High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

Sistemi biologici spesso esperienza transitorie fluttuazioni in abbondanza di proteine. Se questi hanno un impatto duraturo nel plasmare il fenotipo di un organismo o delle generazioni future rimane poco chiaro. I più noti casi di questa biologia coinvolgono una rara classe di proteine, i prioni, che guidano l'emergere dei tratti ereditari senza alcuna modifica del genoma. Invece, queste particelle di fectious proteinaceous e neltrasmettono fenotipi tramite auto-perpetuante cambiamenti di conformazione della proteina^1,2. Questo tipo di ereditarietà è stato scoperto come la causa dei modelli di ereditarietà insoliti di una devastante malattia neurodegenerative. Tuttavia, gli studi negli organismi che variano dai funghi ai mammiferi^{3,4,5,6,7,8,9,10} da allora hanno rivelato che il prione-come gli elementi possono conferire valore adattativo. Ciò nonostante, i prioni sono stati visti come un affascinante ma rara stranezza biologica.

Questa saggezza prevalente si svolge in parte perché la caratterizzazione di base proteica eredità lungo è stata limitata da un piccolo insieme di esempi. I recenti sforzi di screening sistematico hanno ampliato significativamente questa immagine individuando diversi nuovi bona fide prioni¹¹ e quasi due dozzine di proteina domini¹² con la capacità di conversione conformazionali del prione-come combustibile. Tuttavia, poiché questi approcci sono generalmente concentrati su pregiudizi di sequenza dell'amminoacido forte, i prioni che sono stati scoperti condividono le proprietà biochimiche del fondatore lievito prioni [PSI⁺]^13,14, [URE3]¹⁵e [RNQ⁺]^11,16. Questi includono: 1) modulare domini che sono ricchi di tratti lungo polimerici di asparagina (N) e glutammina (Q), 2) assembly in un amiloide [PRION⁺] conformazione^17,18,19e 3) completano dipendenza da disaggregase funzione di Hsp104 per la propagazione di fedeli da madre a figlia^13,20,21. Infatti, molti bona fide prioni, tra cui [GAR⁺], [Het-s] e anche l'originale del prion (PrP^Sc), sarebbe saltato sotto tali criteri rigorosi. Forse ancora più importante, sarebbero in grado di catturare qualsiasi nuovi meccanismi di ereditarietà su base proteica²². Quindi, l'ampiezza biologica vera di tali fenomeni può essere molto più comune in natura di quanto si pensasse.

Per studiare questa domanda, una strategia di alto-rendimento, tutto il proteoma è stato impiegato. Un segno distintivo di tutti i prioni, tra cui PrP^Sc, [GAR⁺], e [Het-s], è che la sovraespressione transitoria delle proteine causale aumenta fortemente il tasso del prione acquisizione^{15,23,24,25,26}. Abbiamo approfittato di questa funzionalità per sistematicamente chiedere, su tutto il lievito ORFeome, se stati stabili basati su proteine, epigenetici potrebbero essere iniziati inducendo transitoriamente la sovraespressione delle singole proteine. È ben noto che la sovraespressione della proteina può alterare fenotipi²⁷. Tuttavia, proteine prioniche sono insoliti perché loro sovrapproduzione temporanea produce un cambiamento nel fenotipo che è ereditabile per molte centinaia di generazioni dopo la sovraespressione iniziale. Abbiamo precedentemente preso vantaggio di questa funzione, così come i modelli di ereditarietà insoliti di elementi genetici basati su proteine, per identificare decine di proteine che sono in grado di heritably necessità di cablaggio fenotipiche paesaggi senza alterare il genoma²⁸. Anche se alcuni identificati proteine precedentemente erano conosciuti come i prioni, la maggior parte erano non, sottolineando la potenza di questo approccio per scoprire nuove forme di ereditarietà a base di proteine.

