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Articolo metodologico

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

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DOI:

10.3791/56092

⸱

10 gennaio 2018

 , 
1Chemical Biology, Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 2Department of Physiology, Anatomy, and Genetics, University of Oxford, 3Trans-synaptic signaling, European Neuroscience Institute

In questo articolo

Sommario

Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

Abstract

Il AWESAM (un low-costo easy stellate unstrocyte metodo) protocollo comporta un modo veloce, semplice e poco costoso per generare grandi quantità di in vivo-piace monocolture di astrociti di topo e di ratto : Le cellule cerebrali possono essere isolate da diverse regioni del cervello, e dopo una settimana di coltura delle cellule, cellule non-astrocytic sono scrollate di dosso inserendo i piatti di cultura su un agitatore per 6 h nell'incubatrice. Gli astrociti rimanenti sono quindi attraversati in nuove piastre con un mezzo di Astrocita-specifici (chiamato NB + H). NB + H contiene basse concentrazioni di eparina-legante EGF-like growth factor (HBEGF), che viene utilizzato al posto del siero in mezzo. Dopo essere cresciuto in NB + H, gli astrociti AWESAM hanno una morfologia stellare e processi impercettibili e funzionalità. Inoltre, questi astrociti hanno più in vivo-come l'espressione genica di astrociti generati dai metodi precedentemente pubblicati. CA2 + imaging, dinamiche della vescicola e altri eventi vicino la membrana possono essere studiati così nello bene processi astrocytic in vitro, ad esempio, utilizzando cellule vive confocale o microscopia TIRF. In particolare, gli astrociti AWESAM inoltre esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione simile a astrociti in vivo.

Introduzione

Astrociti influenzano la funzione del cervello attraverso supporto trofico, flusso sanguigno, segnalazione sinaptica e plasticità e comunicazione intercellulare - che sono tutti meccanismi che centro attorno i processi astrocitari sottili. Il protocollo AWESAM descritto qui permette lo studio di questi processi senza interferenze da parte di neuroni e glia altri, che è utile per esempio, perché l'espressione di molte proteine e anche di Ca2 + segnalazione si sovrappongono in tutto cellula cerebrale diversa tipi. Inoltre, questo metodo supera i limiti delle tecniche precedentemente disponibili. In particolare, il nostro protocollo prevede in vivo-come morfologia (astrociti stellari con sottili processi) e l'espressione genica in un veloce, facile e modo a buon mercato.

Morfologia delle cellule, espressione genica e molti altri processi normativi sono direttamente influenzati dall'ambiente. In una piastra di coltura, si riferisce a fattori rilasciati dalle cellule circostanti, ma anche il mezzo in cui le cellule sono cresciute. Per gli astrociti, HBEGF precedentemente è stata segnalata per indurre una morfologia stellari1 ma è stato anche trovato per-differenziare gli astrociti2. Tuttavia, concentrazioni più basse di HBEGF più successivamente sono state utilizzate per la generazione di più nel vivo-come astrociti come identificato tramite sequenziamento di RNA in due differenti protocolli3,4. Inoltre, la morfologia del astrocyte cambia con la composizione media, indipendentemente dal protocollo4: Neurobasal medio con una bassa concentrazione di HBEGF è ottima per la coltivazione di astrociti stellari, mentre altre composizioni medie (ad es., contenenti siero DMEM) produrre cellule poligonali (anche negli astrociti appena isolati di immunopanning).

Il protocollo AWESAM sormonta gli svantaggi delle precedenti tecniche per la coltivazione del astrocyte monocolture4. Tecniche precedenti per la coltivazione di monocolture Astrocita presentano i seguenti svantaggi: morfologia poligonale, che è inconsueta che gli astrociti stellari in vivo (MD metodo)5; la lunghezza e il costo del protocollo (preparazione astrociti da prende le cellule staminali pluripotenti indotte tre mesi e richiede molti reagenti, compresi costosi fattori di crescita)6; la bassa quantità di materiale (metodo immunopanning)3; e la de-differenziazione degli astrociti e requisito di una matrice 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. al contrario, fornisce il protocollo AWESAM: in vivo-come la morfologia (astrociti stellari con sottili processi); un veloce, facile e a buon mercato metodo; grandi quantità di materiale; e di più nel vivo-come espressione genica rispetto a immunopanned e astrociti di MD. Inoltre, cultura 2D consente lo studio di segnalazione di Ca2 + e riciclaggio in sottili processi e in eventi vicino la membrana della vescicola (ad es., microscopia TIRF non è possibile in 3D culture).

