Qui, presentiamo una nuova applicazione del dosaggio anello aortico dove prelabelled le cellule mesenchimali sono co-coltivate con reti endoteliali derivati dell'aorta di ratto. Questo metodo novello permette la visualizzazione di homing delle cellule stromali mesenchimali (MSCs) e integrazione con le reti endoteliale, quantificazione delle proprietà della rete e la valutazione di MSC immunophenotypes ed espressione genica.
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Articolo metodologico
L'analisi di co-coltura di anello aortico: Un comodo strumento per valutare il potenziale angiogenico delle cellule stromali mesenchimali In Vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'angiogenesi è un processo complesso e altamente regolato, responsabile della fornitura e del mantenimento di aspersione sufficiente del tessuto. Manutenzione insufficiente vascolarizzazione e malformazioni patologiche possono provocare gravi malattie ischemiche, mentre eccessivamente abbondante sviluppo vascolare è associato con cancro e disordini infiammatori. Una promettente forma di terapia pro-angiogenica è l'uso di fonti di cellule angiogeniche, in grado di fornire fattori di regolazione, nonché supporto fisico per lo sviluppo recente di sistema vascolare.
Cellule stromali mesenchimali (MSCs) sono candidati estesamente esaminatori per rigenerazione vascolare a causa dei loro effetti paracrini e la loro capacità di rilevare e casa ai tessuti ischemici o infiammati. In particolare, primo acetonide del cordone ombelicale cellule perivascolari (FTM HUCPVCs) sono un candidato molto promettente dovuto loro pericyte-come proprietà, alto potenziale proliferativo e multilineare, proprietà immunitario privilegiato e robusta paracrine profilo. Per valutare efficacemente potenzialmente angiogenici rigenerativa cellule, è un requisito di testare loro in affidabile e "traducibile" analisi pre-clinica. L'analisi aortica dell'anello è un ex vivo modello di angiogenesi che consente facile quantificazione delle strutture endoteliali tubolari, fornisce accessorie supporto cellule e matrice extracellulare (ECM) dall'host, esclude le componenti infiammatorie ed è veloce e poco costoso per impostare. Questo è vantaggioso rispetto ai modelli in vivo (ad es., analisi cornea, analisi della spina di Matrigel); l'analisi aortica dell'anello può seguire le cellule amministrate e osservare interazioni intercellulari, evitando il rigetto immunitario xeno.
Vi presentiamo un protocollo per una nuova applicazione del test anello aortico, che comprende MSCs umane in co-colture con sviluppo delle reti endoteliali aortiche di ratto. Questo test permette l'analisi del contributo MSC alla formazione e sviluppo attraverso interazioni fisiche pericyte-come del tubo e della loro potenza per attivamente la migrazione ai siti dell'angiogenesi e per valutare la loro capacità di eseguire e mediare Elaborazione di ECM. Questo protocollo fornisce ulteriori informazioni sulle modifiche in MSC fenotipo ed espressione genica dopo co-coltura.
Introduzione
Il complesso processo di angiogenesi migliora e mantiene perfusione tissutale, promuovendo lo sviluppo dei vasi sanguigni nuovi da preesistente sistema vascolare1. È un processo strettamente regolato, equilibrato di fattori pro-angiogenici e anti-angiogenici. Qualsiasi carenza in questo sistema può portare a insufficiente manutenzione o crescita, causando gravi malattie ischemiche, compreso la malattia del miocardio, ictus e malattie neurodegenerative. Tuttavia, esagerato sviluppo vascolare è caratteristico per le condizioni compreso cancro e disordini infiammatori2.
Lo sviluppo di terapie che mirano a controllare l'angiogenesi per ottenere la rigenerazione tissutale favorevole è di fondamentale importanza. Malgrado le vaste indagini precliniche e cliniche, di stimolare l'angiogenesi utilizzando microRNA e fattori pro-angiogenici hanno fallito raggiungere i risultati voluti3,4,5. I motivi possibili per gli effetti transitori includono: mirati limitata longevità di proteine angiogeniche e acidi nucleici e il numero limitato di fattori di crescita6,7. Sebbene fattori solubili angiogenici sono essenziali per l'avvio di angiogenesi, la manutenzione e la funzionalità del sistema vascolare dipendono dal supporto di tipi delle cellule compreso le cellule muscolari lisce e periciti8. Campo delle terapie pro-angiogenica sta ora valutando potenziali fonti sulle cellule staminali e progenitrici delle cellule che potrebbero fornire fattori angiogenici localmente, mentre fisicamente sostenere appena sviluppato il sistema vascolare, autorinnovanti o anche differenziarsi in cellule endoteliali9,10. Trovare l'ottimali angiogenici tipi delle cellule con la capacità di soddisfare questi requisiti funzionali detiene una grande promessa per la rigenerazione di tessuto ischemico.
