Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Nan Zhang; Liakot A Khan; Edward Membreno; Gholamali Jafari; Siyang Yan; Hongjie Zhang; Verena Gobel

doi:10.3791/56100

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Articolo metodologico

Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

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DOI:

10.3791/56100

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3 ottobre 2017

Nan Zhang¹^,² , Liakot A Khan¹ , Edward Membreno¹ , Gholamali Jafari¹ , Siyang Yan¹ , Hongjie Zhang¹^,³ , Verena Gobel¹

¹Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ²College of Life Sciences, Jilin University, ³Faculty of Health Sciences, University of Macau

In questo articolo

Sommario

Il trasparente c. elegans intestino può servire come una"nel vivo del tessuto camera" per lo studio della biogenesi di membrana e lume di apicobasal a livello di singola cellula e subcellulare durante tubulogenesis multicellulari. Questo protocollo viene descritto come combinare etichettatura standard, perdita di funzione genetica/RNAi e approcci al microscopio dissezionare questi processi a livello molecolare.

Abstract

Multicellulari tubi, unità fondamentali degli organi interni, sono composti da cellule endoteliali o epiteliali polarizzate, con membrane apicali che rivestono le membrane lumen e basolaterale contattando reciprocamente e/o la matrice extracellulare. Come questa asimmetria di membrana distintivo è stabilita e mantenuta durante la morfogenesi dell'organo è ancora una questione irrisolta della biologia delle cellule. Questo protocollo descrive l'intestino di c. elegans come un modello per l'analisi della biogenesi della membrana polarizzata durante la morfogenesi del tubo, con enfasi sulla biogenesi di lumen e membrana apicale. C. elegans venti celle singolo-stratificato epitelio intestinale è organizzato in un semplice tubo bilateralmente simmetrico, permettendo l'analisi a livello di singola cellula. Polarizzazione di membrana si verifica in concomitanza con polarizzato la divisione cellulare e la migrazione durante l'embriogenesi precoce, ma de novo polarizzati biogenesi della membrana continua in tutto la crescita larvale, quando le cellule non proliferano e spostare. L'impostazione di quest'ultimo consente di separare cambiamenti sottocellulari che contemporaneamente mediano questi diversi processi di polarizzazione, difficili distinguere nella maggior parte dei modelli di polarità. Apicale-, basolaterale della membrana-, giunzionale-, del citoscheletro- ed endomembrane componenti possono essere etichettati e monitorati durante lo sviluppo di proteine di fusione di GFP o valutati da in situ dell'anticorpo che macchia. Insieme versatilità genetica dell'organismo, l'intestino di c. elegans fornisce così un modello unico in vivo per l'oggetto visual, inerente allo sviluppo e l'analisi genetica molecolare della membrana polarizzata e biogenesi di tubo. I metodi specifici (tutti gli standard) descritti qui includono come: etichetta componenti sottocellulari intestinale dalla macchiatura dell'anticorpo; analizzare i geni coinvolti nella biogenesi della membrana polarizzata da studi di perdita-de-funzione adattati ai geni essenziali in genere tubulogenesis; valutare i difetti di polarità durante varie fasi di sviluppo; interpretare i fenotipi di epifluorescenza, contrasto differenziale di interferenza (DIC) e microscopia confocale; quantificare i difetti visivi. Questo protocollo può essere adattato per analizzare qualsiasi delle molecole coinvolte spesso altamente conservate in polarità epiteliale, la biogenesi della membrana, morfogenesi tubo e lume.

Introduzione

La generazione delle asimmetrie cellulare e subcellulare, quali la formazione di domini di membrana polarizzata, è cruciale per la morfogenesi e la funzione di cellule, tessuti ed organi¹. Gli studi sulla biogenesi della membrana polarizzata negli epiteli rimangono una sfida tecnica, dato che i cambi di direzione nella ripartizione dei componenti sottocellulari dipendono più consecutivi e coincidenti segnali extracellulari ed intracellulari che sono difficili da separare nella maggior parte dei modelli e dipendono fortemente dal sistema modello. Il modello presentato qui - singolo-stratificato Caenorhabditis elegans intestino - è un te....