Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia

Le zanzare Aedes aegypti sono responsabili della trasmissione di alcune dell'arbovirus più importanti del mondo, tra cui la dengue, Zika e chikungunya¹. Questi virus stanno diventando una crescente minaccia per la salute globale, come la distribuzione capillare di Ae. aegypti nei tropici continua ad espandersi^2,3,4. Femmina Ae. aegypti preferenzialmente si nutrono di sangue umano⁵ e quindi tendono a vivere in prossimità di esseri umani, soprattutto nelle aree urbane, dove le popolazioni sono più densi. Attraverso questa stretta associazione con gli esseri umani si sono adattati anche per allevare in habitat artificiali, compresi i pneumatici, vasi, grondaie e serbatoi acqua^6,7. AE. aegypti anche facilmente adattarsi ad ambienti di laboratorio dove può essere mantenute senza requisiti speciali dopo essere raccolte direttamente dal campo, a differenza di alcune altre specie nel genere Aedes ^{8, 9,10}. La facilità di manutenzione ha visto loro ampiamente studiato in laboratorio in una vasta gamma di campi, in ultima analisi, con l'obiettivo di controllare le malattie zanzare può trasmettere.

Tradizionalmente, controllo arbovirus dipende fortemente l'uso di insetticidi per ridurre le popolazioni di zanzare. Tuttavia, vi è crescente interesse approcci dove le zanzare modificate sono allevate in laboratorio e poi rimesso in popolazioni naturali. Rilasciate le zanzare possono essere modificate geneticamente^11,12,13, biologicamente^14,15, attraverso irradiazione¹⁶, trattamento chimico^17,18, o con combinato tecniche¹⁹ per sopprimere le popolazioni di zanzare o sostituirli con le zanzare che sono refrattari a arbovirus trasmissione²⁰.

Wolbachia sono batteri che vengono attualmente utilizzati come agente di controllo biologico per gli arbovirus. Diversi ceppi di Wolbachia recentemente sono stati introdotti in Ae. aegypti sperimentalmente mediante microiniezione embrionali^21,22,23,24. Questi ceppi riducono la capacità dell'arbovirus di diffondere e replicare nella zanzara, diminuendo la loro trasmissione potenziale^{23,25,26,27,28} . Wolbachia infezioni vengono trasmessi dalla madre alla prole, tuttavia alcuni ceppi inducono sterilità quando infetti maschi si accoppiano con le femmine non infetti²². Wolbachia-maschi infetti pertanto possono essere rilasciati in grandi quantità per sopprimere popolazioni di zanzara naturale, come recentemente dimostrati in altri^15,specie di Aedes ²⁹. Tuttavia, poiché Wolbachia inoltre inibiscono la trasmissione arbovirus in Ae. aegypti, zanzare possono essere rilasciate anche per sostituire le popolazioni native con vettori più poveri. Ae. aegypti infettati sperimentalmente con Wolbachia ora vengono rilasciate nel campo in diversi paesi che utilizzano questo approccio posteriore^14,30,31.

Wolbachia-approcci di basati per controllo arbovirus si basano su una solida comprensione delle interazioni tra Wolbachia, la zanzara e l'ambiente. Wolbachia si presentano naturalmente in una vasta gamma di insetti, e le deformazioni introdotte le zanzare sono diverse nei loro effetti³². Come vengono introdotti nuovi tipi di infezione di Wolbachia in Ae. aegypti²⁴, è necessario caratterizzare ogni ceppo per i loro effetti sulla zanzara fitness, riproduzione e arbovirus interferenza in una gamma di condizioni. Rigorosa sperimentazione in laboratorio è pertanto necessaria per valutare il potenziale per i ceppi di Wolbachia avere successo nel campo.

Uscite di campo aperto di Ae. aegypti con Wolbachia infezioni possono spesso richiedono migliaia o decine di migliaia di zanzare per zona di rilascio per essere allevato ogni settimana^14,30,31. Il successo delle versioni iniziali può essere migliorato attraverso il rilascio di zanzare di grandi dimensioni per massimizzare la loro fecondità³³ e accoppiamento successo^34,35. Le zanzare dovrebbero anche essere adattate alle condizioni che essi sperimenteranno nel campo, tuttavia a lungo termine laboratorio allevamento può causare cambiamenti nel comportamento e fisiologia che poteva avere un impatto campo prestazioni^{36,37, 38}.