Il metodo di MD è stato ampiamente utilizzato dalla sua pubblicazione nel 19805, che offre una tecnica semplice e veloce per monocolture Astrocita poligonale. In breve, il metodo di MD comporta crescita cellule cerebrali misto nel siero fetale di vitello (FCS)-contenente DMEM, seguita da agitazione passaggi che arricchiscono per gli astrociti (come tutte le altre cellule di cervello tipi staccano dal piatto) e ulteriormente cultura sullo stesso supporto. DMEM completate con FCS è utilizzato per molti altri tipi di cellule, che vanno dai fibroblasti e adipociti a linee cellulari tumorali differenti, tutti condividono la morfologia poligonale esibita da astrociti MD nella cultura. Fino al primi anni 20007, piccolo pensiero era stato rilasciato ai media su misura per gli astrociti, in particolare per favorire la loro tipica morfologia stellare trovato in vivo. Un protocollo pubblicato nel 2011 raggiungere tale morfologia stellare: chiamato il metodo immunopanning, impiega medium senza siero, ottimizzato per la coltura di astrociti3. Utilizzando questo metodo, le cellule cerebrali di recente isolate sono esposti a una serie di piatti rivestiti con anticorpi destinati a proteine di superficie delle cellule di tipo-specific cella, per arricchire per gli astrociti. Nonostante il più in vivo-come profilo di morfologia ed espressione dei astrocytes immunopanned, la maggior parte degli studi in vitro si basa ancora sul metodo Astrocita MD. Il metodo di MD è semplice e veloce, mentre il metodo di immunopanning comprende più lunghe e complesse fasi il primo giorno della cultura (ad esempio lunghi periodi di digestione degli enzimi, attenta stratificazione delle soluzioni di diversa densità, immunopanning stesso, e diversi centrifugazione passi - tutto prima di placcatura). Tuttavia, utilizzando il mezzo più specializzato, il metodo AWESAM offre sia la velocità del metodo MD e lo in vivo-come la morfologia del protocollo immunopanning.

Nel complesso, il protocollo AWESAM è utile per studiare più in vivo-come astrociti in 2D monocolture isolate da neuroni e glia altri (come precedentemente caratterizzati4 immunostainings, immunoblots e sequenziamento di RNA). Esso consente lo studio dei processi astrocitari sottili e fornisce grande accessibilità per la visualizzazione di Ca2 + segnalazione spontanea ed eventi vicino la membrana (ad es., ripreso da microscopia TIRF).

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti qui sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per il benessere animale tedesco.

Nota: La linea temporale e i passaggi principali del protocollo sono illustrati nella Figura 1.

1. preparati

  1. Preparare le seguenti soluzioni.
    1. Preparare DMEM + per la coltura di astrociti MD poligonali: DMEM con 10% FCS, 100 U penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina.
    2. Preparare NB + H per la coltura di astrociti stellari: neurobasal medio con 5 ng/mL HBEGF, 1x supplemento B-27, integratore di glutammina x 1, 100 U penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina.
      Nota: Le aliquote di più alte concentrazioni di HBEGF possono essere preparate e conservate a-20 ° C per essere aggiunto al mezzo quando necessario.
    3. Preparare il supporto di dissezione (10 mM HEPES in HBSS).
    4. Preparare aliquote di 6-7 mL di tripsina-EDTA 0,05% e 6-7 mL 0,25% tripsina-EDTA in provette da 15 mL. Questi possono essere conservati a-20 ° C e scongelati a bagnomaria a 37 ° C.
  2. Il giorno prima di iniziare il protocollo, cappotto piatti di coltura del tessuto-trattati di 10 cm con 5 mL di 0,04% polyethylenimine (PEI) ogni.
  3. Il giorno successivo, rimuovere il PEI e lavare i piatti con acqua deionizzata, distillata due volte. Aggiungere 12 mL di DMEM + ad ogni piatto e pre-equilibrare nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per almeno 30 min prima celle di placcatura.
  4. Preparare l'area di dissezione: In una cappa a flusso laminare dissezione, posizionare due 10cm di Petri riempito con il mezzo di dissezione su ghiaccio. Per ogni area del cervello ad essere isolato (ad es., corteccia, ippocampo), preparare un 15-tubo riempito di 14 mL liquido di dissezione e tenere sul ghiaccio. Spray strumenti di dissezione (forbice, Dumont #3 e #5 pinze) con etanolo al 70% e posto accanto al microscopio di dissezione nella cappa.

