Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.
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Articolo metodologico
Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido
In questo articolo
Sommario
Abstract
Attuali tendenze nella scienza e nella biotecnologia portano alla creazione di migliaia di nuove linee in organismi modello, determinando così la necessità di nuovi metodi per la conservazione delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Crioconservazione delle cellule di germe iniziale di testicoli interi NIV offre possibilità per lo stoccaggio di zebrafish risorse genetiche, soprattutto perché dopo il trapianto può maturare in gameti maschili e femminili. Testicoli sono stati asportati, appuntato su un ago di agopuntura, equilibrato in due mezzi di Crioprotettivi (soluzione di equilibrazione contenente metanolo di 1,5 M e 1,5 M glicole propilenico; e soluzione di vitrificazione contenente dimetilsolfossido di 3 M e 3 M glicole propilenico) e ' immerso in azoto liquido. I campioni venivano riscaldati in una serie di tre soluzioni di riscaldamento conseguente. I principali vantaggi di questa tecnica sono (1) la mancanza di spermatozoi dopo digestione dei testicoli riscaldati, facilitando così le manipolazioni a valle; (2) ultra-rapido raffreddamento che permette l'esposizione ottima dei tessuti a azoto liquido quindi massimizzare il raffreddamento e ridurre la concentrazione necessaria di crioprotettori, riducendo la loro tossicità; (3) esposizione sincrono dei testicoli parecchie ai crioprotettori e azoto liquido; e ripetibilità (4) dimostra come ottenere redditività di oltre il 50% in cinque differenti zebrafish ceppi.
Introduzione
Nuove tendenze nella scienza e nella biotecnologia hanno portato alla creazione di migliaia di nuove linee mutanti di topo, Drosophila, zebrafish e altre specie utilizzate come organismi modello in biomedica e altre scienze1. Inoltre, come nuove tecnologie vengono sviluppate e diventano disponibili, i numeri di linee mutanti costantemente aumentano2. Questo porta alla necessità per una conservazione sicura delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Come un metodo che consente l'archiviazione sicura delle risorse genetiche per un periodo di tempo indefinito, crioconservazi....
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati il diritto ungherese del benessere animale.
1. preparazione dei reagenti
- Soluzioni di riserva
- Preparare 1 M trealosio aggiungendo 0,378 g di trealosio diidrato in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.
- Preparare 1 M saccarosio aggiungendo 0,342 g di saccarosio in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.
- Preparare 1 M HEPES aggiungendo 0,238 g di HEPES a 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.
- Preparare della collagenosi 20 mg/mL (290 U/mg....
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Risultati
In media, il numero delle cellule di germe iniziale isolato da un testicolo singolo zebrafish fresco variava tra 40.000 e 200.000 cellule a seconda delle dimensioni del pesce. Quando nei testicoli di zebrafish fresco in tutti i 5 ceppi di digestione, cellule germinali primi non erano sola cellule presenti nelle sospensioni delle cellule (Figura 2). Al lato delle cellule di germe iniziale, numerosi gli spermatozoi sono stati trovati pure. D'altra parte, c'eran.......
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Discussione
Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso ultra-rapida procedura di raffreddamento sviluppato per specie di uccelli e mammiferi10,11,12 per la crioconservazione del testicolo di pesce (zebrafish come modello organismo). La maggior parte degli studi precedenti per quanto riguarda la crioconservazione delle risorse genetiche di zebrafish erano principalmente concentrata sulla crioconservazione di zebrafish.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dai nazionali di ricerca, sviluppo e innovazione ufficio d'Ungheria (grant 116912 a MÀY), l'ufficio di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE), al programma di borse di Hungaricum Stipendium (grant a ZM) e il nuovo Hungarian National eccellenza Predoctoral Fellowship (grant a EK).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Integrato con L-glutammina |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaina metansolfonato (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Saccarosio | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trealosio | Acros Organics | 99-20-7 | Metanolo Diidrato |
| Reanale | 20740-0-08-65 | ||
| Glicole propilenico | Reanale | 08860-1-08-65 | |
| Dimetil solfossido | Reanale | 00190-1-01-65 | |
| Collagenasi | Gibco | 9001-12-1 | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Compresse per la preparazione di 200 ml di soluzione PBS |
Riferimenti
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M.
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Ristampe e permessi
