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Articolo metodologico

Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido

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DOI:

10.3791/56118

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4 marzo 2018

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1Department of Aquaculture, Szent István University

In questo articolo

Sommario

Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.

Abstract

Attuali tendenze nella scienza e nella biotecnologia portano alla creazione di migliaia di nuove linee in organismi modello, determinando così la necessità di nuovi metodi per la conservazione delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Crioconservazione delle cellule di germe iniziale di testicoli interi NIV offre possibilità per lo stoccaggio di zebrafish risorse genetiche, soprattutto perché dopo il trapianto può maturare in gameti maschili e femminili. Testicoli sono stati asportati, appuntato su un ago di agopuntura, equilibrato in due mezzi di Crioprotettivi (soluzione di equilibrazione contenente metanolo di 1,5 M e 1,5 M glicole propilenico; e soluzione di vitrificazione contenente dimetilsolfossido di 3 M e 3 M glicole propilenico) e ' immerso in azoto liquido. I campioni venivano riscaldati in una serie di tre soluzioni di riscaldamento conseguente. I principali vantaggi di questa tecnica sono (1) la mancanza di spermatozoi dopo digestione dei testicoli riscaldati, facilitando così le manipolazioni a valle; (2) ultra-rapido raffreddamento che permette l'esposizione ottima dei tessuti a azoto liquido quindi massimizzare il raffreddamento e ridurre la concentrazione necessaria di crioprotettori, riducendo la loro tossicità; (3) esposizione sincrono dei testicoli parecchie ai crioprotettori e azoto liquido; e ripetibilità (4) dimostra come ottenere redditività di oltre il 50% in cinque differenti zebrafish ceppi.

Introduzione

Nuove tendenze nella scienza e nella biotecnologia hanno portato alla creazione di migliaia di nuove linee mutanti di topo, Drosophila, zebrafish e altre specie utilizzate come organismi modello in biomedica e altre scienze1. Inoltre, come nuove tecnologie vengono sviluppate e diventano disponibili, i numeri di linee mutanti costantemente aumentano2. Questo porta alla necessità per una conservazione sicura delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Come un metodo che consente l'archiviazione sicura delle risorse genetiche per un periodo di tempo indefinito, crioconservazione offre molti vantaggi come estensione della stagione riproduttiva, aggira la necessità per la manutenzione continua dei riproduttori, ed è più costo - e Labor-efficiente2.

Protocolli per la crioconservazione di spermatozoi sviluppato durante il passato parecchi anni2,3,4 offrono la possibilità di successo deposito di materiale genetico maschile di zebrafish. Tuttavia, la crioconservazione degli ovuli o embrioni di pesce non è ancora possibile grazie alla loro struttura complessa e di grandi quantità di materiale di tuorlo. Recentemente, la pratica del trapianto di cellule primordiali germinali (PGC) o cellule staminali spermatogoniali (SSCs) offre un bypass per questa barriera di svilupparsi dopo trapianto5in funzionali degli spermatozoi e uova. Crioconservazione delle CSS offre quindi una nuova frontiera nella conservazione delle risorse genetiche rare e preziose.

Anche se crioconservazione offre molti vantaggi, il processo di congelamento lento-tasso genera diverse condizioni che possono portare a cella danno2. Questi includono la formazione di ghiaccio intracellulare ed extracellulare, disidratazione, tossicità crioprotettore e altri. Ghiaccio intracellulare danneggia le cellule, ghiaccio extracellulare può portare a frantumazione meccanica delle cellule, mentre la diffusione dell'acqua dalle cellule durante il congelamento lento-tasso può condurre a disidratazione6. Recentemente, vetrificazione come una tecnica che impedisce gli effetti negativi della formazione di ghiaccio è stata applicata nella crioconservazione di gameti di pesce7,8,9. Esso presenta una tecnica di raffreddamento ultra-rapida attraverso il quale i mezzi di comunicazione interne ed esterne trasformare in uno stato amorfo/vetroso senza cristallizzazione in ghiaccio7,10. Vetrificazione successo del tessuto testicolare e ovarico è stata provata in specie di uccelli e mammiferi10,11,12, aprendo così la possibilità per la sua applicazione in pesce, pure.

In questo studio, presentiamo la procedura di vitrificazione (NIV) ago immerso per la crioconservazione di zebrafish tutta i testicoli. Dimostriamo un metodo affidabile per l'isolamento di cellule germinali di zebrafish fase iniziale senza contaminazione e un processo di crioconservazione che produce quantità elevate relativamente precoce delle cellule di germe con una bassa presenza di altre cellule, soprattutto gli spermatozoi. Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo studio a dimostrare un protocollo dettagliato visualizzato in quel momento per ultra-rapido raffreddamento del tessuto gonadico pesce e cellule germinali zebrafish. Inoltre, è evidenziato la ripetibilità del metodo in cinque differenti zebrafish ceppi: AB wild-type, casper (roy- / -; madreperla- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linea transgenica di Wilms tumore [Tg (wt1b::eGFP 1)].

