Qui presentiamo indirizzabile gocciolina microarrays (ADMs), un metodo di matrice basata gocciolina in grado di determinare l'abbondanza assoluta della proteina in cellule singole. Dimostriamo la capacità di ADMs per caratterizzare l'eterogeneità nell'espressione della proteina oncosoppressore p53 in una linea cellulare di cancro umano.
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Articolo metodologico
Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comportamento spesso cellulare e risposte cellulari vengono analizzate a livello di popolazione, dove le risposte di molte cellule sono raggruppate insieme come un risultato medio il comportamento ricco singola cella all'interno di una popolazione complessa di mascheramento. Tecnologie di rilevazione e quantificazione della proteina singola cella hanno avuto un impatto notevole negli ultimi anni. Qui descriviamo una piattaforma di analisi unicellulare pratico e flessibile basata su microarrays gocciolina indirizzabile. Questo studio descrive come i numeri di copia assoluta di proteine bersaglio possono essere misurati con risoluzione di singola cellula. L'oncosoppressore p53 è il gene più comunemente mutato nel cancro umano, con oltre il 50% dei casi di cancro totale che esibiscono un modello di espressione di p53 non sani. Il protocollo descrive la procedura per creare 10 gocce nL entro il quale le cellule tumorali umane singolo sono isolate e il numero di copie della proteina p53 è misurato con risoluzione di singola molecola per determinare con precisione la variabilità nell'espressione. Il metodo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula compreso il materiale primario per determinare il numero di copia assoluta di qualsiasi proteine bersaglio di interesse.
Introduzione
L'obiettivo di questo metodo è quello di determinare la variazione in abbondanza di una proteina dell'obiettivo in una popolazione di cellule con risoluzione di singola cellula. Analisi unicellulare fornisce una serie di vantaggi che non sono disponibili con metodi biochimici ensemble tradizionale. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in primo luogo, lavorare a livello di singola cellula può catturare l'eterogeneità ricca di una popolazione di cellule che altrimenti andrebbero persi il calcolando che si verifica con tecniche ....
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Protocollo
1. preparazione
-
Rendere il chip e stampa anticorpo microarrays
- Allegare un isolatore di adesivo in silicone/acrilico per un vetrino coprioggetti funzionalizzato per supportare un microarray dell'anticorpo. Questa è detta il chip.
Nota: Vari processi chimici superficiali sono stati testati per la loro idoneità con le goccioline di indirizzabile. 5 composizioni chimiche di superficie potrebbero essere necessario essere ottimizzato per gli agenti alternativi cattura. Isolatori ADM sono commercialmente disponibili o potrebbero essere prodotte da acrilico di taglio del laser (CAD file per isolatore utilizzato....
- Allegare un isolatore di adesivo in silicone/acrilico per un vetrino coprioggetti funzionalizzato per supportare un microarray dell'anticorpo. Questa è detta il chip.
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Risultati
Il numero di copia assoluta basale della proteina di p53 è stato determinato con risoluzione singola cella in una linea cellulare di cancro del colon umano, le cellule BE. Dimostriamo come espressione di p53 può variare nel corso di diversi ordini di grandezza e mostrano una correlazione positiva debolmente tra numero di copia dimensioni e proteina delle cellule all'interno della popolazione di cellule BE riposo.
Indirizzabile g.......
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Discussione
Indirizzabile gocciolina Microarrays sono un metodo sensibile ed estensibile per determinare quantitativamente il numero assoluto di copia della proteina all'interno di una singola cella.
Limitare il livello di legame aspecifico (NSB) è critico all'interno del protocollo al raggiungimento di un limite di rilevazione possibile come basso. Proteine e altre specie biochimiche non specifico può associare a un numero di interfacce presenti all'interno le goccioline — la superficie del vetrino copri.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
ASR progettato esperimenti, sviluppato protocolli e analizzato i dati. SC e PS eseguiti esperimenti di dimensione di cella. ASR e OC ha scritto il manoscritto. Gli autori desiderano riconosciamo con gratitudine il sostegno della Prof. ssa David R. Klug per l'accesso alle attrezzature. Gli autori desiderano ringraziare l'imperiale Hackspace di Advanced ha per l'accesso alle strutture di prototipazione e fabbricazione College.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Coltura cellularecon | |||
| fosfato (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM ad alto glucosio | Sigma | D6429 | |
| Siero bovino fetale (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| Corning | SIAL0639 | ||
| Tripsina/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, Regno Unito | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Vetrini coprioggetti (Nexterion) | Schott, Europa | 1098523 | Dimensioni (mm): 65,0 x 25,0; Spessore (mm) 0,17 |
| p53 anticorpo di cattura | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 anticorpo di rilevamento, Alexa Fluor 488 marcato | Santa Cruz | sc-126 | concentrazione di stock 200μ g/mL |
| Tampone citrato di sodio-soluzione salina | Gibco | 15557-044 | |
| Betaina | Sigma | 61962 | |
| Solfato di sodio dodecilsolfato | Sigma | L3771 | |
| Piastra a 384 pozzetti (basso volume) | Bombola di gas di | CLS4511 | |
| BOC | Grado industriale, privo | ||
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipolatore | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Microiniettore manuale | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Danimarca | MBB-FP-L-0 | |
| Pompe a siringa | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μ Siringa L | Hamilton | 81020 | A tenuta di gas, PTFE Luer lock |
| Siringa da 1 mL | Hamilton | 81327 | A tenuta di gas, PTFE Luer lock |
| Isolatore in silicone | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | Isolatore in silicone 6x4 pozzetti con taglierina laser adesiva |
| VersaLASE | VLS2.30 Laser CO2 3W | per il taglio laser di isolatori personalizzati Lastra | |
| acrilica di 1 mm di spessore | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | per il taglio laser di isolatori personalizzati |
| Foglio adesivo | 3M | utilizzato per far aderire isolatori personalizzati a vetrini coprioggetti microarrayed Super | |
| colla | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μ m ID/360 μ m Tubo in silice fusa con diametro esterno | IDEX | FS-115 | |
| 1,0 mm ID/1/16" Tubo OD PFA | IDEX | 1503 | |
| 0.014" ID/0,062 pollici Tubo in PTFE OD | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1,0 mm ID/2,0 mm OD FEP tubo | IDEX | 1673 | |
| Albume sierico bovino (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Olio minerale | Sigma | M5904 | |
| Acqua ultrapura | Millipore, Germania | MilliQ | |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Microscopy & Microscopio ottico | |||
| TIRF con tavolino XY codificato | Nikon, Giappone | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Irlanda | IXON DU-897E | |
| Sorgente di eccitazione laser | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Sorgente laser a lisi ottica | Continuum, USA | Microscopio Surelite SLI-10 | |
| cubo filtrante per TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Cubo filtrante per microscopio laser a lisi ottica | 2000, Regno Unito | LPD01-532R-25 | |
| Nome | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Software | |||
| analisi delle immagini | Open Source | delle Figi | |
| Matlab | Mathworks | versione 7.14 o superiore | di analisi delle immagini |
Riferimenti
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development.....
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Ristampe e permessi
Tag
Rilevazione di proteine a singola cellulaNumero assoluto di copie proteicheRisoluzione a singola cellulaQuantificazione della proteina p53Microscopia TIRF a singola molecolaProtocollo di formazione di gocciolineProcedura di lisi cellulareAnticorpo di rilevazione fluorescenteAnalisi di cellule cancerose
