Articolo metodologico

Utilizzo di una zanzara ricombinante Densovirus come un vettore di consegna del Gene per l'analisi funzionale di geni in larve di zanzara

DOI:

10.3791/56121

⸱

6 ottobre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathogen Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University, 2Reproductive Medical Centre of Guangdong Women and Children's Hospital

In questo articolo

Sommario

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Segnaliamo che utilizzando un'artificiale intronic piccolo RNA espressione strategia per sviluppare un ricombinante non difettosi Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo sistema di consegna. È descritta una procedura dettagliata per la costruzione, imballaggio e analisi quantitativa dei vettori rAaeDV anche per quanto riguarda l'infezione larvale.

Abstract

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Microiniezione in vivo è la tecnica di trasferimento del gene più comunemente usati per analizzare la funzione genica nelle zanzare individuali. Tuttavia, questo metodo richiede una più tecnicamente impegnativa operazione e comporta procedure complicate, soprattutto quando viene utilizzato nelle larve a causa della loro piccola dimensione, cuticola relativamente sottile e fragile e alta mortalità, che limitano la sua applicazione. Al contrario, vettori virali per la consegna del gene sono stati sviluppati per superare barriere extracellulari ed intracellulari. Questi sistemi presentano i vantaggi di facile manipolazione, efficienza di trasduzione genica alta, manutenzione a lungo termine dell'espressione genica e la capacità di produrre gli effetti persistenti in vivo. Zanzara densoviruses (MDVs) sono specifici di zanzara, piccolo virus a DNA singolo filamento può trasportare efficacemente esteri acidi nucleici nelle cellule di zanzara; Tuttavia, la sostituzione o l'inserimento di geni estranei per creare virus ricombinante in genere comporta una perdita di capacità di imballaggio e/o replica, che è una barriera allo sviluppo di questi virus come vettori di consegna.

Qui, segnaliamo che usando una strategia artificiale intronic piccolo-RNA espressione per sviluppare un ricombinante non difettosi Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo sistema di consegna. Sono descritte le procedure dettagliate per la costruzione, imballaggio e analisi quantitativa dei vettori rAaeDV e per infezione larvale.

Questo studio dimostra, per la prima volta, la possibilità di sviluppare un non-difettosi ricombinante MDV micro RNA (miRNA) sistema di espressione e quindi fornire un potente strumento per l'analisi funzionale dei geni nella zanzara stabilendo una base per la applicazione di paratransgenesis virale per controllare le malattie trasmesse dalle zanzare. Abbiamo dimostrato che le larve di Aedes albopictus 1st instar potrebbero essere facilmente ed efficacemente infettate introducendo il virus nel corpo idrico delle larve sito di allevamento e che il rAaeDVs sviluppati potrebbero essere utilizzati per overexpress o abbattere il espressione di un gene target specifico nelle larve, fornendo uno strumento per l'analisi funzionale di zanzara geni.

Introduzione

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Zanzara di malattie come la malaria, la febbre dengue, febbre zika e febbre gialla, sono problemi di salute pubblica internazionale che continuano a rappresentare una frazione significativa della malattia infettiva globale onere1,2. Insetticidi convenzionali, che sono stati utilizzati in risposta a vettori, sono una componente importante della strategia di controllo della zanzara integrato sostenibile per la prevenzione delle malattie trasmesse dalle zanzare. Tuttavia, tali strategie hanno dimostrato di essere relativamente inefficace o indesiderabili dovuto gli impatti ambientali negativi associati così come l'evoluzione della resistenza nella zanzara popolazioni3,4. Per questi motivi, c'è un urgente bisogno di metodi alternativi di zanzara controllo e l'uso di metodi transgenici per produrre zanzare maschile sterile e il rilascio di zanzare patogeno-resistente sono sorti come promettenti nuove strategie di controllo. Per sviluppare un controllo efficace nuovi metodi, come approcci sicuri ed efficaci per genico in vivo , l'analisi completa di funzione del gene di zanzara è richiesto.