Per tradurre correttamente potenziali terapie basate sulle cellule in studi clinici, studi pre-clinici devono dimostrare la loro efficacia ed evidenziare i meccanismi angiogenetici. Nonostante l'elevato numero di saggi di angiogenesi stabilito, il campo manca un'analisi "gold-standard" in vitro che in modo affidabile è in grado di valutare l'efficacia di potenziali candidati cella tipi11,12, 13. la maggior parte in vitro saggi di angiogenesi (compresi i saggi di formazione tubo, la migrazione e la proliferazione endoteliali) in genere valutare gli effetti delle cellule o composti su cellule endothelial modifiche fenotipiche o differenziazione in tubolari e strutture di rete14,15. Mentre queste caratteristiche sono fondamentali per l'angiogenesi, un'analisi "traducibile" dovrebbe anche valutare: 1) la incremento o la sostituzione dei giustificativi tipi cellulari tra cui periciti o cellule di muscolo liscio, 2) al trattamento di ECM e/o della membrana dello scantinato, e 3). l'efficienza per promuovere la formazione di microvasculature funzionale. In vivo l'angiogenesi modelli, tra cui l'analisi cornea e l'analisi di spina di Matrigel, ricapitolano il microambiente unico in vivo ma sono sfidati dalla difficoltà di rilevamento somministrato cellule per osservare le interazioni fisiche. Inoltre, in modelli in vivo , xeno-immunitario rifiuto può verificarsi durante il test i candidati potenziali terapia di trapianto allogeneic della cellula16. Ex vivo l'angiogenesi modelli, in particolare l'analisi aortica dell'anello può fornire: 1) facile osservazione e la quantificazione delle strutture tubolari, cellule di sostegno 2) accessorie, 3) ECM da ospitare e forniture artificiale, 4) esclusione di infiammatoria componenti e 5) installazione rapida ed economica17,18. In genere, l'analisi aortica dell'anello può testare il potenziale angiogenico di piccole proteine secretorie, agenti farmacologici e modelli di roditori transgenici19,20,21.
MSCs sono promettenti candidati per la rigenerazione vascolare principalmente attraverso i loro effetti paracrini mediati22,23,24. MSCs sono stati indicati a secernere fattori angiogenici chiave compreso il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) e angiopoietina-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs può anche rilevare e tessuti sede ischemica o infiammato, tuttavia, i meccanismi esatti sono ancora sotto indagine. Sempre più, la letteratura sostiene l'ipotesi che la maggior parte delle MSCs derivano da cellule perivascolari, co-esprimono marcatori di periciti e possono comportarsi come periciti27. HUCPVCs sono una giovane fonte di cellule staminali mesenchimali derivate dalla regione perivascolare del cordone ombelicale umano. Essi rappresentano una popolazione di cellule staminali mesenchimali con pericyte-come le proprietà e sono state caratterizzate dal cordone ombelicale sia FTM e termine. FTM HUCPVCs dimostrano un'alta espressione di marcatori Pericita incluse le proprietà immunitario privilegi CD146 e NG2, alto potenziale proliferativo e multilineare e visualizzare un profilo di paracrine robusto28. FTM HUCPVCs sono un tipo di cellula del candidato ideale per promuovere la rigenerazione del tessuto danneggiato attraverso la promozione del nuovo sistema vascolare attraverso le loro proprietà pericyte-come.
Per testare il potenziale angiogenico e pericyte-come proprietà di cellule staminali mesenchimali umane, un numero molto limitato di saggi di angiogenesi è disponibili dove positivo angiotropic migrazione (in appresso denominato "homing"), ECM elaborazione e sviluppo della fisica interazioni tra tipi cellulari possono essere studiate, durante l'acquisizione di dati quantitativi sullo sviluppo del microcircolo.