2. rat o dissezione del cervello del Mouse

Nota: Entrambi i topi e ratti possono essere utilizzati. Gli animali più vecchi di P8 possono anche essere utilizzati (abbiamo testato fino a P12), ma rimuovendo le meningi diventerà sempre più difficile. Inoltre, il rendimento delle celle e salute diminuirà, poiché le cellule cerebrali da più vecchi animali avranno formato intricati processi e connessioni che possono rompersi durante la dissociazione del tessuto, che conduce alla morte aumentata delle cellule. Corticale preparazioni sono descritte qui, ma possono essere utilizzati anche altre regioni del cervello.

  1. Posto 0.05% tripsina-EDTA in bagnomaria a 37 ° C.
  2. Eutanasia di animali (ratti incinti per E19 cuccioli o animali di P0-P8) alzando lentamente la concentrazione di CO2 e isolare i cervelli. La procedura seguente richiede una tecnica sterile.
  3. Se lavora con tessuto embrionale, innanzitutto rimuovere gli embrioni dall'utero e aprire i sacchi embrionali, quindi immediatamente tagliato le teste con le forbici. Quando tutti i capi sono tagliati fuori, trasferirli nel mezzo di dissezione pre-raffreddata.
    1. Una volta che le teste sono sommersi nel mezzo, aprire il cranio (entrambi sono molto morbidi in animali giovani) e pelle con forcipe e pizzico fuori il cervelletto. Leva con attenzione il resto del cervello fuori dal cranio.
      Nota: Due-quattro E19 embrioni resa abbastanza tessuto per almeno otto piatti di 10cm di astrociti corticali placcati a 500.000 cellule per piatto del giorno di dissezione.
  4. Per i cuccioli appena nati o più anziani, tagliare le teste con le forbici e isolare i cervelli di medialmente tagliando la pelle in linea retta dalla parte posteriore della testa fino alla punta del naso. Tirare la pelle da parte e accuratamente tagliata il cranio sinistra e destra, poi ascensore le ossa fino. Tagliare il cervelletto, e leva il resto del cervello fuori dal cranio.
    Nota: Due o tre cuccioli di P0-P8 resa abbastanza tessuto per almeno otto piatti di 10cm di astrociti corticali placcati a 500.000 cellule per piatto del giorno di dissezione.
  5. Separare la corteccia dalla struttura sottostante del midbrain. Collocare la pinza entro la fessura longitudinale tra gli emisferi, quindi spostare la pinza tra le strutture del midbrain corteccia di un emisfero (perpendicolare alla fenditura longitudinale) pizzicare ogni emisfero gratis.
  6. Utilizzando le pinze, rimuovere tutte le meningi da ogni emisfero (e l'ippocampo), quindi separare ippocampi. Se gli astrociti ippocampali sono necessari, è possibile spostare ogni ippocampo in una provetta da 15 mL riempita con 14 mL di terreno di dissezione su ghiaccio.
  7. Rimuovere ulteriori aree dalla corteccia di ciascun emisfero se regioni specifiche sono necessari (ad es., corteccia frontale). Tagliare qualsiasi tessuto corticale da utilizzare per la generazione di astrociti in pezzi non più grande di 1 mm3. Raccogliere tutti i pezzi di tessuto corticale in un tubo separato 15 mL riempito con il mezzo di dissezione su ghiaccio.