Microiniezione diretta del plasmide DNA, doppio incagliato RNA (dsRNA) o short interfering RNA (siRNA) è il più comunemente usato in vivo gene consegna metodo nelle zanzare. Infatti, la produzione di ceppi transgenici di zanzare ancora contare su un processo di embrione microiniezione5,6,7. Tuttavia, la microiniezione presenta diverse limitazioni. In primo luogo, questa tecnica è tecnicamente impegnativo e comporta procedure complicate. In secondo luogo, iniezione provoca un insulto fisico per l'embrione, larve, pupe e adulto, che colpisce direttamente la vitalità dell'organismo bersaglio. In terzo luogo, è difficile immobilizzare le larve di zanzara per il microinjection perché la maggior parte vivono in un habitat acquatico e possiedono una caratteristica guizzante di movimento. In quarto luogo, la dimensione di 1st-2nd instar larve è 10 - 20 volte più piccola di quella di 4th instar e larve di età superiore e le cuticole dell'ex sono più delicate. Queste caratteristiche lo rendono difficile da manipolare 1st-2nd instar larve rispetto a quelli nelle fasi precedenti. Combinati, questi fattori contribuiscono a un tasso di sopravvivenza riduttore post-iniezione per le larve (5% circa) rispetto a adulti8. Sistemi di consegna basati su virale sono stati sviluppati per superare le barriere extracellulari ed intracellulari associate. Questi sistemi presentano i vantaggi di facile manipolazione, efficienza di trasduzione alta, robusti e a lungo termine i livelli di espressione e la capacità di produrre gli effetti persistenti in vivo. Di conseguenza, gene consegna sistemi che utilizzano retrovirus, lentivirus e gli adenovirus sono stati ampiamente usato linee cellulari inmammalian e specie modello. Il sistema di espressione virale Sindbis era stato precedentemente utilizzato per analizzare la funzione genica nella zanzara adulta; oltre le preoccupazioni di sicurezza biologica, tuttavia, l'iniezione è ancora un processo necessario per infezione virale9. Anche se, la consegna orale impregnando le larve nella soluzione dsRNA è stata segnalata precedentemente come un metodo di consegna fattibile, è inadatto per piccoli RNA funzione analisi10. Così, metodi di consegna virale efficace ancora devono essere sviluppati per le zanzare.

Zanzara densoviruses (MDVs) fanno parte della sottofamiglia Densovirinae dei Parvoviridaee tutti, ma una caduta all'interno del genere Brevidensovirus11. I virions MDV sono senza involucro e sono costituiti da un singola elica (ssDNA) genoma e un capside icosaedrica (20 nm di diametro). Il genoma virale è di circa 4 kb e viene replicato all'interno dei nuclei delle cellule dell'ospite. MDVs sono relativamente stabili nell'ambiente e mostrare una gamma stretta host con alta specificità per le zanzare. Questi virus hanno il potenziale per diffondere e mantenere naturalmente nelle popolazioni di zanzare e possono invadere quasi tutti gli organi e tessuti di questi insetti, tra cui del midgut, tubuli malpighiani, corpo grasso, muscolatura, neuroni e ghiandole salivarie12.

Genomi MDV intatti possono subclonati in vettori plasmidici per produrre cloni infettivi basati su plasmide; Quando questi cloni sono trasportati nelle cellule della zanzara, il genoma virale viene estratta dal vettore plasmidico e particelle virali infettive sono prodotte. Perché MDV ha un genoma di piccole ssDNA, cloni infettivi sono facilmente costruiti e il genoma virale può essere facilmente manipolabile11,13. Queste caratteristiche rendono MDV un agente importante per l'esame di biologia della zanzara. Tuttavia, poiché quasi tutti della sequenza del genoma virale è essenziale per la proliferazione virale, la creazione di virus ricombinante attraverso la sostituzione o l'inserimento di geni estranei comporta una perdita nella capacità di imballaggio e/o replica virale, che crea un barriera per lo sviluppo di MDVs come vettori di consegna del gene. Qui, segnaliamo che usando una strategia artificiale intronic piccolo-RNA espressione per sviluppare un rAaeDV non difettosi in vivo RNA delivery system che ha i vantaggi della costruzione del plasmide facile e la manutenzione di un virus funzionale che può produrre stabile e a lungo termine l'espressione in cellule di host senza la necessità di virus wild-type. Inoltre, questo metodo consente la facile trasduzione delle larve.

