Method Article

High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive una metodologia di alto-rendimento allo schermo funzionalmente per base di proteine di ereditarietà in S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La codifica di informazioni biologiche che sono accessibile alle generazioni future è generalmente ottenuta tramite modifiche alla sequenza di DNA. Longeva eredità codificati in proteina conformazione (anziché sequenza) lungamente è stato osservato come lo spostamento di paradigma, ma rara. Esempi di tali elementi epigenetici meglio caratterizzati sono i prioni, che possiedono un comportamento auto-assemblante che può guidare la manifestazione ereditabile di nuovi fenotipi. Molti prioni archetipici visualizzare un notevole pregiudizio sequenza N/Q-ricco e assemblare un ovile dell'amiloide. Queste caratteristiche insolite hanno informato la maggior parte degli sforzi di screening per identificare nuove proteine prioniche. Tuttavia, almeno tre prioni noti (tra cui il prione fondatore, PrPSc) non porto queste caratteristiche biochimiche. Abbiamo pertanto sviluppato un metodo alternativo per sondare l'ambito dell'eredità a base di proteine basata su una proprietà di azione di massa: la sovraespressione transiente di proteine prioniche aumenta la frequenza in cui acquisiscono una conformazione di auto-applicazione di modelli. Questo articolo descrive un metodo per analizzare la capacità del lievito ORFeome a suscitare l'ereditarietà a base di proteine. Utilizzando questa strategia, abbiamo trovato in precedenza che > 1% di proteine del lievito potrebbe alimentare l'emergere dei tratti biologici che erano longevi, stabile e ha presentato più di una mutazione genetica. Questo approccio può essere impiegato in elevato throughput attraverso ORFeomes intero o come un paradigma di screening mirato per reti genetiche specifiche o stimoli ambientali. Come schermi genetici avanti definiscono numerose vie di segnalazione e di sviluppo, queste tecniche forniscono una metodologia per indagare l'influenza dell'eredità di base di proteine nei processi biologici.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistemi biologici spesso esperienza transitorie fluttuazioni in abbondanza di proteine. Se questi hanno un impatto duraturo nel plasmare il fenotipo di un organismo o delle generazioni future rimane poco chiaro. I più noti casi di questa biologia coinvolgono una rara classe di proteine, i prioni, che guidano l'emergere dei tratti ereditari senza alcuna modifica del genoma. Invece, queste particelle di fectious proteinaceous e neltrasmettono fenotipi tramite auto-perpetuante cambiamenti di conformazione della proteina1,2. Questo tipo di ereditarietà è stato scoperto come la causa dei modelli di ereditarietà insoliti di una devastante malattia neurodegenerative. Tuttavia, gli studi negli organismi che variano dai funghi ai mammiferi3,4,5,6,7,8,9,10 da allora hanno rivelato che il prione-come gli elementi possono conferire valore adattativo. Ciò nonostante, i prioni sono stati visti come un affascinante ma rara stranezza biologica.

Questa saggezza prevalente si svolge in parte perché la caratterizzazione di base proteica eredità lungo è stata limitata da un piccolo insieme di esempi. I recenti sforzi di screening sistematico hanno ampliato significativamente questa immagine individuando diversi nuovi bona fide prioni11 e quasi due dozzine di proteina domini12 con la capacità di conversione conformazionali del prione-come combustibile. Tuttavia, poiché questi approcci sono generalmente concentrati su pregiudizi di sequenza dell'amminoacido forte, i prioni che sono stati scoperti condividono le proprietà biochimiche del fondatore lievito prioni [PSI+]13,14, [URE3]15e [RNQ+]11,16. Questi includono: 1) modulare domini che sono ricchi di tratti lungo polimerici di asparagina (N) e glutammina (Q), 2) assembly in un amiloide [PRION+] conformazione17,18,19e 3) completano dipendenza da disaggregase funzione di Hsp104 per la propagazione di fedeli da madre a figlia13,20,21. Infatti, molti bona fide prioni, tra cui [GAR+], [Het-s] e anche l'originale del prion (PrPSc), sarebbe saltato sotto tali criteri rigorosi. Forse ancora più importante, sarebbero in grado di catturare qualsiasi nuovi meccanismi di ereditarietà su base proteica22. Quindi, l'ampiezza biologica vera di tali fenomeni può essere molto più comune in natura di quanto si pensasse.