1. Sovraespressione iniziale

1. Trasformare le cellule di lievito (in questo caso, BY4741 MAT a aploidi) precedentemente coltivate in YPD liquido (10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone e 20 g di glucosio per 1 L) con i costrutti candidati desiderati dalla libreria FLEXGene ORFeome (ORF di lievito sotto il controllo di un promotore inducibile dal galattosio nella spina dorsale plasmidico centromerica marcata con URA3, pBY011²⁹).
2. Usa stuzzicadenti autoclavati per prelevare quattro colonie separate da queste trasformazioni che fungano da repliche biologiche. Coltivali per 48-72 ore in 150 μL di SRaffinosio-URA (0,74 g di CSM-URA, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi e 20 g di raffinosio per 1 L) in piastre a 96 pozzetti. Inoculare le colonie dal primo ORF nel pozzetto A1 di tutte le piastre, le colonie dal secondo ORF in A2 di tutte le piastre, ecc.
   NOTA: Tutte le fasi di crescita sono condotte a 30 °C e a livelli atmosferici di CO₂ (407,05 ppm), se non diversamente specificato.
3. Verificare che le colture siano sature (cellule visibili a occhio nudo sul fondo di ciascun pozzetto) e utilizzare un robot per la manipolazione dei liquidi per inoculare un array 1:4 di 1 μL da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti in 4 pozzetti separati di una piastra da 384 pozzetti riempita con 45 μL di SGal-URA (0,74 g di CSM-URA, 6,7 g di lievito base azotata senza aminoacidi e 20 g di galattosio per 1 L) per pozzetto.
   NOTA: Questo crea una piastra composita in cui 4 repliche biologiche di ciascun ORF sono disposte in uno schema quadrato.
4. Allo stesso tempo, preparare piastre separate da 384 pozzetti contenenti 45 μL di SGal-URA con i fattori di stress di interesse (ad esempio, cloruro di manganese a 20 mM) per pozzetto. Inoculare questa piastra nello stesso modo utilizzato al punto 1.3.
   NOTA: Per ottenere il massimo intervallo dinamico per la rilevazione fenotipica, si raccomanda una serie di diluizioni di 2 volte intorno alla concentrazione di LD50 di un determinato fattore di stress. Questo può essere fatto in anticipo per determinare la concentrazione ottimale alla quale osservare sia la crescita aumentata che quella ridotta.
5. Come controllo parallelo finale, inoculare una terza piastra da 384 pozzetti nello stesso modo, con lo stesso fattore di stress incluso nel terreno che non indurrà l'espressione plasmidica. Assicurarsi che la piastra contenga 45 μL di SD-URA (0,74 g di CSM-URA, 6,7 g di base azotata di lievito senza amminoacidi e 20 g di glucosio per 1 L) per pozzetto e che sia inoculata come nei passaggi 1.3 e 1.4.
6. Posizionare immediatamente le piastre con le celle su un impilatore di micropiastre e impostare il protocollo per un ciclo continuo di 72 ore, misurando l'OD₆₀₀ con un lettore di micropiastre dotato di impilatori a temperatura ambiente e CO₂ atmosferica (407,05 ppm).
   Nota: la frequenza della misurazione della crescita dipenderà dal numero di piastre (determinato in ultima analisi dal numero di geni e condizioni che il ricercatore desidera sondare) utilizzate nella corsa. Più piastre vengono utilizzate, più tempo impiegherà il lettore di piastre a completare un ciclo e quindi maggiore sarà il tempo tra le misurazioni (il tempo di misurazione per piastra è di ~45 s, a seconda della strumentazione impiegata).
7. Dopo le misurazioni della crescita, utilizzare lo stesso robot di manipolazione dei liquidi per trasferire 1 μL per pozzetto delle colture indotte da SGal-URA (cioè quelle che hanno sperimentato una sovraespressione proteica) in nuove piastre da 384 pozzetti contenenti 45 μL di SD-URA per pozzetto (terreno che non consente l'espressione proteica del plasmide).
   1. Parallelamente, eseguire inoculazioni analoghe di una seconda serie di piastre da 384 pozzetti contenenti 45 μL di SD-URA per pozzetto dalle colture che sono state coltivate in SD-URA in presenza dei fattori di stress (cioè quelli della fase 1.5).
   2. Far crescere le piastre per 48 ore a 30 °C fino alla saturazione in una camera umidificata (cioè un bidone di plastica sigillabile con un tovagliolo di carta umido all'interno).
8. Prendere le piastre del passaggio precedente e reinoculare 1 μL per pozzetto in piastre da 384 pozzetti contenenti 45 μL di SD-URA. Quindi, eseguire un reinoculo separato di 1 μL per pozzetto dalla stessa piastra sorgente in una piastra separata da 384 pozzetti contenente 45 μL di SD-URA con il fattore di stress.
   NOTA: Questo determinerà se i fenotipi di sensibilità/resistenza a un fattore di stress persistono dopo che la sovraespressione della proteina è cessata.
9. Posizionare immediatamente le piastre con le celle su un impilatore di micropiastre e impostare il protocollo per un ciclo continuo di 48 ore che misura l'OD₆₀₀ con un lettore di micropiastre a temperatura ambiente e CO₂ atmosferica (407,05 ppm).
10. Esporta le misurazioni del tempo rispetto a OD₆₀₀ come tabella XY utilizzando il software di lettura delle piastre. Raggruppare le colonne dell'OD₆₀₀ per ogni replica biologica e calcolare la media. Crea un grafico XY del tempo rispetto a OD₆₀₀ per generare curve di crescita.
    1. Confrontare i tassi di crescita delle colture che erano state sottoposte a una sovraespressione passata (cioè quelle originariamente indotte in terreno contenente galattosio prima del reinoculo in SD-URA) rispetto alle colture che non lo erano state (cioè quelle propagate nel glucosio), come descritto in precedenza³⁰.
11. Per le colture che mostrano differenze di crescita significative in risposta a un dato fattore di stress, dipendenti dalla sovraespressione della proteina ancestrale, prelevare 1 μL da ciascuna replicazione biologica, diluirlo in 10 mL di acqua e quindi impiattare 50 μL su piastre contenenti 5-FOA (0,74 g di CSM-URA, 1 g di 5-FOA, 50 mg di uracile, 6,7 g di lievito base azotata senza aminoacidi, 20 g di glucosio e 20 g di agar per litro). Crescere a 30 °C per 3 giorni.
    1. Se ciò si traduce in un numero eccessivo o insufficiente di colonie per piastra, regolare il fattore di diluizione di conseguenza.
       Nota: il 5-FOA viene convertito in un intermedio tossico dalla via di biosintesi dell'uracile. Ciò causerà una perdita del plasmide di espressione marcato con URA3 trasformato nella prima fase.
12. Prelevare 8-32 colonie singole con stuzzicadenti autoclavati e fissarle su piastre a 96 pozzetti contenenti 150 μl di SD-CSM. Crescere fino alla saturazione per 48-72 ore in una camera umidificata a 30 °C. Utilizzare queste colture per inoculare due nuove serie di piastre da 96 pozzetti contenenti 150 μl di SD-CSM, sia con che senza i fattori di stress del passaggio 1.11.
13. Posizionare le piastre su un impilatore di micropiastre e impostare il protocollo per misurare l'OD₆₀₀ su un ciclo continuo di 48 ore.
14. Analizzare i dati come nel passaggio 1.10 e confermare che le differenze di crescita significative osservate nel passaggio 1.10 si mantengono dopo la perdita di plasmidi.
    NOTA: Queste cellule ospitano stati fenotipici stabili che potrebbero essere indicativi di un'ereditarietà basata sulle proteine.
15. Testare le cellule che hanno mantenuto i fenotipi indotti per i classici segni distintivi dell'ereditarietà basata sulle proteine (vedi sotto).