Con la presente vi presentiamo un protocollo che descrive un'applicazione novella del dosaggio anello aortico. MSCs umane erano co-coltivate con reti endoteliale aortiche ratto-derivato in via di sviluppo per valutare il loro contributo per la formazione, la maturazione e l'omeostasi del tubo. Questa versione del test anello aortico valuta la capacità e la potenza dei candidati alla terapia cellulare casa ai siti dell'angiogenesi, eseguire e mediare l'elaborazione ECM, e per contribuire allo sviluppo endoteliale tubolare stabilendo pericyte-come fisico interazioni farmacologiche. Oltre a quantificare l'effetto netto di MSCs su in vitro formazione del reticolo endoteliale e osservando le interazioni intercellulari, abbiamo ottimizzato anche un protocollo per isolare MSCs da co-colture. Eseguendo qPCR e citometria a flusso, è possibile caratterizzare i cambiamenti nell'espressione di gene e fenotipo MSC dopo co-coltura. Come tipi di cellule del modello, abbiamo confrontato ontogeneticamente presto (prenatale) e fine (adulti) fonti di cellule staminali mesenchimali umane: FTM HUCPVCs e umane derivate da midollo osseo MSCs (BMSC), rispettivamente, nell'analisi della anello aortico. Vi proponiamo l'analisi aortica dell'anello può essere utilizzato per studiare il potenziale angiogenico di qualsiasi tipo di cellula fisicamente supporto quando si è sotto inchiesta per applicazioni rigenerativa angiogenici.
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Protocollo
tutti gli studi che coinvolgono animali sono stati condotti e segnalati secondo ARRIVE linee guida 29. Tutti gli studi sono stati effettuati con l'approvazione del Consiglio di etica ricerca istituzionale (numero di REB 4276). Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di cura animale della rete di salute dell'Università (Toronto, Canada), e tutti gli animali hanno ricevuto un'assistenza umana in conformità con la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8 th edizione ( Istituti nazionali di salute 2011).
1. installazione di dosaggio anello aortico
- isolare l'aorta di ratto.
- Euthanize 8 - 10-settimana-vecchi topi Sprague Dawley mediante asfissia di CO 2: sostituzione di gas CO Set 2 alloggiamenti al 20% (portata = 0.2 x camera volume/min). Confermare dall'assenza di pizzico reflex e cuore battiti di palpazione torace.
- Bagnato la pelliccia sulla zona del torace utilizzando garza sterilizzata con etanolo al 70%. Utilizzare sterilizzate pinze e le forbici per fare un'incisione sulla linea mediana del petto e tagliare attraverso strati di pelle e muscolo.
- Una volta che la gabbia toracica è esposto, tagliare la gabbia toracica su ogni lato e piegare verso l'alto di 5 mm dallo sterno su ogni lato. Qualche sanguinamento è previsto dalle arterie intercostali in cadaveri freschi.
- Spingere il tessuto polmonare e il cuore a destra anatomico per esporre l'aorta. L'aorta è il bianco colorato vaso situato adiacente alla colonna vertebrale.
- Uso forcipe di pizzicare l'aorta (dopo l'arco aortico) e utilizzare forbici chirurgiche per effettuare l'incisione prima mentre si tiene l'aorta con il forcipe. Al momento di tagliare l'aorta, la cavità toracica si riempirà rapidamente con sangue, pertanto è fondamentale per lavorare rapidamente per ottenere l'aorta prima della coagulazione del sangue.
- Pinze uso per tenere l'aorta e Sbucci delicatamente verso il basso, l'aorta dalla colonna vertebrale. Il tiro sarà recidere le arterie intercostali senza ulteriori incisioni. Ottenere circa 10 cm di tessuto e/o prima l'aorta si divide in due rami nella cavità addominale e tagliata l'aorta fuori della carcassa. Spingere il diaframma se necessario la direzione caudale per ottenere l'accesso per abbassare le sezioni dell'aorta.
Nota: Sbucciare l'aorta delicatamente perché forza intensa può causare a strappare. Se le lacrime dell'aorta, permettono la coagulazione del sangue per pochi secondi e utilizzare un tovagliolo di carta per rimuovere il sangue coagulato, che permette la visibilità dell'aorta rimanente. - Posto dell'aorta in un tubo da 15 mL con 10 mL di Hank ghiacciata ' s soluzione salina bilanciata (HBSS) completati con 1% di penicillina/streptomicina (P/S). Mantenere le provette su Ice.
Nota: Il tessuto aortico può durare per 1-2 h su ghiaccio ma è meglio elaborare più velocemente possibile.
- Preparare terreni di coltura di dosaggio anello aortico in una sterile di biosicurezza (BSC).
- Preparare il mezzo di crescita endoteliale (EGM) utilizzando un'unità di filtraggio per filtrare 500 mL di Medium basale endoteliale (EBM) completati con 2% siero bovino fetale (FBS), 1% gentamicina e fattori di crescita (Vedi Tabella materiali). 50 mL di filtrato media inserire una perlina o bagnomaria a 37 ° C.
