Descriviamo un protocollo per la visualizzazione di esocitosi di insulina in isolotti intatti usando pHluorin, una proteina fluorescente verde sensibili al pH. Gli isolotti isolati sono infettati con l'adenovirus codifica pHluorin accoppiato per il vescicola carico neuropeptide Y. Questo consente il rilevamento degli eventi di fusione granello dell'insulina mediante microscopia confocale.
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Articolo metodologico
Confocale Imaging di Neuropeptide Y-pHluorin: una tecnica per visualizzare esocitosi di granuli di insulina in isolotti intatti Murine ed umani
In questo articolo
Sommario
Abstract
La secrezione dell'insulina svolge un ruolo centrale nell'omeostasi del glucosio in condizioni fisiologiche normali così come nella malattia. Attuali approcci per lo studio di esocitosi di granuli di insulina che utilizzare elettrofisiologia o microscopia accoppiato all'espressione di reporter fluorescenti. Tuttavia la maggior parte di queste tecniche sono stata ottimizzata per linee cellulari clonale o richiedono dissociando isolotti pancreatici. Al contrario, il metodo presentato qui consente per la visualizzazione in tempo reale di esocitosi di granuli dell'insulina in isolotti pancreatici intatti. In questo protocollo, descriviamo in primo luogo l'infezione virale di isolotti pancreatici isolati con l'adenovirus che codifica una pH sensibili proteina fluorescente verde (GFP), pHluorin, accoppiata al neuropeptide Y (NPY). In secondo luogo, descriviamo la rappresentazione confocale di isolotti di cinque giorni dopo l'infezione virale e come monitorare la secrezione di granuli di insulina. Brevemente, gli isolotti infetti sono collocati su un vetrino coprioggetto su una camera di imaging e imaged sotto un microscopio confocale laser-scanner verticale pur essendo continuamente irrorati con soluzione extracellulare contenente vari stimoli. Immagini confocal spanning 50 µm dell'isolotto sono acquisiti come Time-lapse registrazioni usando uno scanner veloce-risonante. La fusione dei granuli di insulina con la membrana plasmatica può essere seguita nel tempo. Questa procedura permette di testare una batteria di stimoli in un singolo esperimento è compatibile con sia il mouse che isolotti umani e possa essere combinata con vari coloranti per l'imaging funzionale (ad es., coloranti di calcio citosolico o potenziale di membrana).
Introduzione
L'insulina è prodotta dalle cellule beta delle isole pancreatiche ed è un regolatore chiave di glucosio metabolismo1. Morte o disfunzione delle cellule beta disturba l'omeostasi del glucosio e porta a diabete2. L'insulina è confezionato in granelli del denso-centro che vengono rilasciati in Ca2 +-modo dipendente3. Delucidamento com'è regolata la esocitosi di granuli di insulina è essenziale per comprendere appieno ciò che determina la secrezione di insulina e apre nuove strade per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici per il trattamento del diabete.
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Protocollo
il Comitato di etica animale dell'Università di Miami ha approvato tutti gli esperimenti.
1. virale infezione di intatto isolato umano o isolotti pancreatici del topo
- cultura dell'isolotto: preparare il terreno di coltura dell'isolotto: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS e 2 mM L-glutammina.
- Umani di isole pancreatiche sono ottenuti dal programma di distribuzione integrata per isolotto (NIDDK, NIH). All'arrivo, trasferimento gli isolotti (~ 500 equivalenti di isolotto) a 35 mm non-tessuto cultura trattati Petri con terreni di coltura CMRL 2 mL a 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2<....
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Risultati
L'intero flusso di lavoro della tecnica è illustrata nella Figura 1. Brevemente, mouse o isolotti umani possono essere infettati con l'adenovirus codifica NPY-pHluorin e ripreso, dopo pochi giorni a cultura, sotto un microscopio confocale. Come granuli si fondono con la membrana plasmatica e Apri, un aumento di fluorescenza è osservato e possono essere quantificato (Figura 1). Per determinare se NPY-pHluorin è infatti uno strumen.......
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Discussione
Questo manoscritto descrive una tecnica che può essere utilizzata per visualizzare esocitosi dei granuli di insulina in cellule beta all'interno intatti isolotti pancreatici mediante microscopia confocale. Utilizza NPY-pHluorin come il reporter fluorescente clonato in adenovirus per garantire un'efficienza di trasfezione alta.
Anche se il metodo è altamente efficiente nelle nostre mani, anche se potrebbe richiedere alcune modifiche che dipendono principalmente da due parametri: 1) la qualità d.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Marcia Boulina dalla funzione di memoria per un aiuto con i microscopi di imaging e DRI. Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), DK111538 R01, R33 ES025673 e R56 DK084321 (AC).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio confocale verticale a scansione laser | Leica Microsystems, Wetzlar, Germania | TCS-SP5 | include LAS AF, il software di acquisizione delle immagini |
| Camera di imaging Warner | instruments | RC-26 | |
| Piattaforma della camera di imaging | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 vetrini coprioggetti | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum grasso siliconico | Sigma | Z273554-1EA Sistema di | |
| perfusione multicanale | Warner instruments | VC-8 | |
| Riscaldatore soluzione in linea singola | Warner instruments | SH-27B | |
| Regolatore di temperatura | Warner instruments | TC-324C | |
| Pompa di aspirazione peristaltica | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Piastra di Petri, trattamento con coltura non tissutale | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, senza glutammina | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, inattivato a caldo | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutammina 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M Soluzione di NaCl | Sigma | S5150 | |
| 3 M Soluzione KCl | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 soluzione | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 soluzione | Sigma | M1028 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES soluzione | Sigma | H0887 | |
| Filtro sottovuoto | VWR | 431098 | |
| D-Glucosio | Sigma | G8270 | |
| Bromidrato di poli-D-lisina | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
Riferimenti
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the cont....
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Ristampe e permessi