2. Test per l'ereditarietà simile ai prioni

1. "Cura" mediata da chaperone
   1. Testare la dipendenza dell'chaperone Hsp104.
      1. Prelevare una colonia di un ceppo di lievito che presenta uno stato fenotipico stabile, passare a singole colonie su una piastra YPD (10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 g di glucosio e 20 g di agar per 1 L) contenente 3 mM di GdnHCl e far crescere a 30 °C per 3 giorni. Parallelamente, escludi una colonia da un ceppo naïve a singole colonie su YPD+ 3 mM GdnHCl come controllo allo stesso modo.
      2. Ripetere altre 2 volte su piastre YPD fresche contenenti 3 mM di GdnHCl.
      3. Poiché l'esposizione a GdnHCl può aumentare la frequenza con cui insorgono le cellule minuscole, prelevare più colonie che hanno subito 3 passaggi su GdnHCl e verificare la respirazione mitocondriale funzionale esaminando la loro capacità di crescere in colonie visibili su piastre di YP-glicerolo (10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 ml di glicerolo e 20 g di agar per 1 L) dopo 7 giorni.
      4. Prelevare colonie multiple dalle piastre di YP-glicerolo e testare il mantenimento di stati fenotipici stabili utilizzando la crescita in presenza del fattore di stress rispetto ai controlli non "curati" e naïve (cioè cellule isogeniche che non ospitano lo stato fenotipico, come BY4741 MATa aploidi) in modo simile a come descritto nel passaggio 1.13.
   2. Testare la dipendenza dell'chaperone Hsp70.
      1. "Curare" tramite un plasmide.
         1. Trasformare sia le cellule naive che le cellule che ospitano stati fenotipici stabili con plasmidi marcati con URA3 che esprimono un allele negativo dominante di Hsp70 (K69M)^25,31 da un forte promotore costitutivo (GPD).
         2. Prelevare singoli trasformanti per ciascuno, striare a singole colonie su una piastra SD-URA (0,74 g di CSM-URA, 6,7 g di base azotata di lievito senza amminoacidi, 20 g di glucosio e 20 g di agar per 1 L) e coltivare per 3 giorni a 30 °C e CO₂ atmosferica.
         3. Ripetere questa passata altre 2 volte sulle piastre SD-URA.
         4. Scegli più colonie e passa a singole colonie su piastre da 5 FOA per eliminare il plasmide.
         5. Prelevare più colonie singole per ogni isolato e verificare la ritenzione (o la perdita) degli stati fenotipici stabili in modo simile a quanto descritto nel passaggio 1.13.
      2. "Cura" attraverso l'incrocio genetico.
         1. Incrociare ceppi aploidi BY4741 MATche ospitano stati fenotipici stabili e ceppi naive del tipo di accoppiamento opposto (in questo caso, BY4742 MATα) che ospitano delezioni genetiche in due dei quattro paraloghi di lievito Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ).
            NOTA: Questo ceppo è carente nella funzione chaperone Hsp70.
         2. Selezionare per la crescita dei diploidi mediante striature a singole colonie su SD-LYS-MET (0,74 g di CSM-LYS-MET, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 20 g di glucosio e 20 g di agar per 1 L) terreno a doppio dropout.
         3. Raccogliere singole colonie diploidi e crescere per 24 ore a 30 °C in 8 mL di terreno di pre-sporulazione (0,8% di estratto di lievito, 0,3% di peptone, 10% di destrosio e 100 mg/L di adenina solfato).
         4. Centrifugare le colture per 3 minuti a 3.000 xg, aspirare il terreno di pre-sporulazione (pre-SPO) e lavare i pellet una volta con acqua sterile.
         5. Risospendere i pellet in 2 mL di terreno di sporulazione (1% acetato di potassio, 0,1% estratto di lievito, 0,05% glucosio e 0,01% miscela di aminoacidi (2 g di istidina, 10 g di leucina, 2 g di lisina e 2 g di uracile)). Crescere a 25°C per 5 giorni.
         6. Spostare le colture a 30 °C e incubare per altre 48 ore.
         7. Valutare l'efficienza della sporulazione cercando la presenza di tetradi utilizzando un microscopio ottico³².
         8. Prelevare 40 μL di coltura, centrifugare per 1 minuto a 3.000 xg in una provetta da 1,5 mL e risospendere in un volume uguale di miscela di enzimi zimosiasi (1 M di sorbitolo, 0,1 M EDTA e 10 mg/mL di zimoliasi 100T)
         9. Incubare a 25 °C per 5 min.
         10. Applicare 10 μl di coltura digerita su una piastra di agar YPD molto asciutta e molto livellata e lasciare che la coltura si diffonda lentamente lungo la piastra in linea retta.
         11. Lasciare asciugare le piastre per almeno 30 minuti in una cappa a flusso laminare.
         12. Usando un microscopio da dissezione, separare le spore in tetradi e disporle sulla piastra.
         13. Lasciare che le singole spore aploidi crescano in colonie e testare la loro capacità di crescere su piastre SD-HIS-LEU (0,67 g di CSM-HIS-LEU, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 20 g di glucosio e 20 g di agar per 1 litro), indicando che ospitano entrambe le delezioni genetiche (ssa1Δ ssa2Δ).
         14. Testare ciascuno di essi per il mantenimento dello stato fenotipico nel background con deficit di Hsp70 in modo simile a quanto descritto nel passaggio 1.13.
             NOTA: L'incrocio di queste spore con un ceppo wildtype con funzione Hsp70 ripristinata non dovrebbe ripristinare il fenotipo prionico.
2. Test per l'ereditarietà non mendeliana.
   1. Incrocia BY4741 MAT, un ceppo aploide che ospita stati fenotipici stabili e controlli naive isogenici, con un ceppo naive isogenico del tipo di accoppiamento opposto (in questo caso, BY4742 MATα).
   2. Selezionare per la crescita dei diploidi mediante striature a singole colonie su terreno SD-LYS-MET a doppio forcellino.
   3. Raccogliere singole colonie diploidi e coltivare per 24 ore a 30 °C in 8 mL di terreno di pre-sporulazione.
   4. Ripetere i passaggi 2.2.2.3-2.2.2.12, come descritto sopra.
   5. Lasciare che le singole spore aploidi crescano in colonie e testare ciascuna per il mantenimento dello stato fenotipico attraverso la meiosi utilizzando il test di crescita, come nel passaggio 1.13.
      Nota: Un'altra caratteristica distintiva dei prioni è che possono essere eliminati ereditabilmente attraverso la rimozione della proteina casuale originale. Quindi, l'incrocio analogo di un ceppo di prioni con un ceppo che ospita una delezione genetica della proteina indotta originale abrogherà i fenotipi prionici nelle spore che ereditano la delezione. Si noti anche che è possibile che il prione venga mantenuto in uno stato "criptico" in un tale mutante se il gene eliminato è necessario per manifestare il fenotipo del prione ma non per propagare il prione stesso. Per distinguere tra queste due possibilità, incrociare le spore con un ceppo wildtype naïve e verificare se il fenotipo del prioni riemerge in un background genetico diploide, dove la funzione del gene è stata ripristinata.