- Utilizzare un'altra unità di filtraggio per filtrare 100 mL di EBM completati con 2% FBS e 1% P/S a preparato EBM 2% FBS (EBM-FBS) e conservare a 4 ° C.
- Cappotto piastre di coltura del tessuto 12-pozzetti con membrana basale estrarre (BME) mentre si lavora sul ghiaccio.
- Posto una piastra 12-pozzetti su una superficie fredda (grande impacco di ghiaccio o vassoio). Aggiungere 200 µ l/pozzetto di appena scongelati BME utilizzando refrigerati puntali e agitare il BME per garantire anche rivestimento. Lavoro rapidamente per evitare la polimerizzazione irregolare del BME.
Nota: Un'asportazione dell'aorta tipico produce 20 anelli aortici. Per rappresentare la variabilità tra i saggi di anello aortico, è necessario configurare almeno tre saggi di anello aortico per gruppo di trattamento e includere un controllo. Se la fonte lo permette, 6 anelli per gruppo di trattamento è consigliato. - Inserire le piastre rivestite in incubatrice umidificate (95% di umidità relativa, 37 ° C, 5% CO 2; queste condizioni si applicano a tutti i passaggi di incubatore d'ora in avanti) per 30 min. posto 1.000 puntali per pipette µ l nuovamente dentro da-20 ° C al punto 1.5.3.
Nota: Mentre l'Estratto di membrana basale è utilizzato in concentrazione stock, la consistenza e la rigidità è strettamente controllato dal tempo di polimerizzazione. Assicurarsi di mantenere i tempi di polimerizzazione stessa esatta per tutti paralleli ed esperimenti indipendenti.
- Posto una piastra 12-pozzetti su una superficie fredda (grande impacco di ghiaccio o vassoio). Aggiungere 200 µ l/pozzetto di appena scongelati BME utilizzando refrigerati puntali e agitare il BME per garantire anche rivestimento. Lavoro rapidamente per evitare la polimerizzazione irregolare del BME.
- Sezione dell'aorta in anelli uniformi.
- Prendere l'aorta dal tubo 15 mL e metterlo in un piatto di 10 cm con 10 mL di fresco HBSS completati con 1% P/S.
- Utilizzare due set di pinze per separare con cura l'eccesso di tessuto connettivo, tessuto adiposo e usare un bisturi per gli altri rami delle arterie intercostali connesso all'aorta. Questo riduce la variabilità tra unità anello basato su diversi livelli di tessuto residuo. Rimuovere qualsiasi residuo coagulato sangue all'interno dell'aorta.
- Mettere un righello o una griglia sotto il piatto di 10 cm per tagliare precisamente 1-2 mm sezioni larghe dell'aorta utilizzando pinze e bisturi sterile. Tagliare le sezioni esatte quanto possibile ridurre la variabilità tra unità.
- Incorporare gli anelli aortici BME.
Nota: Se il sezionamento degli anelli aortici non viene completato prima dell'incubazione di polimerizzazione di BME, rimuovere le piastre rivestite dall'incubatrice umidificate e aggiungere 100 µ l di EBM in ciascun pozzetto per terminare la polimerizzazione. Esatta tempistica è fondamentale come over-polimerizzazione di BME può interferire con la migrazione di sviluppo e delle cellule endoteliali rete. Una volta gli anelli aortici sono preparati, rimuovere EBM dai pozzetti e continuare dal punto 1.5.2.- Rimuovere i pozzi BME rivestito da incubatrici umidificate e tornare alla BSC.
- Attentamente pick up singoli anelli aortici con forcipe e posizionare una al centro di ciascun pozzetto rivestite su BME. Ripetere per i rimanenti anelli aortici.
Nota: Media trasferito insieme con l'anello aortico dovrebbe essere tenuti minima in modo da evitare le irregolarità polimerizzazione. - Uso raffreddato puntali per pipette per aggiungere 300 µ l di BME sopra ogni anello aortico e distribuire uniformemente il BME intorno al pozzo (-20 ° C) 1.000 µ l.
- Restituire gli anelli aortici incorporati per le incubatrici umidificate per 30 min.
- Rimuovere le piastre con l'anello aortico incorporato da incubatrici umidificate e lentamente aggiungere 1.000 µ l di EGM (preparato e scaldato al punto 1.2.1) inserendo la pipetta punta contro il muro della cultura ben.
Nota: Pipettaggio direttamente i media sul BME può perturbare il BME polimerizzato e ostacolano lo sviluppo rete endoteliale continua. Utilizzare una pipetta multicanale appropriata, se disponibile. - Dopo 24 h, 1.000 µ l di EGM di rimuovere e sostituire con 1.000 µ l di EBM-FBS preparata al punto 1.2.2, nuovamente pipettando lentamente contro il lato della cultura ben.