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati il diritto ungherese del benessere animale.

1. preparazione dei reagenti

  1. Soluzioni di riserva
    1. Preparare 1 M trealosio aggiungendo 0,378 g di trealosio diidrato in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.
    2. Preparare 1 M saccarosio aggiungendo 0,342 g di saccarosio in 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.
    3. Preparare 1 M HEPES aggiungendo 0,238 g di HEPES a 1 mL di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente.
    4. Preparare della collagenosi 20 mg/mL (290 U/mg) con l'aggiunta di 100 mg a 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.
    5. Preparare la tripsina 15mg/mL (~ 10000 U/mg) con l'aggiunta di 75 mg per 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.
    6. Preparare 1 mg/mL dnasi I (~ 3000 U/mg) con l'aggiunta di 5 mg a 5 mL di PBS. Mescolare accuratamente fino a quando non si scioglie. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 50 µ l in 0,2 mL PCR tubi e congelare a - 20 ° C.
    7. Preparare 0,4% trypan blu aggiungendo 40 mg di trypan blu a 10 mL di PBS. Filtro sterile attraverso filtri di 0,2 µm. Aliquotare 1 mL in provette da 1,5 mL.
    8. Preparare 200 mg/L MS-222 (tricaina solfonato di metano) con l'aggiunta di 200 mg di MS-222 in 1 L di dH2O. Mix bene fino a quando si scioglie completamente. Inoltre, soluzione tampone il MS-222 con bicarbonato di sodio per un pH neutro di 7.0.
  2. Soluzioni per la vitrificazione
    1. Preparare la soluzione di equilibrazione (ES): preparare 2 mL di ES mescolando 121,5 µ l di metanolo (MeOH; 1,5 M), 220 µ l di glicole propilenico (PG; 1,5 M), 200 µ l di FBS (10%), 200 µ l di soluzione madre di trealosio (0,1 M), 50 µ l di soluzione madre HEPES (25 mM) e 1208.5 µ l di L-15 in un 2 tubo da mL.
    2. Preparare la soluzione di vitrificazione (VS): preparare 2 mL di VS mescolando 439 µ l di PG (3 M), 426 µ l di solfossido dimetilico (Me2così; 3M), 200 µ l di FBS (10%), 200 µ l di soluzione madre di trealosio (0,1 M), 50 µ l di HEPES stock soluzione (25 mM) e 685 µ l di L-15 in un provetta da 2 mL.
  3. Soluzioni per il riscaldamento
    1. Preparare la soluzione di riscaldamento 1 (WS1): preparare 1,5 mL di WS1 in una provetta da 2 mL con 150 µ l di FBS (10%), 450 µ l di soluzione madre di saccarosio (3 M) e 900 µ l di L-15.
    2. Preparare soluzione scaldavivande 2 (WS2): preparare 1,5 mL di WS2 in una provetta da 2 mL con 150 µ l di FBS (10%), 150 µ l di soluzione madre di saccarosio (1 M) e 1200 µ l di L-15.
    3. Preparare la soluzione di riscaldamento 3 (WS3): preparare 1,5 mL di WS2 in una provetta da 2 mL di miscelazione 150 µ l di FBS (10%) e 1350 µ l di L-15.
  4. Preparare la soluzione di digestione: per ogni campione preparare 500 µ l della soluzione digestione mescolando 50 µ l di soluzione madre di collagenasi (2 mg/mL), 50 µ l di soluzione madre di tripsina (1,5 mg/mL), 10 µ l di dnasi I (20 µ g/mL) e 390 µ l di L-15 in un mL 2 tubo.
  5. Ottenere strumenti di dissezione: forbici, microforbici, pinzette, Pinzette curve e aghi per agopuntura.

2. testicoli collezione

  1. Eutanasia il pesce mettendolo in un piatto contenente 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Prima di continuare con la dissezione, assicurarsi che le branchie hanno smesso di muoversi e che almeno 10 minuti sono passati da quel momento per garantire la morte da ipossia.
  2. Asciugate il pesce da pacche su un tovagliolo di carta e posizionarlo sul lato dorsale su una stuoia di dissezione.
    1. In primo luogo tagliare le pinne pettorali e pelviche per dissezione più facile.
    2. Orizzontalmente snip la pelle sul ventre del pesce tra le pinne pettorali e tagliare la pelle e il muscolo di fondo lungo il ventre fino alla pinna anale.
    3. Aprire la cavità del corpo del pesce e il pin la parete del corpo sinistra e destra al tappeto di dissezione con aghi.
      Nota: I testicoli si trovano sopra gli organi gastrointestinali su entrambi i lati della vescica natatoria (Figura 1).
  3. Per evitare la contaminazione, non estrarre gli organi gastrointestinali, ma delicatamente spingerle verso un lato e rimuovere il testicolo dal lato avversario. Testicoli sono collegati alla parete del corpo quindi rimuoverli con attenzione e tagliare il collegamento peritoneo di microforbici.
  4. Inoltre, al fine di prevenire la contaminazione, in primo luogo sterilizzare i testicoli da metterli in etanolo al 70% per 2 s e quindi posto loro in L-15 su una piastra a 96 pozzetti sul ghiaccio.
    Nota: Se è necessario, testicoli puliti dal tessuto adiposo e grandi vasi precisamente sotto lo stereomicroscopio sanguigni