3. Citoduzione.
   1. Genera il ceppo ricevente BY4742 iniziale.
      1. Attraverso la trasformazione, introdurre un allele KAR difettoso (kar1-15) che impedisce la fusione nucleare durante l'accoppiamento²³.
      2. Rendi questo ceppo "piccolo" (cioè incompetente per la respirazione mitocondriale) inoculando una singola colonia in brodo YPD con lo 0,25% di bromuro di etidio.
      3. Far crescere la coltura a 30 °C fino alla fase esponenziale/stazionaria tardiva (OD₆₀₀ ~1).
      4. Diluire 1:1.000 in YPD fresco con bromuro di etidio allo 0,25% e ripetere due volte.
      5. Una volta che la coltura raggiunge la fase esponenziale tardiva/stazionaria precoce (OD₆₀₀ 0,8-1,2), piastra in singole colonie diluendo 1:10.000 in acqua sterile e piastrando 50 μl su una piastra YPD. Dopo aver coltivato per 3 giorni a 30 °C, raccogli più colonie e testa ciascuna di esse per l'incompetenza respiratoria esaminando la loro capacità di crescere in colonie visibili su piastre di YP-glicerolo dopo 7 giorni.
   2. Eseguire la citoduzione iniziale in BY4742.
      1. Mescolare le cellule del ceppo BY4741 del donatore che ospitano uno stato fenotipico stabile con le cellule del ceppo naive BY4742 kar1-15 ricevente sulla superficie di una piastra di agar YPD.
      2. Coltivare per 24 ore a 30 °C e CO₂ atmosferica (407,05 ppm) e trasferire in terreno di uscita della metionina contenente glicerolo (SGly-MET: 0,74 g di CSM-MET, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 20 ml di glicerolo e 20 g di agar per 1 L).
         NOTA: Questo seleziona entrambi i marcatori nucleari BY4742, oltre a consentire il ripristino dei mitocondri funzionali attraverso lo scambio citoplasmatico.
      3. Dopo 3-5 giorni, prelevare più colonie singole ed eseguire un altro ciclo di selezione su SD-MET (0,74 g di CSM-MET, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 20 g di glucosio e 20 g di agar per 1 L).
      4. Parallelamente, confermare che le colonie non sono diploidi passando su SD-LYS-MET medium.
   3. Eseguire citoduzioni inverse.
      1. Mescola i nuovi ceppi donatori (questa volta, i citoducenti kar1-15 di successo BY4742) con piccole cellule naive BY4741 (generate come sopra) su agar YPD.
      2. Ripeti le citoduzioni, come descritto in precedenza (passaggi 2.3.2.1-2.3.2.4), ad eccezione della selezione dei marcatori nucleari riceventi di BY4741 su terreno glicerico privo di lisina (SGly-LYS: 0,74 g di CSM-LYS, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 20 ml di glicerolo e 20 g di agar per 1 L).
      3. Prelevare più citoduttanti e verificare il mantenimento di stati fenotipici stabili utilizzando il test di crescita, come prima nel passaggio 1.13.
4. Trasformazione delle proteine.
   1. Preparare il lisato.
      1. Coltivare 50 mL di cellule che ospitano stati fenotipici stabili in YPD per 18 ore a 30 °C.
      2. Pellettare le colture a 3.000 x g per 4 minuti e poi lavare due volte: una volta in H₂O autoclavato e poi in 1 M di sorbitolo.
      3. Risospendere le cellule in 200 mL di tampone SCE (1 M di sorbitolo, 10 mM EDTA, 10 mM di DTT, 100 mM di citrato di sodio e 1 compressa di inibitore della proteasi mini-EDTA free per 50 mL, pH 5,8) con 50 U/mL di enzima litico 100T del lievito.
      4. Incubare la miscela a 35 °C per 30 minuti.
      5. Sonica le celle a 20 kHz e 20% di intensità per 10 s sul ghiaccio con un dismembratore sonico.
      6. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 10.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
      7. Spostare i surnatanti in una provetta pulita e aggiungere RNasi I e DNasi biotinilata in eccesso di 3 volte (come determinato dalle unità di attività) e incubare a 37 °C per 1 ora.
      8. Rimuovere la DNasi I aggiungendo perle di streptavidina-agarosio in eccesso, incubando per 5 minuti e pellettando mediante centrifugazione a 10.000 x g per 1,5 minuti.
      9. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo.
   2. Preparare lo sferoplasto ricevente.
      1. Coltivare 5 mL di cellule riceventi naive in YPD fino alla fase esponenziale media (OD₆₀₀ che varia da 0,5 a 1).
      2. Raccogliere per centrifugazione (3.000 x g per 4 min) e lavare 4 volte: due volte in H₂O e due volte in 1 M di sorbitolo.
      3. Risospendere le cellule in 1 M di sorbitolo contenente 200 U/mL di enzima litico di lievito e incubare per 15 minuti a 35 °C per digerire le pareti cellulari.
      4. Raccogliere gli sferoplasti risultanti con una centrifugazione delicata a 600 x g per 5 minuti e lavare con 1 mL di sorbitolo 1 M e poi di nuovo con 1 mL di tampone STC (1 M di sorbitolo, 10 mM Tris pH 7,5 e 10 mM CaCl₂).
      5. Risospendere gli sferoplasti lavati in 50 μL di tampone STC.
         NOTA: Utilizzare le forbici per tagliare gli ultimi ~0,7 cm di un puntale per pipetta; Questo creerà una bocca più ampia e impedirà la lisi degli sferoplasti.
   3. Trasforma le cellule ingenue con le proteine.
      1. Trasformare 50 μL di aliquote di spheroplast con 50 μL di lisato di donatore, 20 μL di DNA spermatico di salmone (2 mg/mL) e 5 μL di un plasmide di selezione marcato con URA3 (ad es. pAG426-GFP)^28,33.
      2. Incubare la miscela a 25 °C per 30 minuti.
      3. Centrifugare per 5 minuti a 600 x g per raccogliere gli sferoplasti e risospendere in 150 μL di tampone SOS (1 M di sorbitolo, 7 mM di CaCl₂, 0,25% di estratto di lievito e 0,5% di peptone).
      4. Recuperare per 30 minuti a 30 °C.
      5. Piastra l'intera coltura su piastre SD-URA.
      6. Sovrapporre rapidamente la coltura placcata con sd-ura caldo (~45 °C) contenente lo 0,8% di agar.
         Nota: questo impedirà agli sferoplasti di scoppiare
      7. Incubare le piastre di trasformazione per 2-3 giorni a 30 °C.
      8. Usando uno stuzzicadenti, prelevare con successo le cellule in crescita dalla piastra sovrapposta e ri-striare in singole colonie su piastre SD-URA.
      9. Scegli dozzine di colonie per ciascuna e striscia su piastre 5-FOA per eliminare il plasmide portatore marcato URA3.
      10. Prelevare le colonie che crescono sulle piastre 5-FOA e verificare il trasferimento di stati fenotipici stabili utilizzando il test di crescita, come prima (passaggio 1.13).