- Mantenere il dosaggio di anello aortico sostituendo 500 µ l di EBM-FBS con 500 µ l di fresco EBM-FBS (37 ° C) ogni 48 h.
Nota: Vedi seczione 2 per avviare l'espansione di cultura MSC lo stesso giorno come istituzione saggio anello aortico. Questo assicurerà che MSCs sono pronti per la co-cultura quando le reti endoteliale sono pronte. - Utilizzare la microscopia del campo luminoso per seguire sviluppo rete endoteliale di anello aortico analisi (vedere la Figura 1 come riferimento per lo sviluppo ottimale della rete). Una volta l'aspetto di reti endoteliale è come mostrato nella Figura 2, procedere con l'impostazione l'anello aortico dosaggio-MSC co-colture (sezione 3). Fare riferimento al punto 4.1 per ulteriori dettagli di imaging le reti endoteliale.
2. Coltura del tessuto
- preparare soluzioni di riserva di terreni di coltura del tessuto.
- HUCPVCs FTM cultura (precedentemente stabilito, n ≥ 3 linee indipendenti per ciascuna) 30 e commercialmente disponibili BMSCs in alfa-MEM completati con 10% FBS e 1% P/S.
- Sterilizzare il supporto utilizzando bottiglie di 0,2 µm poro dimensioni filtro.
- Conservare le soluzioni multimediali preparati a 4 ° C fino a 3 settimane.
- Culture mantenere HUCPVC FTM e BMSC in incubatrice umidificate e passaggio al confluency di 70-80% determinata dalla microscopia di contrasto di fase. Volumi appropriati di uso dei media per le dimensioni della piastra di coltura del tessuto utilizzato (cioè 10 mL in un piatto di 10 cm). Utilizzare queste condizioni di coltura per il mantenimento e passaggio MSCs.
- Dissociare i monostrati MSC per passaggio o anello aortico dosaggio-MSC co-culture utilizzando una soluzione di enzima di dissociazione (piatto di 4 mL/10 cm) e incubare nell'incubatrice umidificate per 3 min assicurarsi distacco delle cellule usando la microscopia luminosa del campo; Incubare per altri 1-2 minuti se necessario.
- Trasferire le cellule dissociate in una provetta da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 min.
- Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere le cellule in 1 mL di un terreni di coltura appropriati (alfa-MEM multimediale completo per il passaggio di cellule o EBM-FBS per anello aortico dosaggio/MSC co-culture) per il conteggio utilizzando un contatore di cellule.
3. Preparazione di aortica anello dosaggio/MSC co-colture
- seme 10 4 MSCs su ciascuna incluso l'anello aortico (9.000 cellule/cm 2 / 12-pozzetti piastra). In base al numero di saggi di anello aortico, pre-macchia MSCs con colorante fluorescente valida, non trasferibile. Mantenere almeno tre pozzi degli anelli aortici senza MSCs per un gruppo di controllo.
- Macchia 10 5 MSCs/mL EBM-FBS media, aggiungere 2,5 µ l di vitali, non trasferibile colorante fluorescente/mL media (5 µM) in una provetta da 15 mL e posto nell'incubatrice umidificata per 30 min. mescolare delicatamente il tubo a metà strada attraverso l'incubazione.
- I seguenti 30 min di incubazione, aggiungere 1 volume di fresco EBM-FBS di cellule marcate e spin a 400 x g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di media EBM-FBS. Confermare il successo di macchiatura di MSCs utilizzando la microscopia a fluorescenza.
- Rimuovere le piastre contenenti anello aortiche dall'incubatrice umidificata e rimuovere 500 µ l di EBM-FBS da ogni pozzetto.
- Seme attentamente 10 4 MSCs in 500 µ l di EBM-FBS su ciascun anello aortico incorporato pipettando uniformemente intorno le reti endoteliale. Garantire la distribuzione uniforme agitando delicatamente la piastra di coltura.
- Aggiungere ulteriori EBM-FBS per assicurarsi che il volume totale dei media sulle co-culture analisi/MSC anello aortico è 1.000 µ l.
- Usare microscopia di fluorescenza per visualizzare le MSCs fluorescente etichettati nel dosaggio anello aortico.