Per studiare questa domanda, una strategia di alto-rendimento, tutto il proteoma è stato impiegato. Un segno distintivo di tutti i prioni, tra cui PrPSc, [GAR+], e [Het-s], è che la sovraespressione transitoria delle proteine causale aumenta fortemente il tasso del prione acquisizione15,23,24,25,26. Abbiamo approfittato di questa funzionalità per sistematicamente chiedere, su tutto il lievito ORFeome, se stati stabili basati su proteine, epigenetici potrebbero essere iniziati inducendo transitoriamente la sovraespressione delle singole proteine. È ben noto che la sovraespressione della proteina può alterare fenotipi27. Tuttavia, proteine prioniche sono insoliti perché loro sovrapproduzione temporanea produce un cambiamento nel fenotipo che è ereditabile per molte centinaia di generazioni dopo la sovraespressione iniziale. Abbiamo precedentemente preso vantaggio di questa funzione, così come i modelli di ereditarietà insoliti di elementi genetici basati su proteine, per identificare decine di proteine che sono in grado di heritably necessità di cablaggio fenotipiche paesaggi senza alterare il genoma28. Anche se alcuni identificati proteine precedentemente erano conosciuti come i prioni, la maggior parte erano non, sottolineando la potenza di questo approccio per scoprire nuove forme di ereditarietà a base di proteine.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sovraespressione iniziale

  1. Trasformare le cellule di lievito (in questo caso, BY4741 MAT a aploidi) precedentemente coltivate in YPD liquido (10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone e 20 g di glucosio per 1 L) con i costrutti candidati desiderati dalla libreria FLEXGene ORFeome (ORF di lievito sotto il controllo di un promotore inducibile dal galattosio nella spina dorsale plasmidico centromerica marcata con URA3, pBY01129).
  2. Usa stuzzicadenti autoclavati per prelevare quattro colonie separate da queste trasformazioni che fungano da repliche biologiche. Coltivali per 48-72 ore in 150 μL di SRaffinosio-URA (0,74 g di CSM-URA, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi e 20 g di raffinosio per 1 L) in piastre a 96 pozzetti. Inoculare le colonie dal primo ORF nel pozzetto A1 di tutte le piastre, le colonie dal secondo ORF in A2 di tutte le piastre, ecc.
    NOTA: Tutte le fasi di crescita sono condotte a 30 °C e a livelli atmosferici di CO2 (407,05 ppm), se non diversamente specificato.
  3. Verificare che le colture siano sature (cellule visibili a occhio nudo sul fondo di ciascun pozzetto) e utilizzare un robot per la manipolazione dei liquidi per inoculare un array 1:4 di 1 μL da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti in 4 pozzetti separati di una piastra da 384 pozzetti riempita con 45 μL di SGal-URA (0,74 g di CSM-URA, 6,7 g di lievito base azotata senza aminoacidi e 20 g di galattosio per 1 L) per pozzetto.
    NOTA: Questo crea una piastra composita in cui 4 repliche biologiche di ciascun ORF sono disposte in uno schema quadrato.
  4. Allo stesso tempo, preparare piastre separate da 384 pozzetti contenenti 45 μL di SGal-URA con i fattori di stress di interesse (ad esempio, cloruro di manganese a 20 mM) per pozzetto. Inoculare questa piastra nello stesso modo utilizzato al punto 1.3.