3. tessuto digestione e dissociazione

  1. Una volta che tutti i pezzi di tessuto sono raccolti, attendere per loro di stabilirsi sul fondo del tubo, quindi aspirare tanto supporto, per quanto possibile.
  2. Aggiungere 2-3 mL di tripsina EDTA 0,05% utilizzando una pipetta sierologica e incubare le provette in bagnomaria a 37 ° C per 20 min.
    Nota: Rilasciare tutti tripsina-EDTA dalla pipetta a mescolare i pezzi di tessuto e permettono di depositare ancora rapidamente.
  3. Aspirare accuratamente la tripsina-EDTA, lasciando pezzi di tessuto in come poco liquido possibile, nella parte inferiore del tubo.
  4. Aggiungere 5 mL di mezzo di dissezione pre-raffreddata per lavare via il restante tripsina-EDTA. Pipettare al lato della parte superiore del tubo per ottenere i pezzi di tessuto di miscelazione.
  5. Aspirare il mezzo di dissezione e lasciare i pezzi di tessuto in come poco liquido possibile. Ripetere questo passaggio di lavaggio con il mezzo di dissezione pre-raffreddata altre due volte.
  6. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 1 mL di DMEM + (riscaldato a temperatura ambiente) utilizzando un puntale di 1.000 µ l e triturare il tessuto pipettando su e giù senza introdurre bolle.
    Nota: È importante evitare la produzione di bolle, come questo può cambiare il pH della soluzione, a cui gli astrociti sono molto sensibili.
  7. Collocare un colino di cella di 100 µm nell'apertura di un tubo da 50 mL e pre-bagnato il filtro con 4,5 mL di pre-raffreddata DMEM +.
  8. Pipettare 1 mL di sospensione di tessuto dissociata sul filtro cella e aggiungere un altro 4,5 mL pre-raffreddato DMEM + per lavare le cellule attraverso il filtro delle cellule.

4. cellula placcatura per arricchimento di astrociti di passaggio

  1. Contare le celle, ad esempio, da diluire 10 µ l della sospensione delle cellule con 10 µ l di blu di trypan e pipettaggio il mix su un emocitometro.
  2. Piastra di 500.000 cellule in 12 mL DMEM + per ogni piatto di 10 cm.
    Nota: DMEM + è utile per la crescita astrocytic, tanto più rispetto per i neuroni o microglia. Durante l'agitazione, le forze fisiche che agiscono sulle lamelle di vetro all'interno di pozzi sono molto più forti di quelli che agiscono sui piatti 10 cm (senza lamelle). Se le cellule sono scossi su piastre da 24 pozzetti, diventano insalubri o morire. Solo piastra astrociti su piastre da 24 pozzetti dopo l'agitazione.
  3. Mantenere colture cellulari nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per sette giorni.
  4. Il giorno 6, il giorno prima agitazione e passaggio di cellule, preparare le piastre rivestite con PEI cultura come descritto nel passaggio 5.

5. cellule di passaggio

  1. Il giorno prima di passaggio, cappotto piastre per colture cellulari con 0,04% PEI.
    1. Per immunocitochimica, trasduzione virale o trasfezione di plasmide, utilizzare piastre 24 pozzetti o 6 pozzetti (ciascuno contenente un sterilizzato 12 mm o 25 mm vetrino coprioggetti, rispettivamente).
    2. Sterilizzare le lamelle di vetro tramite incubazione in etanolo al 70% per almeno 1 h, quindi lavare tre volte in acqua deionizzata, distillata prima di mettere i coprioggetti nei pozzetti.
    3. Aggiungere almeno 70 µ l 0,04% PEI al vetrino coprioggetti 12mm in piastre da 24 pozzetti e 600 µ l 0,04% PEI al vetrino coprioggetti 25mm in piastre da 6 pozzetti.
    4. Per Western blot o l'analisi di RNA-Seq, i piatti di 10cm già contenente le celle dopo la dissezione possono continuare ad essere utilizzati. Piatti solo bisogno di essere scosso, quindi le cellule vengono lavate con PBS 1X e trattate con NB + H (non si trasferiscono a nuovi piatti).
  2. Il giorno in vitro (DIV) 7 dopo la dissezione, collocare i piatti di 10 cm con cellule in DMEM + su un agitatore di laboratorio nell'incubatrice e scuotere i piatti a 110 giri/min per 6 h.
  3. Lavare il PEI da lamelle rivestite con acqua deionizzata, distillata due volte. Aggiungere mezzo NB + H alle piastre (500 µ l per pozzetto per piastre da 24 pozzetti e 2 mL per pozzetto per piastre da 6 pozzetti). Pre-equilibrare le piastre nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 mentre tremano i piatti di 10 cm, o per almeno 30 min.
  4. 20-30 min prima della fine dello scuotimento 6h, pre-riscaldare 1 x PBS, DMEM + NB + H e 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C nel bagno d'acqua.
  5. Dopo 6 h di agitazione, togliere i piatti di cultura shaker e sostituire immediatamente il mezzo (che contiene microglia, oligodendrociti e neuroni scosso-off) con 10 mL pre-riscaldati 1X PBS per ogni piatto.
    Nota: È importante aspirare immediatamente il vecchio mezzo contenente cellule indipendente per evitare le cellule non-astrocytic ricollegare.
  6. Rimuovere il PBS e aggiungere 3 mL pre-riscaldato tripsina-EDTA per ogni piatto. Incubare ogni piatto per 4 min in incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
    Nota: Se la preparazione dei campioni per Western blot o RNA-Seq, non aggiungere tripsina-EDTA. Al contrario, sostituire il PBS con 12 mL pre-riscaldati NB + H, dopo di che culture possono essere posizionate indietro nell'incubatrice.
  7. Aggiungere 5 mL pre-riscaldato DMEM + per la tripsina-EDTA 3 mL in ogni piatto, dispensare le cellule fuori il piatto utilizzando una pipetta sierologica di 5ml e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL.
    Nota: Pipetta direttamente dalla parte inferiore del piatto - il piano del piatto dovrebbe diventare più chiaro come staccano le cellule. Solo uso contenenti siero medio (al posto di DMEM +), come siero inattiva la tripsina.
  8. Centrifugare la sospensione cellulare a 3.220 x g a 20 ° C per 4 min.
  9. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL pre-riscaldati NB + H.