4. microscopia
- microscopia campo chiaro uso all'immagine le reti endoteliale di ratto prima dell'anello aortico dosaggio/MSC co-culture per misurazioni di base (giorno 0) di proprietà di rete endoteliale (ad es., rete lunghezza, loop di rete). Immagine 4 quadranti per pozzetto dall'anello aortico alla sezione più lontana della rete all'interno di quello specifico quadrante endoteliale.
Reti di ring
- immagine aortica seguendo l'anello aortico dosaggio/MSC co-culture ai giorni 3, 5 e 7. Utilizzare queste immagini per quantificare l'effetto MSC sullo sviluppo rete endoteliale.
- Utilizzare microscopia di fluorescenza per immagini pre-etichettate MSCs nel dosaggio anello aortico.
- Seguente 24 h dell'anello aortico dosaggio/MSC co-colture, usare microscopia di fluorescenza per visualizzare MSC homing, allungamento e integrazione con le reti endoteliale. Si sovrappongono le immagini fluorescenti di MSCs con le immagini del campo luminoso delle cellule endoteliali a osservare la colocalizzazione di entrambi i tipi cellulari.
- Immagine di MSCs localizzato all'interno delle reti endoteliale sviluppate prossimale al tessuto anello aortico e MSCs localizzato all'interno di recente lo sviluppo di reti distale al tessuto anello aortico ( Figura 2).
5. Citometria a flusso e qPCR
- un giorno prima di dissociare le reti endoteliale anello aortico, scongelare i surgelati dispase a 4 ° C O/N. sezione 5.3 è identica sia per citometria a flusso e qPCR.
- Caldo 50 mL di dispase e 50 mL di tripsina 0.5% a 37 ° C perlina o bagnomaria.
- Recuperare le cellule per l'analisi dall'anello aortico dosaggio/MSC co-culture.
- Dopo 1 settimana di dosaggio/MSC dell'anello aortico co-cultura, rimuovere il supporto di cultura e aggiungere 1 mL di Phosphate-Buffered salino (PBS) lentamente di ogni bene per 3 minuti e rimuovere. Ripetere questo lavaggio due volte più.
- Aggiungere 800 µ l di pre-riscaldati dispase ad ogni pozzetto e incubare nell'incubatrice umidificate per 15 min.
- Rimuovere le piastre da incubatrici umidificate e sospendere dispase pipettando (5-10x) per spezzare il BME e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in tubi separati 15ml.
- Ripetere il punto 5.3.3 nuovo con fresco dispase pre-riscaldato fino a nessun residuo BME è osservato bene nella cultura. Aggiungere 1 volume di PBS supplementato con 3% FBS alla sospensione dispase-cellule per inattivare il dispase. Rimuovere gli anelli aortici galleggianti in una sospensione cellulare utilizzando puntali.
- Spin le sospensioni delle cellule a 400 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante con attenzione, lasciando 3 mL di sospensione cellulare nel tubo da 15 mL.
Nota: Un pellet di ovvio, tinta potrebbe non essere visibile, ma sono presenti cellule e BME. - Aggiungere 3 mL di tripsina 0.5% preriscaldata alla sospensione cellulare e vigorosamente risospendere (5-10 x pipettando) cellule. Incubare le soluzioni delle cellule tripsinizzate nell'incubatrice umidificate per 10 min.
- Rimuovere le sospensioni di cellule tripsinizzate dall'incubatrice umidificate e aggiungere 6 mL di PBS completati con 3% FBS e risospendere pochi times. Girare le sospensioni delle cellule a 400 x g per 5 min.
- Attentamente rimuovere tutto il supernatante, lasciando il pellet cellulare nel tubo e risospendere le cellule in 1 mL di PBS supplementato con 3% FBS in ciascun tubo.
- Filtrare il 1 mL di sospensione cellulare utilizzando un colino di cella 70 µm per rimuovere cellule aggregate e BME residua dalla sospensione delle cellule. Contare le celle in 1 mL di sospensione cellulare utilizzando un contatore di cell.
- Preparare le celle per citometria a flusso.
Sospensioni
- Incubare la cella (10 5 celle in 200 µ l PBS supplementato con 3% FBS) con anticorpi primari coniugati fluoroforo (FITC o APC) (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) concentrazione = 01:40) a 4 ° C per 30 min, al riparo dalla luce.
Nota: Citometria a flusso per MSCs è stato ottimizzato da Hong et al., 2013 28. È richiesto un minimo di 10.000 cellule per letture accurate. - Dopo l'incubazione di 30 min, risospendere le cellule in 2 mL di PBS completati con 3% FBS e centrifugare (400 x g, 5 min).