    NOTA: Per ottenere il massimo intervallo dinamico per la rilevazione fenotipica, si raccomanda una serie di diluizioni di 2 volte intorno alla concentrazione di LD50 di un determinato fattore di stress. Questo può essere fatto in anticipo per determinare la concentrazione ottimale alla quale osservare sia la crescita aumentata che quella ridotta.
  5. Come controllo parallelo finale, inoculare una terza piastra da 384 pozzetti nello stesso modo, con lo stesso fattore di stress incluso nel terreno che non indurrà l'espressione plasmidica. Assicurarsi che la piastra contenga 45 μL di SD-URA (0,74 g di CSM-URA, 6,7 g di base azotata di lievito senza amminoacidi e 20 g di glucosio per 1 L) per pozzetto e che sia inoculata come nei passaggi 1.3 e 1.4.
  6. Posizionare immediatamente le piastre con le celle su un impilatore di micropiastre e impostare il protocollo per un ciclo continuo di 72 ore, misurando l'OD600 con un lettore di micropiastre dotato di impilatori a temperatura ambiente e CO2 atmosferica (407,05 ppm).
    Nota: la frequenza della misurazione della crescita dipenderà dal numero di piastre (determinato in ultima analisi dal numero di geni e condizioni che il ricercatore desidera sondare) utilizzate nella corsa. Più piastre vengono utilizzate, più tempo impiegherà il lettore di piastre a completare un ciclo e quindi maggiore sarà il tempo tra le misurazioni (il tempo di misurazione per piastra è di ~45 s, a seconda della strumentazione impiegata).
  7. Dopo le misurazioni della crescita, utilizzare lo stesso robot di manipolazione dei liquidi per trasferire 1 μL per pozzetto delle colture indotte da SGal-URA (cioè quelle che hanno sperimentato una sovraespressione proteica) in nuove piastre da 384 pozzetti contenenti 45 μL di SD-URA per pozzetto (terreno che non consente l'espressione proteica del plasmide).
    1. Parallelamente, eseguire inoculazioni analoghe di una seconda serie di piastre da 384 pozzetti contenenti 45 μL di SD-URA per pozzetto dalle colture che sono state coltivate in SD-URA in presenza dei fattori di stress (cioè quelli della fase 1.5).
    2. Far crescere le piastre per 48 ore a 30 °C fino alla saturazione in una camera umidificata (cioè un bidone di plastica sigillabile con un tovagliolo di carta umido all'interno).
  8. Prendere le piastre del passaggio precedente e reinoculare 1 μL per pozzetto in piastre da 384 pozzetti contenenti 45 μL di SD-URA. Quindi, eseguire un reinoculo separato di 1 μL per pozzetto dalla stessa piastra sorgente in una piastra separata da 384 pozzetti contenente 45 μL di SD-URA con il fattore di stress.
    NOTA: Questo determinerà se i fenotipi di sensibilità/resistenza a un fattore di stress persistono dopo che la sovraespressione della proteina è cessata.
  9. Posizionare immediatamente le piastre con le celle su un impilatore di micropiastre e impostare il protocollo per un ciclo continuo di 48 ore che misura l'OD600 con un lettore di micropiastre a temperatura ambiente e CO2 atmosferica (407,05 ppm).
  10. Esporta le misurazioni del tempo rispetto a OD600 come tabella XY utilizzando il software di lettura delle piastre. Raggruppare le colonne dell'OD600 per ogni replica biologica e calcolare la media. Crea un grafico XY del tempo rispetto a OD600 per generare curve di crescita.
    1. Confrontare i tassi di crescita delle colture che erano state sottoposte a una sovraespressione passata (cioè quelle originariamente indotte in terreno contenente galattosio prima del reinoculo in SD-URA) rispetto alle colture che non lo erano state (cioè quelle propagate nel glucosio), come descritto in precedenza30.
