Articolo metodologico

In Vitro Caratterizzazione delle proprietà elettrofisiologiche di fibre afferenti coliche in ratti

DOI:

10.3791/56090

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27 settembre 2017

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1Hongqiao International Institute of Medical Research, Tongren Hospital and Department of Physiology, Faculty of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Anormale funzione sensoriale è alla base di dolore viscerale e altri sintomi delle malattie intestinali infiammatorie e funzionali. Un protocollo per la registrazione elettrofisiologica dei nervi afferenti colici in una preparazione di colorectum del ratto ex vivo è presentato qui.

Abstract

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Disfunzione dei nervi sensoriali colici è stata implicata in patofisiologia di parecchi termini comuni, compreso il diabete e le malattie intestinali infiammatorie e funzionali. Qui, descriviamo un protocollo per la caratterizzazione in vitro delle proprietà elettrofisiologiche delle afferenze colica in ratti. Colorectum, con il ganglio pelvico intatto (PG) collegato, viene rimosso dal ratto; superfusi con carbogenated soluzione di Krebs nella camera di registrazione; e cannulate alle estremità orale e anale per consentire per distensione. Un fascio di nervi bene che emana dal PG viene identificato, e l'attività nervose afferenti multiunit viene registrata utilizzando un elettrodo di aspirazione. Distensione del segmento colico suscita aumenti graduali in scarico multiunit. Un'analisi delle componenti principali è condotto per distinguere la bassa soglia, l'alto-soglia e le fibre afferenti del largo-gamma dinamica. Sensibilità chimica delle afferenze colica può essere studiata attraverso la vasca o intraluminal somministrazione di sostanze da testare. Questo protocollo può essere modificato per applicazione ad altre specie, come topi e porcellini d'India e di studiare le differenze nelle proprietà elettrofisiologiche delle afferenze toracolombare/hypogastric e lombosacrale/pelvica del colon discendente in normale e condizioni patologiche.

Introduzione

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Tratto gastrointestinale (GIT) è riccamente innervato con estrinseci nervi afferenti che trasmettono segnali sensoriali dall'intestino al sistema nervoso centrale e che contribuiscono all'interazione di intestino-cervello. Alterata eccitabilità di queste afferenze estrinseca, come pure alterata elaborazione centrale degli input afferente, è alla base di dolore viscerale e altri sintomi di GI condizioni, tra cui funzionali e infiammatorie intestinali malattie1. Informazioni sensoriali da colorectum viene trasmesso principalmente attraverso il toracolombare/hypogastric e i nervi lombosacrale/pelvici (PN)2. C'è stato un crescente interesse nello studiare le proprietà elettrofisiologiche di queste fibre afferenti primarie nei modelli del roditore del morbo. Tuttavia, in vivo le registrazioni elettrofisiologiche delle afferenze colica nei roditori è una sfida tecnica e richiede una notevole abilità chirurgica. Inoltre, i cambiamenti emodinamici, il movimento del tessuto e anestetici possono incidere anche l'attività del nervo e la sensibilità per testare gli stimoli in vivo. Di conseguenza, negli ultimi anni, un numero crescente di studi è impiegate preparazioni in vitro (ex vivo) di specie diverse, tra cui topi, ratti, cavie e gli esseri umani, di esaminare i meccanismi di trasduzione sensoriale a Colico afferenze e l'eccitabilità alterata in condizioni di malattia. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8

Due tipi di ex vivo preparazione colica principalmente sono stati segnalati: il "piatto-foglio" preparazione5,9,10 e il "tubo" preparazione3,4. Un video protocollo per la preparazione di colorectum murino "piatto-foglio" è stato pubblicato in precedenza11. In questo protocollo, colorectum del mouse, con il PN) o Nervi Splancnici lombari (LSN) collegati, è raccolto e superfusi in una camera di tessuto. Colorectum è tagliati longitudinalmente, e il pacco del nervo viene esteso in un vano di registrazione riempito con olio di paraffina. L'attività del nervo viene registrata utilizzando un elettrodo di platino-iridio monopolare. Il protocollo consente l'identificazione dei campi ricettivi di singole fibre afferenti tramite stimolazione elettrica imparziale. Localizza l'applicazione di stimoli chimici, così come l'applicazione di paradigmi diversi stimoli meccanici (ad es., focale della mucosa sondaggio e tratto della circonferenza), per le terminazioni nervose afferenti. Poiché il nervo deve essere estesa a una camera separata dalla camera del tessuto, è fondamentale per mantenere il nervo collegato relativamente lungo; la dissezione successo dei nervi rappresenta una sfida per quelli nuovi a questa metodologia. Più recentemente, Nullens et al pubblicato un video di protocollo per la registrazione in vitro delle afferenze mesenterica murino digiunale e segmenti colici12. In questa preparazione di "tubo", il segmento di intestino con il mesentere attaccato è mantenuto intatto, consentendo in tal modo graduale distensione e la somministrazione intra - ed extra-luminale di diverse sostanze chimiche. Poiché il nervo mesentere viene registrato utilizzando un elettrodo di aspirazione, che può essere posizionato in prossimità del tessuto, attività afferente possono essere registrati anche se il nervo mesentere è relativamente breve. Tuttavia, il nervo di mesentere costituito da popolazioni miste di fibre afferenti vagali e spinali che innervano il digiuno o toracolombare hypogastric. Afferenze pelvici lombosacrale innervano colorectum, che non possono essere discriminati in questo protocollo. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la registrazione elettrofisiologica delle afferenze colica ratto usando la preparazione del colon-retto "a tubo" con un PG intatto. Questo metodo potrebbe consentire per la caratterizzazione delle proprietà funzionali di lombare splancnico (hypogastric) e lombosacrale pelvico afferenze.