- Cellule di mantenere a 4 ° C al riparo dalla luce fino alle analisi di citometria a flusso (almeno 1 x 10 4 eventi) all'interno di 1 h. Per la strategia di gating, vedere complementare figura 1. Ordinare umano MSCs utilizzando anti-TRA-1-85 (APC) (concentrazione: 01:40 e a 0,5% FBS/PBS) e ordinare celle in 350 µ l di tampone di lisi delle cellule per l'analisi qPCR.
Nota: Lisati di cellule possono essere memorizzate a-80 ° C fino a 3 mesi per l'analisi futura qPCR.
- Incubare la cella (10 5 celle in 200 µ l PBS supplementato con 3% FBS) con anticorpi primari coniugati fluoroforo (FITC o APC) (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) concentrazione = 01:40) a 4 ° C per 30 min, al riparo dalla luce.
- Preparare le cellule per l'analisi qPCR.
- Isolare il RNA da cellule lisate usando kit di isolamento del RNA basata su colonne e determinare la concentrazione di RNA e la qualità. Reazione di
- preparare cDNA da fino a 5 µ g di RNA per 100 µ l della trascrittasi inversa. Eseguire un passaggio di pre-amplificazione se il rendimento di RNA è basso (< 10 ng / µ l). Uso di meno di 100 ng di RNA si tradurrà in un alto tasso di falsi negativi.
Nota: I modelli di cDNA possono essere memorizzati a-20 ° C per un'ulteriore analisi per fino a 4 mesi. - Eseguire la qPCR mediante angiogenesi espressione profiler matrici per rilevare i cambiamenti nell'espressione genica. Uso 5 ng di cDNA per reazione (40 cicli, 60 ° C, temperatura di ricottura/estensione). Express piega cambiamento dell'espressione rispetto ai campioni di cDNA MSC derivato indifferenziati. Eseguire gli opportuni controlli negativi (anello aortico senza umano MSCs).
6. Quantificazione seguente aortica anello dosaggio/MSC co-culture di rete
- scaricare il software di imaging quali ImageJ insieme l'angiogenesi Analyzer plugin 31.
- Importare le immagini di rete endoteliale scattate e aprire utilizzando il software.
- Convertire l'immagine scale sulla base delle specifiche del microscopio usato.
- Utilizzare uno strumento linea per misurare la crescita radiale rete.
- Contare i cicli di rete endoteliale utilizzando lo strumento di contatore di cella (loop con almeno 4 lati devono essere quantificati).
- Per ulteriori quantificazione delle proprietà della rete, utilizzare il plugin di angiogenesi Analyzer o altri plugin simili per analizzare i segmenti di master, totale lunghezza del segmento, aree di rete totale e il numero di giunzioni. Utilizzare lo strumento maschera sfocata per sfocare tessuto anello aortico e spazi vuoti per evitare falsi positivi calcoli.
- Trasferire i valori a un programma e grafico rete endoteliale proprietà statistiche seguendo l'anello aortico dosaggio/MSC co-culture.
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Risultati
Il flusso di lavoro schematico per stabilire il dosaggio di co-coltura aortica anello/MSC è illustrato nella Figura 1. I passaggi principali includono: ratto isolamento dell'aorta, sezionamento e l'incorporamento degli anelli aortici, monitoraggio endoteliale germinazione e sviluppo della rete e infine l'etichettatura e gestione MSCs. La sequenza temporale dell'analisi endoteliale rete delinea la finestra per le analisi fattibile per ogni periodo di co-coltur...
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Discussione
Ci sono diverse fasi critiche nella creazione di un successo analisi aortica dell'anello esperimento di co-coltura MSC. In primo luogo, i passaggi più importanti quando isolando e sezionamento dell'aorta sono: 1) ottenere esclusivamente il segmento toracico dell'aorta; 2) accuratamente rimuovendo ramificazione dei vasi sanguigni, tessuto connettivo e adiposo e; 3) taglio anche sezioni dell'aorta (~ 1 mm) per limitare la variabilità tra ogni dosaggio. In secondo luogo, il successo l'incorporamento degli anelli aortici in ...