  11. Per le colture che mostrano differenze di crescita significative in risposta a un dato fattore di stress, dipendenti dalla sovraespressione della proteina ancestrale, prelevare 1 μL da ciascuna replicazione biologica, diluirlo in 10 mL di acqua e quindi impiattare 50 μL su piastre contenenti 5-FOA (0,74 g di CSM-URA, 1 g di 5-FOA, 50 mg di uracile, 6,7 g di lievito base azotata senza aminoacidi, 20 g di glucosio e 20 g di agar per litro). Crescere a 30 °C per 3 giorni.
    1. Se ciò si traduce in un numero eccessivo o insufficiente di colonie per piastra, regolare il fattore di diluizione di conseguenza.
      Nota: il 5-FOA viene convertito in un intermedio tossico dalla via di biosintesi dell'uracile. Ciò causerà una perdita del plasmide di espressione marcato con URA3 trasformato nella prima fase.
  12. Prelevare 8-32 colonie singole con stuzzicadenti autoclavati e fissarle su piastre a 96 pozzetti contenenti 150 μl di SD-CSM. Crescere fino alla saturazione per 48-72 ore in una camera umidificata a 30 °C. Utilizzare queste colture per inoculare due nuove serie di piastre da 96 pozzetti contenenti 150 μl di SD-CSM, sia con che senza i fattori di stress del passaggio 1.11.
  13. Posizionare le piastre su un impilatore di micropiastre e impostare il protocollo per misurare l'OD600 su un ciclo continuo di 48 ore.
  14. Analizzare i dati come nel passaggio 1.10 e confermare che le differenze di crescita significative osservate nel passaggio 1.10 si mantengono dopo la perdita di plasmidi.
    NOTA: Queste cellule ospitano stati fenotipici stabili che potrebbero essere indicativi di un'ereditarietà basata sulle proteine.
  15. Testare le cellule che hanno mantenuto i fenotipi indotti per i classici segni distintivi dell'ereditarietà basata sulle proteine (vedi sotto).

2. Test per l'ereditarietà simile ai prioni

  1. "Cura" mediata da chaperone
    1. Testare la dipendenza dell'chaperone Hsp104.
      1. Prelevare una colonia di un ceppo di lievito che presenta uno stato fenotipico stabile, passare a singole colonie su una piastra YPD (10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 g di glucosio e 20 g di agar per 1 L) contenente 3 mM di GdnHCl e far crescere a 30 °C per 3 giorni. Parallelamente, escludi una colonia da un ceppo naïve a singole colonie su YPD+ 3 mM GdnHCl come controllo allo stesso modo.
      2. Ripetere altre 2 volte su piastre YPD fresche contenenti 3 mM di GdnHCl.
      3. Poiché l'esposizione a GdnHCl può aumentare la frequenza con cui insorgono le cellule minuscole, prelevare più colonie che hanno subito 3 passaggi su GdnHCl e verificare la respirazione mitocondriale funzionale esaminando la loro capacità di crescere in colonie visibili su piastre di YP-glicerolo (10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 ml di glicerolo e 20 g di agar per 1 L) dopo 7 giorni.
      4. Prelevare colonie multiple dalle piastre di YP-glicerolo e testare il mantenimento di stati fenotipici stabili utilizzando la crescita in presenza del fattore di stress rispetto ai controlli non "curati" e naïve (cioè cellule isogeniche che non ospitano lo stato fenotipico, come BY4741 MATa aploidi) in modo simile a come descritto nel passaggio 1.13.
    2. Testare la dipendenza dell'chaperone Hsp70.
      1. "Curare" tramite un plasmide.
        1. Trasformare sia le cellule naive che le cellule che ospitano stati fenotipici stabili con plasmidi marcati con URA3 che esprimono un allele negativo dominante di Hsp70 (K69M)25,31 da un forte promotore costitutivo (GPD).
        2. Prelevare singoli trasformanti per ciascuno, striare a singole colonie su una piastra SD-URA (0,74 g di CSM-URA, 6,7 g di base azotata di lievito senza amminoacidi, 20 g di glucosio e 20 g di agar per 1 L) e coltivare per 3 giorni a 30 °C e CO2 atmosferica.