3. ultra-rapido raffreddamento del tessuto testicolare

  1. Aghi di Mark con etichette appropriate a seconda del campione digitare e preparano l'equilibrazione (ES) e soluzioni di vitrificazione (VS).
  2. Trasferire i testicoli in una piastra ben più grande o piatto e perno a due testicoli (o più a seconda delle dimensioni dell'ago) su un ago di agopuntura sterili.
    1. In primo luogo posizione del testicolo in cima curve pinzette. Mettere la punta dell'ago nel mezzo del testicolo e tirare verso l'alto il testicolo con le pinzette.
    2. Dopo perforazione del testicolo, tirarlo delicatamente verso l'alto verso la parte superiore dell'ago. Assicurarsi che i testicoli sono separati gli uni dagli altri e che non vengano a cadere o scivolare giù.
    3. Luogo pieno di aghi con i testicoli appuntati in una provetta da 2 mL con L-15 fino a vetrificazione (a 25 ˚ c; tempo di conservazione non deve superare 1 h).
      Nota: Pinning i testicoli dell'ago dovrebbe essere fatto velocemente per evitare i testicoli dall'asciugarsi.
  3. Trasferire l'ago con i testicoli in soluzione di equilibrazione e incubare per 5 min a 25 ˚ c.
  4. Trasferire l'ago nella soluzione di vitrificazione e incubare per 30 s a 25 ˚ c.
  5. Rimuovere l'ago dalla soluzione di vitrificazione, rapidamente e delicatamente assorbire la soluzione rimanente dal tessuto di un tovagliolo di carta sterile. Usare cautela per evitare i testicoli che attacca per il tovagliolo di carta o cadere.
  6. Inserire rapidamente l'ago nell'azoto liquido, posizionato in una scatola di polistirolo.
    Nota: Fare questo passo rapidamente per evitare l'esposizione del tessuto per il vapore di azoto liquido. Utilizzare volumi bassi di azoto liquido per evitare la contaminazione incrociata dei campioni.
  7. Tenere l'ago in azoto liquido in una scatola di polistirolo chiusa per 5-10 min.
  8. Preraffreddare un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA aperto 4,5 mL e il tappo nella stessa casella.
  9. Dopo 5-10 min, trasferire ogni ago in un separato stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA sotto la superficie dell'azoto liquido e chiudere lo stoccaggio provette criogenia.
    Attenzione: Utilizzare sempre abbigliamento protettivo (quali guanti isolanti) quando lavorare con azoto liquido come esposizione può portare a gravi congelamenti.
  10. Posizionare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA su una canna di metallo e posizionarlo nel sebatoio criobanca velocemente come possibile. Conservare i campioni in un deposito di contenitore dewar fino all'ulteriore utilizzo.

4. procedura di riscaldamento

  1. Riscaldare ogni ago separatamente. Tutte le soluzioni di riscaldamento dovrebbero essere a 25 ° C.
  2. Staccare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA dalla canna in metallo e immergerlo nell'azoto liquido memorizzato in una scatola di polistirolo.
  3. Aprire lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA nel vapore di azoto liquido (utilizzando forcipe) e rilasciare l'ago nell'azoto liquido.
  4. Trasferire l'ago molto veloce nella prima soluzione di riscaldamento e incubare per 1 min (a 25 ° C). Assicurarsi di trasferire l'ago rapidamente per evitare il suo riscaldamento nell'aria durante il trasferimento.
  5. Trasferire l'ago nella seconda soluzione scaldavivande e incubare per 3 min (a 25 ° C).
  6. Trasferire l'ago nella terza soluzione scaldavivande e incubare per 5 min (a 25 ° C).
  7. Rilasciare i testicoli dall'ago di facendole scorrere verso il basso con una pinzetta curva. Luogo ogni testicolo riscaldato individualmente in un pozzo separato (piastra a 96 pozzetti) riempito con 250 µ l di L-15 supplementato con 10% FBS. Assicurarsi che i pozzi sono etichettati secondo il campione. Tenere la piastra ben su ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono riscaldati e fino ad ulteriore lavoro.