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Protocollo

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il protocollo sperimentale riportato qui è stato approvato dall'animale etico Comitato di Shanghai Jiaotong University School of Medicine (n # SYXK2013-0050). la dissezione del colorectum con ganglio intatto e nervo tronco richiede un minimo di 15 minuti per una persona abbastanza esperta in questa tecnica. Pertanto è necessario mantenere l'animale in vita ma in anestesia profonda quando si esibiva le dissezioni, per garantire la vitalità del tessuto per la successiva registrazione elettrofisiologica.

1. preparazione della soluzione di perfusione e residui della prova

  1. preparare 5 L di soluzione di Krebs: 113 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 25mm NaHCO 3, 1,2 mM CaCl 2 e 11,5 millimetri di glucosio. Saturare la soluzione con un 95% O 2 + 5% CO 2 miscela di gas. Pre-raffreddare ~ 500 mL di Krebs ossigenata in frigo.
  2. Preparare aliquote di stock testare composti (capsaicina 1 mM in etanolo e 10 mM 5-idrossitriptamina (5-HT) in soluzione salina) come necessario. Diluire il brodo in Krebs (per applicazione di bagno) e in soluzione salina (per l'amministrazione di intraluminal) alla concentrazione finale appena prima dell'uso.

2. Preparazione dell'elettrodo di registrazione

  1. tirare l'elettrodo di registrazione da vetro standard tubi senza filamenti interni (1,5 mm di diametro esterno) utilizzando un estrattore di elettrodo convenzionale. Regolare le impostazioni di estrattore per calore e tirare in modo che il gambo degli elettrodi tirati è compreso tra 20 e 25 mm.

3. Raccolta di tessuto

  1. anestetizzare il ratto profondamente utilizzando sodio pentobarbital (80 mg/kg, i.p.).
  2. Garantendo la sterilità, esporre la cavità addominale eseguendo un'incisione del midline sulla parete addominale usando un bisturi. Tirare il mesentere e altri tessuti da parte di esporre colorectum.
  3. Metti l'animale sotto il microscopio per dissezione. Attraverso la dissezione attenta, individuare il PG sinistro e identificare il PN e il numero LSN hanno aderito. Tagliare questi nervi pochi millimetri dal PG.
    Nota: Il PG si trova vicino allo svincolo del colon-retto. In genere, 3-4 PN da midollo spinale lombosacrale e un progetto LSN per il PG ( Figura 1).
  4. Tagliare l'osso della sinfisi per esporre il retto. Rimuove i tessuti (cioè, vescica urinaria, ecc.) sopra il colorectum; fare attenzione a lasciare intatto il PG.
  5. Sacrificare il ratto dell'iniezione endovenosa di una dose eccessiva del pentobarbital. Transetto del colon circa 3 cm sopra il PG e rimuovere colorectum dall'animale usando il forcipe.
  6. Trasferimento colorectum in una capsula Petri riempito con soluzione di Krebs pre-raffreddata. Rimuovere le feci lavando delicatamente il colon. Rimuovere la vescica urinaria residuo e altri tessuti con attenzione, senza compromettere il PG.

4. Dissezione dei nervi afferenti colica

  1. inserire i due punti in una camera di registrazione (20 mL) e irrorare il tessuto continuamente con carbogenated soluzione di Krebs. Impostare la frequenza di aspersione a 15 mL/min
  2. Incannulare colorectum a entrambe le estremità orale e anale. Iniziare l'infusione di intraluminal del colon con soluzione fisiologica ad un tasso di 10 mL/h l'orale anale direzione.
  3. Individuare il PG principale sotto il microscopio per dissezione. Utilizzare spilli entomologici per esporre il ganglio. Con dissezione accurata, trovare un bel ramo del nervo che emana dal ganglio e correndo verso il colon ( Figura 1). Tagliare il nervo vicino il ganglio.
    Nota: La figura 1 illustra una registrazione da un ramo del nervo distale a PG. Il nervo presumibilmente contiene una miscela di fibre afferenti splancnica lombare e pelviche. In alternativa, una registrazione può essere fatta dal PN e/o il numero LSN prossimale a PG.
  4. Accendere il riscaldamento vasca e caldo la soluzione di Krebs per mantenere la temperatura della camera a 34 ± 0,5 ° C.