È noto che la sovraespressione delle proteine altera drasticamente i fenotipi cellulari27. Infatti, con un approccio di screening iniziale, centinaia di nuovi fenotipi sono stati recuperati in modo riproducibile dalla sovraespressione di cloni dal lievito ORFeome utilizzando solo dieci fattori di stress. Tuttavia, i saggi sopra descritti consentono di valutare se le cellule conservano fenotipi stabili a lungo termine dopo questa sovraespressione. Una proteina in grado di codificare un tale stato è Psp1. Psp1 è una proteina di funzione sconosciuta che può sopprimere i mutanti nel meccanismo di replicazione (ad esempio, in pol alpha34). La sovraespressione di PSP1 ORF modula i fenotipi cellulari in una varietà di fattori di stress. Sorprendentemente, un fenotipo (resistenza al cloruro di manganese) è stato mantenuto per centinaia di generazioni nelle cellule molto tempo dopo che la sovraespressione era cessata (cioè, progenie che non aveva mai sperimentato direttamente l'induzione di Psp1, ma i cui antenati lo avevano fatto) (Figura 1A). L'emivita di Psp1 è ~5 h35, rendendo estremamente improbabile che il fenotipo di resistenza sia dovuto alla propagazione della proteina Psp1 stabile e longeva dalle madri alle loro figlie in questo lasso di tempo (poiché la proteina originale verrebbe degradata entro una manciata di generazioni).