In questo studio vengono descritti i protocolli per le fasi successive: linea 1) progetto di rAaeDVs codifica una cassetta di espressione di piccolo-RNA intronic, 2) produzione di particelle di virus ricombinante mediante la cella di imballaggio C6/36, 3) analisi quantitativa di cella-free rAaeDV genoma copiare numeri e 4) infezione delle larve di Ae. albopictus per introduzione diretta del virus nel corpo dell'acqua dell'habitat larvale. Nel complesso, questo lavoro ha dimostrato che piccole molecole di RNA specifici o geni bersaglio possono essere iperespresso o abbattuti in larve di zanzara utilizzando il sistema di consegna MDV sviluppato.

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Protocollo

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tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato etico della Southern University Medical.

1. progettare un introne artificiale

Nota: introne artificiale utilizzato in questo lavoro è 65 bp in lunghezza e la sequenza è 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.

  1. Posto Hpa ho restrizione del sito su entrambe le estremità dell'introne artificiale così quel Hpa ho digestione può rilasciare l'introne da plasmidi (Vedi Figura 1 A).
  2. Posto i due Xba ho siti di restrizione nell'introne così quel Xba ho digestione può essere utilizzata per inserire sequenze di piccoli RNA expression.
  3. Ordinare la sintesi chimica di sequenze di DNA integrali dell'introne artificiale da un produttore di DNA. Il sintetico è DNA creato da clonazione in un plasmide pUC19 standard.
    Nota: I componenti essenziali dell'introne artificiale includono diversi elementi di nucleotide di consenso, tra cui un 5 ' erogatore della giuntura (DS) con la sequenza GUAAGAGU, una sequenza conservata del punto di diramazione (BPS) con la sequenza UACUAAC, una poli-pirimidina tratto (PPT) con la sequenza UCUUC(U) 10 e 3 '-luogo della giuntura del ricettore (AS) con la sequenza GAUAUCCUGCAG ( Figura 1 A). Due Xba I siti di restrizione sono stati introdotti tra il DS e BPS che può essere utilizzato per inserire sequenze di piccoli RNA espressione. La capacità di giuntura in modo efficace questo introne artificiale dalle cellule di mammiferi e zanzara è stato precedentemente confermato 14.

2. Progettazione di un artificiale Intronic piccolo RNA cassetta di espressione

Nota: per la sovraespressione o atterramento di miRNA endogeno, sequenze codificanti precursore miRNA o una spugna di miRNA sono state inserite tra i DS e BPS. Per servire come un esempio, un precursore endogeno miRNA da Ae. albopictus aal-let-7 è stata selezionata per la costruzione di vettori virali ricombinanti per la sovraespressione di miRNA e atterramento. Una spugna anti-let-7 è stata progettata secondo i metodi descritti in precedenza 15. Per abbattere i geni bersaglio in larve, abbiamo progettato specifici miRNA artificiali (Mahdi) o sequenze di RNA (shRNA) breve tornante utilizzando software online 16 , 17; per servire come un esempio, subunità del V-ATPasi un mRNA (no di adesione. AY864912) è stata selezionata come un gene bersaglio in questo studio. Il Mahdi saranno considerati come amiVTP qui di seguito. Tutti i dettagli di sequenze di pre-miRNA, spugna, Mahdi e shRNA sono descritti nella tabella supplementare 1.