5. Preparazione dell'elettrodo aspirazione

  1. prendere una pipetta di vetro pre-stirato (passaggio 2) ed esaminarlo al microscopio per dissezione. Rompere la punta dell'elettrodo con un paio di pinze, in modo che è di dimensioni compatibili con il diametro del nervo per essere registrato.
  2. Smusso la punta collocandolo vicino un leggero chiarore.

6. Registrazione elettrofisiologica

  1. Connetti l'elettrodo smussato a pinza porta elettrodo. Collegare una siringa 10 mL alla porta laterale del supporto per applicare pressione negativa o positiva all'elettrodo.
  2. Collegare il titolare per l'headstage della bioamplifier e montare l'headstage su un manipolatore.
  3. Spostare l'elettrodo al bagno del tessuto e riempire l'elettrodo con la soluzione di Krebs applicando leggera aspirazione fino a quando non si mette in contatto il filo d'argento del titolare. Posizionare la punta dell'elettrodo vicino l'estremità tagliata del nervo e applicare una pressione negativa a succhiare il nervo nell'elettrodo. Applicare pressione negativa affinché ~ 1 mm del nervo è tirato nell'elettrodo e forma una guarnizione stretta.
  4. Disabilita sullo bioamplifier e impostate il filtro a 300-3.000 Hz. monitorare il segnale sull'oscilloscopio e registrare il segnale del nervo (frequenza di campionamento 20kHz) e il segnale di pressione intraluminal (frequenza di campionamento di 100 Hz) utilizzando un computer con un'elaborazione dei dati di spike software.

7. Test della sensibilità afferente colica

  1. applica distensione di rampa del colon chiudendo il rubinetto a tre vie sulla cannula Saldi infondendo continuamente intraluminally. Monitorare la pressione intraluminal fino a raggiungere 60 mmHg, momento in cui aprire il rubinetto a tre vie sulla cannula drenante.
  2. Ripetere questa procedura ad intervalli regolari di 15 min. applica farmaci extra - o intraluminally per testare la sensibilità chimica dei nervi afferenti.

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Risultati

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La figura 1 rappresenta l'illustrazione schematica dell'apparato sperimentale per la preparazione di colorectum ex vivo "tubo", con un rappresentante di registrazione da un nervo distale a PG. Il nervo presumibilmente conteneva una miscela di afferenze splancnico lombare e pelvica. Nelle preparazioni da ratti normali, i nervi afferenti colici in genere hanno un basso livello di attività spontanea irregolare. Distensione di rampa del colon induce un g...

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Discussione

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Il protocollo presentato qui è un metodo relativamente semplice sperimentale per valutare le proprietà elettrofisiologiche delle afferenze colica dei ratti. Il protocollo (da dissezione del tessuto per impostare la registrazione del nervo) di solito ci vogliono circa 2 ore per completare. Raccolta di tessuto (passaggio 3) e la preparazione dell'elettrodo aspirazione (passo 5) sono i punti critici. È fondamentale essere in grado di individuare il PG, il numero LSN e il PN e fare attenzione a non per danneggiare il ganglio...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo protocollo è stato sostenuto da borse di ricerca da National Foundation Natural Science of China (#31171066, #81270464) e il centro di scienza di Sino-tedesco (GZ919).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sodio PentobarbitalShanghai Westang Bio-TechB558
CapsaicinaSigmaM2028
Estrattore di elettrodiMicroData Instrument IncPMP107
Neurolog System (Bioamplificatore)Digitimer, LtdNeurolog System
Convertitore A/DCambridge Electronic DesignMicro1401
Software di elaborazione datiCambridge Electronic DesignSpike2 versione 6
Filo d'argentoWorld Precision InstrumentsEP12
Tubi di vetroWorld Precision Instruments1B150-4
PortaelettrodoWorld Precision InstrumentsMEH3SBW
Bagno di riscaldamentoGrantGR150
Microscopio da dissezioneLeicaZoom2000
Microscopio da dissezioneWorld Precision InstrumentsPZMIII-BS
AccendisigariqualsiasiNA
Strumenti chirurgiciWorld Precision InstrumentsNA
Perni per insettifatti in casa con filo di acciaio inossidabile da 0,1 mmNA
Manipolatorea tre vieWorld Precision InstrumentsKITF-R
RattiQualsiasiNAQualsiasi ceppo/sesso può essere utilizzato.

Riferimenti

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