Poiché il fenotipo di resistenza MnCl2 è sorto ad alta frequenza e in molteplici esperimenti indipendenti di sovraespressione transitoria, è estremamente improbabile che questo fenotipo fosse dovuto a mutazioni de novo. Una possibile spiegazione per la natura ereditaria di questo fenotipo è l'induzione di un elemento auto-templante (cioè un prione). Infatti, il contenuto di aminoacidi Psp1 ospita alcuni piccoli tratti di asparagina e glutammina, che ricordano i prioni canonici come [PSI+], che sono guidati da proteine che contengono lunghi tratti di questi amminoacidi. Gli algoritmi predittivi36 valutano l'N-terminale di Psp1 come moderatamente "simile a un prione" (Figura 1B, Rank 173 nel proteoma del lievito). Tuttavia, a differenza delle proteine prioniche canoniche, la proteina Psp1 proveniente da cellule che ospitano lo stato fenotipico stabile non ha formato fibre amiloidi, come giudicato dall'elettroforesi su gel di agarosio semi-denaturante28,37. Per determinare se Psp1 formasse un prione in buona fede, abbiamo testato se il modello di ereditarietà dello stato fenotipico indotto da Psp1 fosse coerente con i tratti distintivi della biologia dei prioni: dipendenza dal meccanismo dell'omeostasi proteica per la propagazione fedele e ereditarietà non mendeliana nella meiosi. Infine, è stato eseguito un test di trasmissione "gold standard" utilizzando solo proteine assemblate.