  1. Ordinare la sintesi chimica di sequenze di cDNA integrale del precursore Mirna, spugne di miRNA e shRNA con Xba I siti di restrizione su entrambe le estremità da un produttore di DNA.
  2. Dopo aver ricevuto il DNA ordinato, spin le provette contenenti blocchi di DNA a 10.000-14.000 x g per 1 min assicurare che tutti secchi di DNA è nella parte inferiore del tubo.
  3. Risospendere il DNA secco in acqua privo di DNasi per ottenere una concentrazione finale di 10 ng / µ l.
  4. Digerire la spina dorsale del plasmide e DNA sequenze con Xba io a 37 ° C per 1 h e quindi dephosphorylate il 5 ' le estremità della spina dorsale del plasmide linearizzato con fosfatasi alcalina vitello intestinale (CIAP) secondo il produttore ' protocollo s .
  5. Inattivare CIAP da riscaldamento per 60 min a 65 ° C.
  6. Eseguire un gel di agarosio 1.0% e tagliare la spina dorsale linearizzata. Quindi estrarre il DNA dal gel slice utilizzando un kit di estrazione del gel seguendo il produttore ' istruzioni s.
  7. Legano il frammento di DNA nella backboneby T4 DNA ligasi (5 U / µ l) a 22 ° C per 1 h.
  8. Trasformare i prodotti della reazione di legatura da cellule passo 2.7 in competente Escherichia coli (Escherichia coli) e la piastra su una piastra di agar Lisogenesi brodo (LB) contenente ampicillina (ad una concentrazione di 100 µ g/mL).
    1. Eseguire la trasformazione attraverso un calore shock metodo 18 e uso l' appropriato Escherichia coli ceppo. Ad esempio, utilizzare e. coli ceppo DH5α per trasformazione di scossa di calore.
  9. Pick una singola Colonia da passo 2.8 e procedere all'incubazione in una coltura di 3 mL arricchito Media contenente ampicillina (ad una concentrazione di 100 µ g/mL).
  10. Estrarre il DNA del plasmide da coltura batterica utilizzando un kit di mini-preparazione seguendo il produttore ' s istruzioni. Inviare il campione ad una società di sequenziamento del DNA.
    Nota: Per la sovraespressione o atterramento di miRNA endogeno, sequenze codificanti precursore miRNA o una spugna di miRNA sono state inserite tra i due Xba siti. Tutti i costrutti di spugna o di espressione di miRNA devono essere inferiori a 400 bp (10% della lunghezza del genoma virale) a causa del limite di imballaggio del virus 19.

3. Generando un rAeaDV costrutto clonando un miRNA o shRNA cassetta di espressione in una dorsale di plasmide

Nota: pUCA, un clone infettivo costituito da un plasmide di pUCA contenente il genoma di AaeDV (3.981 nt) 19, è stato gentilmente fornito da Prof Jonathan Carlson e precedentemente è stato descritto in dettaglio 11. p7NS1-DsRed esprime una proteina non-strutturale 1 (NS1)-proteina di fusione della proteina fluorescente rossa (DsRed) dal promotore p7 ed è stato descritto dettagliatamente altrove 14. Un precursore di miR-941-1 umano specifico 20 e la spugna, un shRNA strapazzata (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), erano anche subclonati in AaeDV come controllo negativo.

  1. Lega i pre-miRNA, spugna, shRNA o una cassetta di espressione amiVTP in Hpa I sito della regione AaeDV NS1-codificazione nella spina dorsale plasmide pUCA come descritto nel protocollo passaggio 2.4-2.7.
  2. Trasformare il DNA in Stbl3 competente Escherichia coli cellule e selezionare un clone positivo come descritto nel passaggio 2.8 a 2.10.
  3. a seguito di questo, estrarre il plasmide rAaeDV da cellule batteriche utilizzando un maxi kit preparazione seguendo il produttore ' istruzioni s.
    Nota: Stbl3 o Stbl4 Escherichia coli cellule dovrebbero essere utilizzate per la trasformazione del DNA rAaeDV minimizzare la ricombinazione di ITR indesiderati. Un maxi prep deve essere utilizzato per estrarre il plasmide rAaeDV per ottenere una grande quantità di DNA (> 100 µ g). Prima di generare il virus, l'integrità di sequenza del plasmide rAaeDV sempre dovrebbe essere analizzata da DNA sequencing 21.

