Utilizzo di una zanzara ricombinante Densovirus come un vettore di consegna del Gene per l'analisi funzionale di geni in larve di zanzara

Sommario

Segnaliamo che utilizzando un'artificiale intronic piccolo RNA espressione strategia per sviluppare un ricombinante non difettosi Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo sistema di consegna. È descritta una procedura dettagliata per la costruzione, imballaggio e analisi quantitativa dei vettori rAaeDV anche per quanto riguarda l'infezione larvale.

Abstract

Microiniezione in vivo è la tecnica di trasferimento del gene più comunemente usati per analizzare la funzione genica nelle zanzare individuali. Tuttavia, questo metodo richiede una più tecnicamente impegnativa operazione e comporta procedure complicate, soprattutto quando viene utilizzato nelle larve a causa della loro piccola dimensione, cuticola relativamente sottile e fragile e alta mortalità, che limitano la sua applicazione. Al contrario, vettori virali per la consegna del gene sono stati sviluppati per superare barriere extracellulari ed intracellulari. Questi sistemi presentano i vantaggi di facile manipolazione, efficienza di trasduzione genica alta, manutenzione a lungo termine dell'espressione genica e la capacità di produrre gli effetti persistenti in vivo. Zanzara densoviruses (MDVs) sono specifici di zanzara, piccolo virus a DNA singolo filamento può trasportare efficacemente esteri acidi nucleici nelle cellule di zanzara; Tuttavia, la sostituzione o l'inserimento di geni estranei per creare virus ricombinante in genere comporta una perdita di capacità di imballaggio e/o replica, che è una barriera allo sviluppo di questi virus come vettori di consegna.

Qui, segnaliamo che usando una strategia artificiale intronic piccolo-RNA espressione per sviluppare un ricombinante non difettosi Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo sistema di consegna. Sono descritte le procedure dettagliate per la costruzione, imballaggio e analisi quantitativa dei vettori rAaeDV e per infezione larvale.

Questo studio dimostra, per la prima volta, la possibilità di sviluppare un non-difettosi ricombinante MDV micro RNA (miRNA) sistema di espressione e quindi fornire un potente strumento per l'analisi funzionale dei geni nella zanzara stabilendo una base per la applicazione di paratransgenesis virale per controllare le malattie trasmesse dalle zanzare. Abbiamo dimostrato che le larve di Aedes albopictus 1^st instar potrebbero essere facilmente ed efficacemente infettate introducendo il virus nel corpo idrico delle larve sito di allevamento e che il rAaeDVs sviluppati potrebbero essere utilizzati per overexpress o abbattere il espressione di un gene target specifico nelle larve, fornendo uno strumento per l'analisi funzionale di zanzara geni.

Introduzione

Zanzara di malattie come la malaria, la febbre dengue, febbre zika e febbre gialla, sono problemi di salute pubblica internazionale che continuano a rappresentare una frazione significativa della malattia infettiva globale onere^1,2. Insetticidi convenzionali, che sono stati utilizzati in risposta a vettori, sono una componente importante della strategia di controllo della zanzara integrato sostenibile per la prevenzione delle malattie trasmesse dalle zanzare. Tuttavia, tali strategie hanno dimostrato di essere relativamente inefficace o indesiderabili dovuto gli impatti ambientali negativi associati così come ....

Protocollo

tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato etico della Southern University Medical.

1. progettare un introne artificiale

Nota: introne artificiale utilizzato in questo lavoro è 65 bp in lunghezza e la sequenza è 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.

1. Posto Hpa ho restrizione del sito su entrambe le estremità dell'introne artificiale così quel Hpa ho digestione può rilasciare l'introne da plasmidi (Vedi Figura 1 A).
2. Posto i due Xba ho siti di restrizione nell'intro....

Risultati

Strategie per la costruzione di rAaeDV
Un vettore di rAaeDV difettoso è stato generato per esprimere il gene DsRed in larve di zanzara. Il plasmide risultante conteneva una videocassetta di proteina di fusione NS1-DsRed con la proteina VP eliminata (Figura 1A). rAaeDV plasmidi contenenti costrutti di espressione di miRNA, Mahdi, shRNA e spugna di miRNA sono stati progettati (mostrato in Figura 1

Discussione

È importante superare due dei principali ostacoli che limitano la costruzione rAaeDV. Il primo è la produzione di virus ricombinanti difettoso. È stato riferito che MDV può essere utilizzato come un vettore di esprimere in modo appropriato dimensioni geni estranei, come Scorpione insetto specifico neurotoxins20 e la proteina GFP; Tuttavia, indipendentemente dalla strategia di costruzione, una volta ORFs di MDV sono inseriti o sostituiti con geni esogeni, virioni non possono formarsi in modo indipendente a meno che un pla.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Centrifuga	Thermo Scientific	75004260
Centrifuga	Beckman Coulter	363118
Kit di estrazione su gel GeneJET	Thermo Scientific	K0691
Kit Midi plasmidico E.Z.N.A.	Omega Biotech	D6904
Agar	purificato OXOID	LP0028A
FastAP Fosfatasi alcalina termosensibile (1 U/µ L)	Thermo Scientific	EF0651
FastDigest HpaI	Thermo Scientific	FD1034
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684
T4 DNA ligasi (5 U/µ L)	Thermo Scientific	EL0011
TransStbl3 Cellula chimicamente competente	Beijing Transgen Biotech	CD521-01
Ampicillina	Beijing Tiangen Biotech	RT501
Proteinasi K	Promega	MC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	Beijing Tiangen Biotech	FP205