        3. Ripetere questa passata altre 2 volte sulle piastre SD-URA.
        4. Scegli più colonie e passa a singole colonie su piastre da 5 FOA per eliminare il plasmide.
        5. Prelevare più colonie singole per ogni isolato e verificare la ritenzione (o la perdita) degli stati fenotipici stabili in modo simile a quanto descritto nel passaggio 1.13.
      2. "Cura" attraverso l'incrocio genetico.
        1. Incrociare ceppi aploidi BY4741 MATche ospitano stati fenotipici stabili e ceppi naive del tipo di accoppiamento opposto (in questo caso, BY4742 MATα) che ospitano delezioni genetiche in due dei quattro paraloghi di lievito Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ).
          NOTA: Questo ceppo è carente nella funzione chaperone Hsp70.
        2. Selezionare per la crescita dei diploidi mediante striature a singole colonie su SD-LYS-MET (0,74 g di CSM-LYS-MET, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 20 g di glucosio e 20 g di agar per 1 L) terreno a doppio dropout.
        3. Raccogliere singole colonie diploidi e crescere per 24 ore a 30 °C in 8 mL di terreno di pre-sporulazione (0,8% di estratto di lievito, 0,3% di peptone, 10% di destrosio e 100 mg/L di adenina solfato).
        4. Centrifugare le colture per 3 minuti a 3.000 xg, aspirare il terreno di pre-sporulazione (pre-SPO) e lavare i pellet una volta con acqua sterile.
        5. Risospendere i pellet in 2 mL di terreno di sporulazione (1% acetato di potassio, 0,1% estratto di lievito, 0,05% glucosio e 0,01% miscela di aminoacidi (2 g di istidina, 10 g di leucina, 2 g di lisina e 2 g di uracile)). Crescere a 25°C per 5 giorni.
        6. Spostare le colture a 30 °C e incubare per altre 48 ore.
        7. Valutare l'efficienza della sporulazione cercando la presenza di tetradi utilizzando un microscopio ottico32.
        8. Prelevare 40 μL di coltura, centrifugare per 1 minuto a 3.000 xg in una provetta da 1,5 mL e risospendere in un volume uguale di miscela di enzimi zimosiasi (1 M di sorbitolo, 0,1 M EDTA e 10 mg/mL di zimoliasi 100T)
        9. Incubare a 25 °C per 5 min.
        10. Applicare 10 μl di coltura digerita su una piastra di agar YPD molto asciutta e molto livellata e lasciare che la coltura si diffonda lentamente lungo la piastra in linea retta.
        11. Lasciare asciugare le piastre per almeno 30 minuti in una cappa a flusso laminare.
        12. Usando un microscopio da dissezione, separare le spore in tetradi e disporle sulla piastra.
        13. Lasciare che le singole spore aploidi crescano in colonie e testare la loro capacità di crescere su piastre SD-HIS-LEU (0,67 g di CSM-HIS-LEU, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 20 g di glucosio e 20 g di agar per 1 litro), indicando che ospitano entrambe le delezioni genetiche (ssa1Δ ssa2Δ).
        14. Testare ciascuno di essi per il mantenimento dello stato fenotipico nel background con deficit di Hsp70 in modo simile a quanto descritto nel passaggio 1.13.
          NOTA: L'incrocio di queste spore con un ceppo wildtype con funzione Hsp70 ripristinata non dovrebbe ripristinare il fenotipo prionico.
  2. Test per l'ereditarietà non mendeliana.
    1. Incrocia BY4741 MAT, un ceppo aploide che ospita stati fenotipici stabili e controlli naive isogenici, con un ceppo naive isogenico del tipo di accoppiamento opposto (in questo caso, BY4742 MATα).
    2. Selezionare per la crescita dei diploidi mediante striature a singole colonie su terreno SD-LYS-MET a doppio forcellino.