4. Trasfettando cellule C6/36 con plasmidi rAaeDV

  1. cultura C6/36 celle in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mezzo contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina in un'incubatrice di 28 ° C.
  2. Il giorno 0, piastra le cellule in dieci matracci di cultura 2 25 cm h 18-20 prima di transfezione suddividendo il 90-95% di cellule confluenti in una diluizione di 1:2.
    Nota: Dal 1 ° giorno, le cellule dovrebbero raggiungere confluenza di 90-95%.
  3. Il giorno 1, transfect le cellule con la serie di rAaeDV plasmidi 22.
    1. Diluire 10 µ g di DNA in 600 µ l di terreno di RPMI-1640 in una microcentrifuga e mescolare delicatamente. Nel frattempo, preparare 600 µ l di terreno di RPMI-1640 e 25 µ l di reagente di transfezione per trasfezione.
    2. Incubare per 5-10 min a temperatura ambiente (TA). Quindi, aggiungere 625 µ l della miscela reagente di transfezione 1640 per la miscela di DNA del plasmide 1640.
    3. Incubare questa miscela per 20-30 minuti a TA. Prima di transfezione, lavare le cellule due volte con 2 mL di terreno RPMI-1640.
    4. Incubazione dopo RT (punto 4.3.3), aggiungere the1640-transfezione reagente DNA plasmidico composto nel matraccio di cultura 25 cm 2 e incubare per 6 ore a 28 ° C.
    5. a circa post-transfezione 6h, rimuovere i media di transfezione, lavare le cellule due volte con 5 mL di terreno RPMI-1640 e quindi aggiungere medium RPMI-1640 con 10% FBS.
      Nota: rAaeDV Mostra alti tassi di infezione (95%) in larve di Ae. albopictus; tuttavia, nella nostra esperienza, in quasi il 50% delle larve infettate, l'infezione è stata limitata ai siti di infezione primaria (ad es., papille anali e setola cellule) senza diffusione 23. Pertanto, se c'è un bisogno di infettare larve in tessuti multipli, un virus ricombinante difettoso espressione della proteina fluorescente dovrebbe essere co-infettato per abilitare la visualizzazione dei siti di infezione. Ad esempio, per produrre difettoso virus ricombinanti che esprimono DsRed, p7NS1-DsRed dovrebbe essere co-trasfettate con un plasmide helper nelle cellule C6/36 secondo la procedura sopra descritta (il rapporto di concentrazione di cotransfection deve essere 2:1).

5. Raccolta rAaeDV Virions da Transfected le cellule C6/36

  1. raccolto le cellule 5 giorni dopo la trasfezione. Sloggiare e sospendere le cellule nei piatti da un contagocce di vetro 5ml, pipettaggio su e giù con il terreno di coltura. Trasferire tutte le sospensioni di cellule sterili 15 mL provette.
  2. Congelare a-80 ° C o in un bagno di ghiaccio secco/etanolo per 30 min e poi scongelare a 37 ° C. Vortex per 1 min. Ripetere la procedura di congelamento e scongelamento 3 volte.
  3. Centrifugare il campione a 4.800 x g per 20 min a 4 °C.Collect il surnatante e scartare il pellet. Quindi, passare il surnatante attraverso un filtro di siringa monouso 0,22 µm. Aliquotare e conservare il virione purificata finale scorte a -80 ° C.
    Nota: Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.