5. tessuto digestione

  1. Preparare 500 µ l di soluzione di dissociazione per ciascun campione in provette separate da 2 mL. Etichettare le provette secondo il codice del campione. Incubare la soluzione preparata dissociazione per 5 min a temperatura ambiente.
  2. Aggiungere il tessuto riscaldato nella soluzione di digestione e tagliarlo in piccoli pezzi da almeno 30 movimenti di piccole forbici.
  3. Incubare il tessuto tagliato su una piastra di agitazione per 90 min a 25 ˚ c.
  4. Interrompere il processo di digestione aggiungendo 400 µ l di L-15 e 100 µ l di FBS (FBS 10% v/v). Brevemente, agitare bene la soluzione e incubare per 1 min a temperatura ambiente.
  5. Filtrare la soluzione ottenuta attraverso 50 µm filtri in una provetta da 1,5 mL. Etichettare le provette di conseguenza.
  6. Centrifugare la soluzione filtrata a 200 × g per 10 min a 25 ˚ c.
  7. Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 20 µ l di L15 supplementato con 10% FBS. Agitare manualmente il tubo fino a che il pellet sia completamente disciolta. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio o a 4 ° c fino al successivo utilizzo.

6. valutazione vitalità e conta cellulare

  1. Mix 5 µ l di sospensione cellulare e 5 µ l di soluzione di blu di trypan 0,4% in una provetta PCR adeguatamente etichettata 0,2 mL. Se vengono utilizzati diversi volumi, assicurarsi che il rapporto di diluizione di 1:1 rimane.
  2. Incubare la sospensione per 1 a 3 min a temperatura ambiente (25 ° C).
  3. Verifica la fattibilità di ogni campione in un emocitometro sotto il microscopio.
  4. Contare il numero di cellule vive (senza macchia di tripan blu) in 15 campi. Calcolare il numero totale di cellule in 20 µm della sospensione delle cellule. La sospensione è ora pronta per qualsiasi applicazione a valle.
    Nota: Quando si ottimizza la procedura per le altre specie con corpo più grande, utilizzare frammenti di testicolo di uguale peso. Utilizzare testicoli da un individuo per tutti i gruppi sperimentali al fine di evitare la variabilità individuale nei risultati. Nel caso di zebrafish, abbiamo approfittato del fatto che sinistra e testicolo di destra deve contenere un numero pari (o molto simile) di cellule germinali13 (vedere i risultati di rappresentante). Il testicolo di sinistra è stato mantenuto come controllo mentre il testicolo di destra era vetrificato/riscaldati. Percentuale di redditività è stato calcolato il numero di cellule isolate dal testicolo vetrificato/riscaldato rispetto al numero di cellule isolate dal testicolo fresco.

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Risultati

In media, il numero delle cellule di germe iniziale isolato da un testicolo singolo zebrafish fresco variava tra 40.000 e 200.000 cellule a seconda delle dimensioni del pesce. Quando nei testicoli di zebrafish fresco in tutti i 5 ceppi di digestione, cellule germinali primi non erano sola cellule presenti nelle sospensioni delle cellule (Figura 2). Al lato delle cellule di germe iniziale, numerosi gli spermatozoi sono stati trovati pure. D'altra parte, c'eran...

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Discussione

Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso ultra-rapida procedura di raffreddamento sviluppato per specie di uccelli e mammiferi10,11,12 per la crioconservazione del testicolo di pesce (zebrafish come modello organismo). La maggior parte degli studi precedenti per quanto riguarda la crioconservazione delle risorse genetiche di zebrafish erano principalmente concentrata sulla crioconservazione di zebrafish...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dai nazionali di ricerca, sviluppo e innovazione ufficio d'Ungheria (grant 116912 a MÀY), l'ufficio di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE), al programma di borse di Hungaricum Stipendium (grant a ZM) e il nuovo Hungarian National eccellenza Predoctoral Fellowship (grant a EK).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Leibovitz media (L-15)Sigma-AldrichL1518Integrato con L-glutammina
Siero fetale bovino (FBS)Sigma-AldrichF9665
Tricaina metansolfonato (MS-222)Sigma-AldrichE10521
HEPESSigma-AldrichH3375
SaccarosioAcros Organics57-50-1
TrealosioAcros Organics99-20-7Metanolo Diidrato
Reanale20740-0-08-65
Glicole propilenicoReanale08860-1-08-65
Dimetil solfossidoReanale00190-1-01-65
CollagenasiGibco9001-12-1
TripsinaSigma-AldrichT8003
DNase IPanreac AppliChemA3778
Trypan blueSigma-AldrichT6146
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4417Compresse per la preparazione di 200 ml di soluzione PBS

Riferimenti

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