    3. Raccogliere singole colonie diploidi e coltivare per 24 ore a 30 °C in 8 mL di terreno di pre-sporulazione.
    4. Ripetere i passaggi 2.2.2.3-2.2.2.12, come descritto sopra.
    5. Lasciare che le singole spore aploidi crescano in colonie e testare ciascuna per il mantenimento dello stato fenotipico attraverso la meiosi utilizzando il test di crescita, come nel passaggio 1.13.
      Nota: Un'altra caratteristica distintiva dei prioni è che possono essere eliminati ereditabilmente attraverso la rimozione della proteina casuale originale. Quindi, l'incrocio analogo di un ceppo di prioni con un ceppo che ospita una delezione genetica della proteina indotta originale abrogherà i fenotipi prionici nelle spore che ereditano la delezione. Si noti anche che è possibile che il prione venga mantenuto in uno stato "criptico" in un tale mutante se il gene eliminato è necessario per manifestare il fenotipo del prione ma non per propagare il prione stesso. Per distinguere tra queste due possibilità, incrociare le spore con un ceppo wildtype naïve e verificare se il fenotipo del prioni riemerge in un background genetico diploide, dove la funzione del gene è stata ripristinata.
  3. Citoduzione.
    1. Genera il ceppo ricevente BY4742 iniziale.
      1. Attraverso la trasformazione, introdurre un allele KAR difettoso (kar1-15) che impedisce la fusione nucleare durante l'accoppiamento23.
      2. Rendi questo ceppo "piccolo" (cioè incompetente per la respirazione mitocondriale) inoculando una singola colonia in brodo YPD con lo 0,25% di bromuro di etidio.
      3. Far crescere la coltura a 30 °C fino alla fase esponenziale/stazionaria tardiva (OD600 ~1).
      4. Diluire 1:1.000 in YPD fresco con bromuro di etidio allo 0,25% e ripetere due volte.
      5. Una volta che la coltura raggiunge la fase esponenziale tardiva/stazionaria precoce (OD600 0,8-1,2), piastra in singole colonie diluendo 1:10.000 in acqua sterile e piastrando 50 μl su una piastra YPD. Dopo aver coltivato per 3 giorni a 30 °C, raccogli più colonie e testa ciascuna di esse per l'incompetenza respiratoria esaminando la loro capacità di crescere in colonie visibili su piastre di YP-glicerolo dopo 7 giorni.
    2. Eseguire la citoduzione iniziale in BY4742.
      1. Mescolare le cellule del ceppo BY4741 del donatore che ospitano uno stato fenotipico stabile con le cellule del ceppo naive BY4742 kar1-15 ricevente sulla superficie di una piastra di agar YPD.
      2. Coltivare per 24 ore a 30 °C e CO2 atmosferica (407,05 ppm) e trasferire in terreno di uscita della metionina contenente glicerolo (SGly-MET: 0,74 g di CSM-MET, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 20 ml di glicerolo e 20 g di agar per 1 L).
        NOTA: Questo seleziona entrambi i marcatori nucleari BY4742, oltre a consentire il ripristino dei mitocondri funzionali attraverso lo scambio citoplasmatico.
      3. Dopo 3-5 giorni, prelevare più colonie singole ed eseguire un altro ciclo di selezione su SD-MET (0,74 g di CSM-MET, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 20 g di glucosio e 20 g di agar per 1 L).
      4. Parallelamente, confermare che le colonie non sono diploidi passando su SD-LYS-MET medium.
    3. Eseguire citoduzioni inverse.
      1. Mescola i nuovi ceppi donatori (questa volta, i citoducenti kar1-15 di successo BY4742) con piccole cellule naive BY4741 (generate come sopra) su agar YPD.
      2. Ripeti le citoduzioni, come descritto in precedenza (passaggi 2.3.2.1-2.3.2.4), ad eccezione della selezione dei marcatori nucleari riceventi di BY4741 su terreno glicerico privo di lisina (SGly-LYS: 0,74 g di CSM-LYS, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 20 ml di glicerolo e 20 g di agar per 1 L).