6. Quantificare la rAaeDV

  1. preparare il DNA standard. Linearizzare tutte le rAaeDV plasmidi con Hpa e purificare i prodotti digeriti con un gel di estrazione kit 24.
  2. Costruire la curva standard quantitativa assoluta e misurare il titolo del virus secondo metodi precedentemente descritti 25.

7. Zanzara trasduzione

  1. larve di Wash 100 1 st instar Ae. albopictus tre volte utilizzando deionizzata acqua e quindi, trasferire le larve in un becher contenente 95 mL di acqua deionizzata. Aggiungere 5 mL di stock rAaeDV (concentrazione finale di 1,00 x 10 10 copie/mL).
  2. Incubare per 24 ore a 28 ° C, lavare le larve tre volte utilizzando acqua deionizzata e poi trasferire le larve le piastre e nutrire regolarmente.
  3. Monitorare il livello di espressione genica nelle larve con qPCR o Western blot (rappresentante risultati sono riportati nelle figure 3 e 4).
    Nota: Il metodo di rilevazione del segnale di fluorescenza può essere utilizzato per isolare le larve infettate più precisamente. Ad esempio, per rilevare segnali fluorescenti da larve infettati con virus ricombinante esprimendo DsRed, le larve inserite in una diapositiva di concavità e osservate con un microscopio a fluorescenza invertito ogni 8 h fino a 2 giorni post-infezione. Una volta fluorescente larve vengono rilevate, essi devono essere separati nelle tazze di plastica singolo test per consentire successivi osservazione continua. Le larve con tessuti multipli infettati possono essere identificate utilizzando questo metodo.

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Risultati

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Strategie per la costruzione di rAaeDV
Un vettore di rAaeDV difettoso è stato generato per esprimere il gene DsRed in larve di zanzara. Il plasmide risultante conteneva una videocassetta di proteina di fusione NS1-DsRed con la proteina VP eliminata (Figura 1A). rAaeDV plasmidi contenenti costrutti di espressione di miRNA, Mahdi, shRNA e spugna di miRNA sono stati progettati (mostrato in Figura 1

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Discussione

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È importante superare due dei principali ostacoli che limitano la costruzione rAaeDV. Il primo è la produzione di virus ricombinanti difettoso. È stato riferito che MDV può essere utilizzato come un vettore di esprimere in modo appropriato dimensioni geni estranei, come Scorpione insetto specifico neurotoxins20 e la proteina GFP; Tuttavia, indipendentemente dalla strategia di costruzione, una volta ORFs di MDV sono inseriti o sostituiti con geni esogeni, virioni non possono formarsi in modo indipendente a meno che un pla...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono sostegno finanziario nazionale chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (2016YFC1200500 a Chen Xiao Guang), National Foundation Natural Science of China (81672054 e 81371846), il programma di Team di ricerca del naturale La ricerca scientifica di Guangdong (2014A030312016) e il programma scientifico e tecnologico di Guangzhou (201508020263). Noi riconosciamo con gratitudine il Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) per gentilmente fornire i plasmidi pUCA e p7NS1-GFP e per la lettura critica di questo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CentrifugaThermo Scientific75004260
CentrifugaBeckman Coulter363118
Kit di estrazione su gel GeneJETThermo ScientificK0691
Kit Midi plasmidico E.Z.N.A.Omega BiotechD6904
Agarpurificato OXOIDLP0028A
FastAP Fosfatasi alcalina termosensibile (1 U/µ L)Thermo ScientificEF0651
FastDigest HpaIThermo ScientificFD1034
FastDigest XbaIThermo ScientificFD0684
T4 DNA ligasi (5 U/µ L)Thermo ScientificEL0011
TransStbl3 Cellula chimicamente competenteBeijing Transgen BiotechCD521-01
Ampicillina Beijing Tiangen BiotechRT501
Proteinasi KPromegaMC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)Beijing Tiangen BiotechFP205
System

Riferimenti

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