A differenza delle mutazioni o di altre forme di eredità epigenetica, i prioni dipendono in modo univoco dalla funzione degli chaperoni molecolari e di altri bracci della rete di omeostasi proteica che regolano il ripiegamento delle proteine nella cellula. La maggior parte dei prioni canonici richiede che la disaggregasi Hsp104 agisca sulle fibre amiloidi che adottano. Questo processo genera "semi" ereditabili che trasmettono la conformazione del prione dalle madri alle figlie13. Un'eccezione notevole a questo requisito è il prione [ISP+], che è curabile tramite inibizione Hsp104 ma non richiede la sua attività di disaggregasi per la propagazione38. Inoltre, noi e altri abbiamo recentemente riportato molti esempi di prioni che sono Hsp104-indipendenti e sono invece regolati da altri chaperoni molecolari (principalmente Hsp70 e, in rari casi, Hsp90)25,28. Per prima cosa abbiamo testato se l'ereditarietà della resistenza a MnCl2 indotta da Psp1 dipendesse da Hsp104. Le cellule che ospitavano questo stato sono state fatte passare 3 volte su terreno ricco (YPD) integrato con una bassa dose di guanidina cloridrato (un inibitore di Hsp104). Abbiamo quindi riportato le cellule al terreno ricco standard per ripristinare la piena funzione di Hsp104. Questo regime non ha influenzato l'ereditabilità della resistenza MnCl2 indotta da Psp1, stabilendo che lo stato cellulare era indipendente da Hsp104 (Figura 2).

Successivamente, è stato impiegato un approccio di incrocio per verificare se lo stato fenotipico indotto da Psp1 dipendesse da Hsp70. Le cellule resistenti a MnCl2 sono state accoppiate con un ceppo carente di Hsp70, con delezioni genetiche in due dei quattro paraloghi di lievito Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ). I diploidi sono stati selezionati e poi sporulati per generare spore aploidi. Abbiamo testato il mantenimento dello stato Psp1-dipendente e abbiamo scoperto che il fenotipo di resistenza MnCl2 indotto da Psp1 era stato completamente eliminato nelle spore che ospitavano la doppia delezione ssa1Δ ssa2Δ (Figura 2). Pertanto, lo stato fenotipico indotto da Psp1 richiede che l'attività di Hsp70 passi da una generazione all'altra.

Un'altra caratteristica distintiva dei prioni è un modello di ereditarietà non mendeliano. I caratteri codificati dalle mutazioni nel DNA segregano 2:2 negli incroci meiotici: metà della progenie eredita un allele parentale e l'altra metà eredita l'altro allele parentale. L'ereditarietà dei prioni, al contrario, non dipende da cambiamenti nel DNA, ma piuttosto da cambiamenti trasmissibili nella conformazione delle proteine. Pertanto, sono ereditati dalla maggior parte, se non da tutte, le progenie meiotiche in incroci genetici (ereditarietà 3:1 o 4:0)39. Abbiamo testato il modello di ereditarietà della resistenza MnCl2 indotta da Psp1 incrociando ceppi che ospitano lo stato con controlli naive del tipo di accoppiamento opposto. I diploidi risultanti sono stati sporulati e testati per la presenza del fenotipo di resistenza Psp1 MnCl2 all'interno di spore derivate dalle stesse tetradi. Tutte le spore provenienti da 2 tetradi separate in cui un genitore ospitava lo stato epigenetico Psp1-dipendente hanno ereditato il corrispondente fenotipo di resistenza MnCl2 (Figura 2). Al contrario, nessuna cellula proveniente da incroci di controllo naive ha mostrato il fenotipo. Questi dati stabiliscono che lo stato fenotipico indotto da Psp1 non è codificato da una mutazione basata sul DNA. Tuttavia, è importante notare che mentre lo stato Psp1 non è codificato nel DNA, lo stato richiede la presenza continua del gene PSP1. L'incrocio dello stato fenotipico Psp1-dipendente in un background genetico privo del gene PSP1 (psp1Δ) ha eliminato ereditabilmente il fenotipo di resistenza MnCl2 (Figura 2). Pertanto, la sovraespressione di Psp1 non orchestra semplicemente la formazione di un ciclo di feedback altamente stabile che funziona autonomamente di Psp1 una volta avviato.