      3. Prelevare più citoduttanti e verificare il mantenimento di stati fenotipici stabili utilizzando il test di crescita, come prima nel passaggio 1.13.
  4. Trasformazione delle proteine.
    1. Preparare il lisato.
      1. Coltivare 50 mL di cellule che ospitano stati fenotipici stabili in YPD per 18 ore a 30 °C.
      2. Pellettare le colture a 3.000 x g per 4 minuti e poi lavare due volte: una volta in H2O autoclavato e poi in 1 M di sorbitolo.
      3. Risospendere le cellule in 200 mL di tampone SCE (1 M di sorbitolo, 10 mM EDTA, 10 mM di DTT, 100 mM di citrato di sodio e 1 compressa di inibitore della proteasi mini-EDTA free per 50 mL, pH 5,8) con 50 U/mL di enzima litico 100T del lievito.
      4. Incubare la miscela a 35 °C per 30 minuti.
      5. Sonica le celle a 20 kHz e 20% di intensità per 10 s sul ghiaccio con un dismembratore sonico.
      6. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 10.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
      7. Spostare i surnatanti in una provetta pulita e aggiungere RNasi I e DNasi biotinilata in eccesso di 3 volte (come determinato dalle unità di attività) e incubare a 37 °C per 1 ora.
      8. Rimuovere la DNasi I aggiungendo perle di streptavidina-agarosio in eccesso, incubando per 5 minuti e pellettando mediante centrifugazione a 10.000 x g per 1,5 minuti.
      9. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo.
    2. Preparare lo sferoplasto ricevente.
      1. Coltivare 5 mL di cellule riceventi naive in YPD fino alla fase esponenziale media (OD600 che varia da 0,5 a 1).
      2. Raccogliere per centrifugazione (3.000 x g per 4 min) e lavare 4 volte: due volte in H2O e due volte in 1 M di sorbitolo.
      3. Risospendere le cellule in 1 M di sorbitolo contenente 200 U/mL di enzima litico di lievito e incubare per 15 minuti a 35 °C per digerire le pareti cellulari.
      4. Raccogliere gli sferoplasti risultanti con una centrifugazione delicata a 600 x g per 5 minuti e lavare con 1 mL di sorbitolo 1 M e poi di nuovo con 1 mL di tampone STC (1 M di sorbitolo, 10 mM Tris pH 7,5 e 10 mM CaCl2).
      5. Risospendere gli sferoplasti lavati in 50 μL di tampone STC.
        NOTA: Utilizzare le forbici per tagliare gli ultimi ~0,7 cm di un puntale per pipetta; Questo creerà una bocca più ampia e impedirà la lisi degli sferoplasti.
    3. Trasforma le cellule ingenue con le proteine.
      1. Trasformare 50 μL di aliquote di spheroplast con 50 μL di lisato di donatore, 20 μL di DNA spermatico di salmone (2 mg/mL) e 5 μL di un plasmide di selezione marcato con URA3 (ad es. pAG426-GFP)28,33.
      2. Incubare la miscela a 25 °C per 30 minuti.
      3. Centrifugare per 5 minuti a 600 x g per raccogliere gli sferoplasti e risospendere in 150 μL di tampone SOS (1 M di sorbitolo, 7 mM di CaCl2, 0,25% di estratto di lievito e 0,5% di peptone).
      4. Recuperare per 30 minuti a 30 °C.
      5. Piastra l'intera coltura su piastre SD-URA.
      6. Sovrapporre rapidamente la coltura placcata con sd-ura caldo (~45 °C) contenente lo 0,8% di agar.
        Nota: questo impedirà agli sferoplasti di scoppiare
      7. Incubare le piastre di trasformazione per 2-3 giorni a 30 °C.
      8. Usando uno stuzzicadenti, prelevare con successo le cellule in crescita dalla piastra sovrapposta e ri-striare in singole colonie su piastre SD-URA.
