Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

Summary

L'obiettivo del presente protocollo è quello di valutare l'effetto dei fattori pro - e anti - migratory su migrazione delle cellule all'interno di una matrice tridimensionale di fibrina.

Abstract

Attualmente, maggior parte dei modelli in vitro di cicatrizzazione, come ben consolidate saggi gratta e Vinci, coinvolgono studiando la chiusura della ferita e di migrazione di cellule su superfici bidimensionali. Tuttavia, l'ambiente fisiologico in cui in vivo di cicatrizzazione avviene è tridimensionale, piuttosto che bidimensionale. Sta diventando sempre più chiaro che il comportamento delle cellule differisce notevolmente in bidimensionale vs ambienti tridimensionali; di conseguenza, c'è una necessità per i modelli più fisiologicamente rilevanti in vitro per studiare i comportamenti di migrazione cellulare in chiusura della ferita. Il metodo descritto nel presente documento consente lo studio della migrazione cellulare in un modello tridimensionale che meglio riflette le condizioni fisiologiche di saggi di gratta e Vinci bidimensionale precedentemente stabiliti. Lo scopo di questo modello è di valutare di conseguenza delle cellule tramite l'esame della migrazione cellulare lontano un corpo sferoide incorporato all'interno di una matrice di fibrina in presenza di fattori pro - o anti - migratory. Utilizzando questo metodo, conseguenza delle cellule dal corpo sferoide in una matrice tridimensionale può essere osservato ed è facilmente quantificabile nel tempo tramite microscopia in campo chiaro e analisi dell'area del corpo di sferoide. L'effetto dei fattori pro-migratori e/o inibitori su migrazione delle cellule possa anche essere valutato in questo sistema. Questo metodo fornisce ai ricercatori con un semplice metodo di analizzare la migrazione cellulare in matrici tridimensionali ferita associata in vitro, aumentando così la rilevanza di in vitro delle cellule studia prima dell'uso di in vivo animale modelli.

Introduction

Guarigione delle ferite è un processo complesso che comporta il ripristino dell'integrità del tessuto dopo la lesione. Questo processo è suddiviso in quattro fasi sovrapposte di emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento, che ciascuno sono regolati da una complessa combinazione di stecche solubile, interazioni cellula-matrice e comunicazioni cellula-cellula. ^{1 , 2} l'orchestrazione di questi spunti controlla una moltitudine di risposte cellulari nella guarigione delle ferite, tra cui, importante, migrazione delle cellule. ^{3 , 4} migrazione ....

Protocol

1. giorno 1: cella e preparazione dei reagenti

Nota: tutti i cellulari e reagente preparazione deve essere eseguita in un armadietto per prevenire la contaminazione dei campioni di sicurezza biologica.

1. Calda filtrata Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM), siero bovino fetale (FBS), L-glutamina e penicillina/streptomicina in bagnomaria a 37 ° C.
2. Media di fibroblasti cutanei umani neonatale (HDFn) di preparare completando riscaldato DMEM con 10% FBS, 1% di penicillina/streptomicina e 1% L-glutammina.
3. Scongelare una fiala di HDFns congelati e centrifugare per 8 min a 200 x g per rimuovere il mezz....

Results

Cultura della sferoide possa essere utilizzata per valutare correttamente l'effetto di agenti pro e anti-migratori sulla migrazione dei fibroblasti in vitro
Sferoidi del fibroblasto 3D possono essere formate tramite sospensione goccia cultura per un periodo di 72 h (Figura 1). Dopo il periodo di coltura, sferoidi sono incorporati all'interno della matrice di coagulo ed imaged utilizzando la microscopia a campo chiaro (.......

Discussion

Questo protocollo permette per l'esame della migrazione cellulare nella guarigione delle ferite associato ECMs attraverso un modello 3D in vitro . Un passo fondamentale nella corretta esecuzione della procedura è il corretto sviluppo di sferoidi del fibroblasto; concentrazione di cellule durante la preparazione è stata ottimizzata per dare una concentrazione iniziale di 2.500 cellule/goccia, permettendo sferoidi per formare in modo affidabile su un periodo di incubazione di 72 h. Se vengono utilizzato un numero .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiali
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4,5 g/L di glucosio, con piruvato di sodio, senza L-glutammina	VWR	VWRL0148-0500	DMEM già contenente L-glutammina può essere utilizzato anche
Piatto di coltura tissutale da 100 mm, non trattato, sterilizzato, non pirogeno	VWR	10861-594	Piatti di qualsiasi dimensione possono essere utilizzati per appendere la coltura delle gocce
Siero fetale bovino proveniente da paesi approvati dall'USDA, inattivato termicamente, filtrato sterile, testato in coltura cellulare	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutammina	Fisher Scientific	ICN1680149	Non necessario se si utilizza DMEM che contiene già L-glutammina...
Soluzione di penicillina-streptomicina stabilizzata, filtrata in modo sterile, con 10.000 unità di penicillina e 10 mg di streptomicina/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Fibroblasti dermici umani, neonatale	Thermo Fisher	C0045C	Può essere sostituito con un altro tipo di cellula di interesse
21 G x 1 1/2' ago	BD	305167	aghi da 22 G x 1 1/2 funzionano anche
siringa da 1 mL	VWR	89174-491	È possibile utilizzare siringhe di qualsiasi volume
Piastre multipozzetto per colture cellulari, polistirene, Greiner Bio-One (avvolgimento individuale) (48 pozzetti)	VWR	82051-004
Fibrinogeno umano - Plasminogeno, fattore di von Willebrand e fibronectina Laboratori	ricerca sugli enzimi	FIB 3	Può essere sostituito con una proteina della matrice di interesse
Laboratori di ricerca sugli enzimi	alfa trombina umana	HT 1002a	Potrebbe non essere necessario a seconda della proteina della matrice di interesse
Equipment
			per colture cellulari BSL2
Incubatore
Microscopio invertito con obiettivo
Centrifuga compatibile con provette