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Dichiarazioni
Dr. Clifford L. Librach è contitolare del brevetto: metodi di isolamento e di uso di cellule derivate da tessuti di cordone ombelicale primo acetonide. Concesso in Canada e in Australia.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziare i seguenti membri del personale e personale di ricerca: Sarah Laronde, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai e Andrée Gauthier-Fisher.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | per terreni di coltura FTM, HUCPVC e BMSC. |
| TRA-1-85 R& umano coniugato con APC | Sistemi D | FAB3195A | Marcatore cellulare specifico per l'uomo per la citometria a flusso e la selezione cellulare Estratto |
| membrana basale (BME) (Matrigel) | Corning | Per l'inclusione dell'aorta | |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Include: Gentamicina/Amfotericina-B (GA)Epidermal Fattore di crescita umano (hEGF); fattore di crescita endoteliale (VEGF) vascolare ; R3- fattore di crescita insulino-simile-1 (R3-IGF-1); Acido Ascorbico; Idrocortisone; fattore di crescita dei fibroblasti umani-beta (hFGF-β); Eparina; Siero fetale bovino (FBS). Necessario per preparare EGM |
| CellTracker Colorante CMFDA verde | Thermo-fisher | C2925 | Per la colorazione delle MSC, il verde viene prelevato in modo ottimale dalle MSC |
| Microscopio per colture CKX53 | Olympus | Per l'imaging in campo chiaro dello sviluppo della rete endoteliale | |
| Contatore cellulare automatizzato Countess | Invitrogen | C10227 | Conteggio delle cellule per la coltura di MSC, citometria a flusso e qPCR |
| Dispase | Tecnologie StemCell | 7923 | Per la dissociazione di co-colture di anelli aortici-MSC (pre-riscaldamento a 37 ° C) |
| Bisturi sterili monouso | VWR | 21909-654 | Per il sezionamento dell'aorta |
| salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio |
| Terreno basale endoteliale (EBM) | Lonza | CC-3156 | Terreno basale necessario per la coltura di co-colture di co-colture MSC con saggio dell'anello aortico (caldo a 37 ° C prima dell'uso). Richiesto per EGM ed EBM-FBS |
| Etanolo, 70%, grado biotecnologico | VWR | 97064-768 | Per sterilizzare le superfici |
| EVOS | Life Technologies | Microscopio fluorescente interno per monitorare la migrazione e l'integrazione delle MSC | |
| Siero fetale bovino (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Componente sierico del terreno di coltura cellulare |
| Anticorpo anti-CD31 coniugato con FITC | BD | 558068 | Marcatore endoteliale umano per citometria a flusso |
| Anticorpo coniugato FITC anticorpo CD146 | BD | 560846 | Marcatore pericitario umano per citometria a flusso |
| Pinze | Almedic | 7727-A10-704 | Per la consegna di tessuti di ratto. Può utilizzare qualsiasi pinza simile |
| salina bilanciata di Hank (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio |
| HERAcell 150i CO2 Incubatore | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | Per l'incubazione di cellule |
| Angiogenesi umana Profilatore RT2 Array PCR | Qiagen | PAHS-024Z | Specifico per l'uomo e include primer per 84 geni coinvolti nell'angiogenesi. Ogni pozzetto è 1 reazione di primer |
| ImageJ | Software di elaborazione delle immagini open source. Richiedi il plug-in dell'analizzatore di angiogenesi | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. Per citometria a flusso. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. Per lo smistamento cellulare. | |
| Penicillina/streptomicina | Gibco | 15140122 | Componente antibiotico per tamponi e terreno di coltura cellulare |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Per la purificazione dell'RNA. Include tampone per lisi cellulare |
| RT2Easy Kit primo filamento | Qiagen | 330421 | Per la preparazione del cDNA per qPCR |
| RT2PreAMP Kit di sintesi del cDNA | Qiagen | 330451 | Pre-amplificazione del cDNA se RNA a basso rendimento |
| Forbici chirurgiche | Strumenti per la scienza | 14059-11 | Per il taglio di pelle, muscoli e aorta |
| Garza sterile | VWR | 3084 | Per inumidire e sterilizzare il pelo del torace |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | dell'enzima | dissociazione MSC a 37 ° C |
| 0,2 μ unità di filtrazione a pori m | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | Per sterilizzare terreni di coltura tissutale |
| 0,25% Tripsina/EDTA | Gibco | 25200056 | Per la dissociazione cellulare, preriscaldare a 37 ° C |
| Piastre per coltura tissutale da 10 cm | Corning | 25382-428 | Per la pulizia e il sezionamento di colture cellulari di aorta e MSC |
| 12 piastre per colture cellulari a pozzetto | Corning-Sigma | Aldrich CLS3513 | Per l'impostazione di co-colture di saggi dell'anello aortico-MSC |
| Provetta da 15 mL | BD Falcon | 352096 | Per procedure generali di coltura tissutale |
| 70 μ colino per cellule m | Fisherbrand | 22363548 | Per garantire una sospensione di una singola cellula prima della citometria a flusso o della selezione |
Riferimenti
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