      9. Scegli dozzine di colonie per ciascuna e striscia su piastre 5-FOA per eliminare il plasmide portatore marcato URA3.
      10. Prelevare le colonie che crescono sulle piastre 5-FOA e verificare il trasferimento di stati fenotipici stabili utilizzando il test di crescita, come prima (passaggio 1.13).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

È noto che la sovraespressione delle proteine altera drasticamente i fenotipi cellulari27. Infatti, con un approccio di screening iniziale, centinaia di nuovi fenotipi sono stati recuperati in modo riproducibile dalla sovraespressione di cloni dal lievito ORFeome utilizzando solo dieci fattori di stress. Tuttavia, i saggi sopra descritti consentono di valutare se le cellule conservano fenotipi stabili a lungo termine dopo questa sovraespressione. Una proteina in gr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I prioni lievito primi sono stati identificati dai loro fenotipi insoliti e perplessi modelli di ereditarietà. Le caratteristiche di questi prioni furono poi utilizzate per costruire algoritmi e strumenti computazionali alla schermata per proteine prioniche aggiuntive. Il metodo descritto qui, al contrario, è sperimentale e si basa sulla sovraespressione transitoria per creare un duraturo cambiamento-a stabile stato codificato nella conformazione della proteina. Tuttavia, se l'efficienza di "semina" Assemblea del prion d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She e Susan Lindquist per la loro assistenza nello sviluppo i dosaggi utilizzati in questa carta, come pure gli utenti per i loro commenti riflessivo.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cloridrato di guanidinaSigmaCat#G3272-25GCloruro
manganeseSigmaCat#M8054-100GBromuro di
etidiochimico SigmaE1510Acido
5-fluorooroticoSigmaCat#F5013-50MGChimico
BY4741 MATa (his3Δ 1 leu2Δ 0 LYS2 met15Δ 0 ura3Δ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/ACeppo
di lievito BY4741 MATα (il suo3Δ 1 leu2Δ 0 lys2Δ 0 MET15 ura3Δ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/ACeppo di lievito
Hsp70 (K69M) Jarosz et al., 2014bN/ALibreria plasmidico
FLEXGeneHu et al., 2007N/ALibreria plasmidico
Destrosio (glucosio)Fisher ScientificD16-3Componente del terreno
RaffinosioSigmaR0250-25GComponente del terreno
GalattosioFisher ScientificBP656-500Componente del supporto
CSMSunrise Science1001-100Componente multimediale
CSM-URASunrise Science1004-100Componente multimediale
CSM-LYSSunrise Science1032-100Componente multimediale
CSM-METSunrise Science1019-100Componente multimediale
CSM-LYS-METSunrise Science1035-100Componente multimediale
estratto di lievitoFisher ScientificBP1422-2Componente media
peptoneResearch Products InternationalP20240-5000Componente media
bacto-peptoneBD211677Componente media
gliceroloEMD MilliporeGX0185-2Componente media
lievito base di azoto senza aminoacidiBD291920Componente media
agarIBI ScientificIB49172Componente del terreno
Adenina solfatoSigmaA3159-25GComponente del terreno
Acetato di potassioSigmaP1190-500GComponente del terreno
UracilSigmaU0750-100GComponente del terreno
IstidinaSigmaH8000-100GComponente del terreno
LeucinaSigmaL8000-25GComponente multimediale
LisinaSigmaL5501-25GComponente multimediale
RNase I Thermo Fisher ScientificEN0601Enzima
biotinilato DNasiThermo Fisher ScientificAM1906Enzima
zimoliasi 100T (enzima litico del lievito)Sunrise ScienceN0766555Lettore di micropiastre enzimatico
BioTekSynergy H1Impilatore
micropiastreBioTek BioStack3Piastra per apparecchiature
riempitriceBiotTekEL406Attrezzatura
Robot per la manipolazione dei liquidiBeckman CoulterBiomek FXAttrezzatura
di chimico chimico di

References

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