La definizione stessa di ereditarietà basata sulle proteine è la trasmissione di tratti stabili alla progenie utilizzando solo proteine assemblate come materiale ereditabile. Per eseguire tali "trasformazioni proteiche", è stato utilizzato un metodo agnostico rispetto alla stechiometria, alla modifica o all'interazione delle proteine40,41. Colture separate di cellule che ospitavano lo stato fenotipico indotto da Psp1 e i controlli naïve sono state coltivate fino alla fase esponenziale media e le loro pareti cellulari sono state lisate per generare sferoplasti donatori. Questi sferoplasti sono stati quindi sonicati e fatti girare per pellettare i detriti cellulari risultanti. Infine, i lisati rimanenti sono stati sottoposti a sovradigestione sia con RNasi che con DNasi per sradicare l'acido nucleico (per facilitare le fasi successive del protocollo, l'enzima DNasi biotinilato è stato successivamente rimosso tramite purificazione per affinità).

Questi lisati impoveriti di acido nucleico sono stati utilizzati per trasformare le cellule ingenue. Per favorire l'assorbimento dei "semi" proteici ereditabili, le pareti cellulari dei riceventi naïve sono state digerite enzimaticamente prima della trasformazione. È stato incluso anche un plasmide vettore marcato con URA3 con i lisati del donatore di proteine per consentire la selezione di cellule competenti per l'assorbimento di materiale estraneo. I trasformanti sono stati piastrati su terreno privo di uracile, sono state selezionate colonie resistenti e il plasmide vettore marcato con URA3 è stato rimosso mediante crescita su 5-FOA. È stata quindi esaminata la resistenza delle colonie risultanti al MnCl2. Sorprendentemente, oltre la metà dei trasformanti testati ospitava una resistenza ereditaria di MnCl2 (Figura 3). Al contrario, nessuna cellula trasformata con lisati naive ha mostrato un fenotipo di questo tipo. È importante sottolineare che queste efficienze sono state raccolte da lisati cellulari che esprimono livelli endogeni della proteina Psp1 (~340 molecole per cellula). Questo è notevolmente più efficiente della trasformazione di altri prioni di lievito, come [PSI+]. Questi risultati stabiliscono che Psp1 è in grado di formare un elemento ereditabile a base proteica - un "prione" - d'ora in poi noto come [PSP1+]. Inoltre, la tecnica di trasformazione proteica qui descritta è sufficiente per lo screening dell'ereditarietà non amiloide, indipendente da Hsp104, basata su proteine in modo ad alto rendimento.

Figura 1. La sovraespressione transitoria di PSP1 guida la resistenza ereditaria di MnCl2. (A) Crescita di ceppi non indotti ([psp1-]) e indotti da Psp1 ([PSP1+]) in SD-CSM con 10 mM di MnCl2. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media di tre repliche biologiche. (B) A sinistra: La sequenza di amminoacidi primari Psp1 ha un punteggio altamente simile ai prioni negli algoritmi di previsione dei prioni (PLAAC). A destra: l'analisi rappresentativa del PLAAC per la maggior parte delle proteine induttrici recuperate nel nostro screening non ha previsto praticamente alcuna caratteristica significativa della sequenza simile ai prioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Dipendenza da chaperone Psp1 e modello di ereditarietà. La crescita dei ceppi in SD-CSM con 10 mM di MnCl2, normalizzata a un corrispondente controllo naive [psp1-]. L'inibizione di Hsp104 (GdnHCl "curato") non compromette la resistenza a MnCl2 Psp1-dipendente, mentre la rimozione del chaperone Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ) e del gene PSP1 (psp1Δ) elimina ereditariamente questo fenotipo. Tutte le spore provenienti da singole tetradi di incroci tra ceppi che ospitano lo stato fenotipico Psp1-dipendente e ceppi naïve mostrano una resistenza a MnCl2, indicando un'ereditarietà non mendeliana (4:0) del fenotipo (n=2 tetradi). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media di tre repliche biologiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Trasmissione dello stato fenotipico dipendente da Psp1 tramite "semi" proteici ereditabili. Tassi di infettività per la trasformazione proteica confrontando i lisati mock ([psp1-]) e [PSP1+]- come materiale trasmissibile. L'infettività è calcolata come la percentuale di trasmissione divisa per la quantità di proteina seminata utilizzata. Oltre il 53% delle cellule naive trasformate con [PSP1+] seminate ha ricevuto il corrispondente fenotipo di resistenza MnCl2, mentre nessuna cellula trasformata con [psp1-] ha mostrato resistenza MnCl2 (p=7,4 x 10-4 secondo il t-test di Student). Il tasso di infettività del prione di lievito precedentemente caratterizzato [PSI+] viene visualizzato tramite la linea orizzontale tratteggiata40. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.