6. cella placcatura per finale Astrocyte culture

  1. Contare le celle.
  2. Piastra di 20.000 cellule per pozzetto in piastre da 6 pozzetti (in 2 mL di terreno di NB + H per pozzetto) o 5000 cellule per pozzetto in piastre da 24 pozzetti (in media 500 di NB + H di µ l per pozzetto).
  3. Mantenere le colture di cellule nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 fino ad ulteriore trattamento o analisi.
  4. Cambio di mezzo il mezzo una volta a settimana.
    Nota: In ambienti basso-sostanza nutriente, astrociti interrompere proliferano ma qualsiasi restante microglia prolifereranno (sebbene nella nostra esperienza, nessun microglia apparvero nelle culture AWESAM). Lo scambio mezza il mezzo una volta a settimana previene arricchimento di qualsiasi microglia potenzialmente rimanenti8, e le monocolture rimangano sane per almeno tre settimane.

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Risultati

Gli astrociti che sono co-coltivati con i neuroni e sviluppati in NB + medium appaiono stellari dopo 2 settimane di cultura (Figura 2). Oltre a NB + medio, gli astrociti co-coltivati sono anche esposti a fattori sconosciuti del neurone-derivato che probabilmente contribuiscono alla loro sopravvivenza e la morfologia. Al contrario, gli astrociti MD coltivati in DMEM + come monocolture (dopo aver agitato fuori altri tipi di cella prima del passaggio) appaiono p...

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Discussione

Quattro passi all'interno del protocollo sono fondamentali: 1) preparare la concentrazione di HBEGF e precisamente 5 ng/mL, poiché piccoli aumenti nella concentrazione possono condurre a culture immature, ad esempio, 10 ng/mL HBEGF de-differenziare astrociti4; 2) evita bolle nelle soluzioni che contengono il tessuto o le cellule, che possono cambiare il pH e ostacolare la salute di astrociti; 3) pre-riequilibranti media per raggiungere il pH ottimale e la temperatura per la crescita sani ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Riconosciamo che finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (7 ° PQ/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e il Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% tripsina-EDTAGibco25300054caldo in 37 º C bagnomaria prima dell'uso
0,25% tripsina-EDTAGibco25200-056caldo in 37 º C bagnomaria prima dell'uso
Integratore B-27Gibco17504-04450X stock
GlutamaxGibco35050-061100X stock
Penicillina / streptomicinaGibco15070-06350 stock; penicillina: 5000 U/ml; streptomicina: 5000 µ g/ml
Mezzo neurobasaleGibco21103049senza L-glutammina
DMEM Gibco41966029
HBEGFSigma4643
HEPESGibco15630080
HBSSGibco14170112
FCSGibco10437028
PBSGibco100100491X
100 μ m filtro cellulare in nylonBD352360
Trypan BlueSigmaT8154 
Incubatore per colture cellulariThermo Fisher ScientificHera Cell 240i Incubatore
Agitatore da laboratorioHeidolphRotamax 120 Utilizzo all'interno dell'incubatore per colture cellulari
CentrifugaEppendorf5810 R 
per colture cellulari

Riferimenti

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