivamente, il contenuto di glicogeno è stato analizzato in ceppi di Synechococcus sp. PCC 7002 progettato per produrre mannitolo 5 . Il primo ceppo (Glg +) contiene i tipo selvatico glgA1 e glgA2 geni che codificano due sintasi del glicogeno funzionali, mentre il secondo ceppo (Glg -) manca di copie funzionali di questi geni 5. I contenuti del glicogeno e del mannitolo sono stati quindi misurati in entrambi i ceppi ( Figura 2 ). I risultati mostrano che la Glg - mancava un livello rilevabile di glicogeno, mentre produceva più mannitolo rispetto al ceppo Glg +. Ciò suggerisce che il carboidrato sintetizzato dalla fotosintesi viene reindirizzato a mannitolo nel ceppo mutante che manca la capacità di sintetizzare il glicogeno. I valori di OD 730nm delle culture erano circa 10, fornendo materiali cellulari sufficienti per l'analisi del peso secco cellulare. I contenuti del glicogeno sono stati normalizzati utilizzando il peso secco della cellula.

8 / 56068fig1.jpg "/>
Figura 1: Il contenuto di glicogeno misurato in diverse linee di Synechocystis sp . PCC 6803. Sono mostrati contenuti relativi al glicogeno nel WT e in due mutanti ( ΔpmgA 9 e ΔpmgR1 8 ). I livelli di glicogeno sono stati normalizzati dal contenuto totale di proteine. Sono mostrati i tre replicati biologici, con barre di errore che rappresentano deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Produzione di glicogeno e mannitolo in Synechococcus sp. Geneticamente manipolato. PCC 7002 5 . GLG <Sup> +, il ceppo che sintetizza il mannitolo e il glicogeno. Glg - , il ceppo che sintetizza il mannitolo ma non il glicogeno. I valori rappresentati sono la media di tre repliche biologiche, con barre di errore che rappresentano le deviazioni standard. CDW: peso secco cellulare, ND: non rilevato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.