Descriviamo un semplice protocollo per l'allevamento di Ae. aegypti in laboratorio con attrezzature di base. Questo protocollo è adatto per entrambi selvaggio-tipo e Wolbachia-infettato le zanzare, il posteriore di quale può richiedere particolare attenzione come alcuni ceppi di Wolbachia hanno effetti sostanziali sulla zanzara vita-storia tratti^{39, 40}. le condizioni di allevamento evitare sovraffollamento e competizione per il cibo per produrre le zanzare di una dimensione coerente, che è critica per competenza vettoriale ed esperimenti di fitness e garantisce che le zanzare sono sane per il rilascio di campo⁴¹ . Inoltre prendiamo precauzioni per minimizzare laboratorio adattamento e consanguineità riducendo le pressioni selettive e garantire che la prossima generazione è campionata da una grande piscina casuale. Tuttavia, ambienti di laboratorio sono distintamente differenti da condizioni di campo e manutenzione a lungo termine in condizioni rilassate potrebbe ridurre l'idoneità delle zanzare al momento del rilascio in campo^37,42,43 . Attraversiamo quindi le femmine da linee di laboratorio ai maschi di campo-raccolti periodicamente, conseguente colonie che sono geneticamente simili per confronti sperimentali e che sono adattati per la destinazione campo popolazione³⁹. I metodi non richiede attrezzature specializzate e possono essere scalati a posteriore decine di migliaia di individui a settimana per i rilasci di campo. Il protocollo inoltre assegna una priorità l'idoneità delle zanzare all'interno e attraverso le generazioni, una considerazione importante per insetti destinati per l'istituzione nelle popolazioni naturali. Il protocollo è adatto per la maggior parte dei laboratori che richiedono manutenzione di Ae. aegypti, particolarmente per i confronti sperimentali dove una qualità costante di zanzare e relatability al campo sono importanti.

Alimentazione di sangue di zanzare su soggetti umani è stato approvato dall'Università di Melbourne Comitato etica umana (approvazione n.: 0723847). Tutti i volontari forniti informato consenso scritto.

1. larvale allevamento

Nota: Le zanzare sono tenute presso 26 ± 0,5 ° C e 50-70% di umidità relativa, con un fotoperiodo di 12:12 h (luce: scuro) per questo protocollo di manutenzione di Colonia. Queste condizioni sono simili alle condizioni climatiche media a Cairns, Australia e all'interno della gamma termica ottima per Ae. aegypti sopravvivenza e sviluppo^44,45,46. Temperature elevate possono causare la perdita di Wolbachia infezioni da colonie di zanzare e dovrebbero essere evitato⁴⁷. Manteniamo almeno 500 persone per popolazione per minimizzare la consanguineità; mantenimento di colonie di dimensioni inferiori può avere conseguenze di fitness [Ross et al. inedito]. Sotto queste condizioni e supponendo che una nutrizione adeguata, il tempo di generazione medio è di 28 giorni (Vedi tabella 1).

1. Immergere le uova sul substrato in vassoi (Figura 1A) contenente 3 L di acqua (acqua di osmosi inversa o acqua di rubinetto invecchiata, generato lasciando l'acqua del rubinetto in vassoi per 24 h prima dell'uso), ~ 300 mg di cibo per pesci (uno schiacciato tablet, Vedi Materiali tavolo) e un alcuni grani di lievito secco attivo per indurre la schiusa⁴⁸.
2. Un giorno dopo la schiusa, usare una pipetta di vetro per trasferire circa 500 larve ai vassoi contenenti 4 L di acqua (Figura 1B), conteggio utilizzando un contatore di clicker. Aggiungere due compresse di cibo di pesce schiacciato ogni vassoio. Se necessario, utilizzare contenitori di diverse dimensioni per l'allevamento di larve (Figura 1A), ma tieni larvale densità inferiori a 0,5 larve/mL per evitare sovraffollamento.
3. Verifica i vassoi di ogni giorno per assicurare che le larve hanno cibo a sufficienza; aggiungere circa due compresse di cibo ai vassoi ogni due giorni. Fornire cibo ad libitum , ma garantire che 0,5 mg/larva/giorno è disponibile durante questo periodo per garantire sviluppo è sincrono e dimensione corporea è coerente, altrimenti possono essere confusi i risultati degli esperimenti (Vedi risultati rappresentante).
4. Fare attenzione a evitare la sovralimentazione delle larve, particolarmente in contenitori più piccoli allevamento con acqua meno volume e superficie. Se l'acqua sembra nuvoloso o se non esiste una significativa mortalità larvale, sostituirlo con acqua fresca; mortalità deve essere trascurabile se le larve sono alimentate in modo ottimale.

2. adulti emersione

Nota: Le larve cominceranno a pupate da cinque giorni dopo la schiusa, se ben nutriti e la maggior parte dovrebbe pupate di sette giorni dopo la schiusa. Gli adulti inizierà emergenti circa due giorni dopo l'impupamento, se mantenuta in modo ottimale a 26 ° C (Vedi Risultati rappresentante). Lo sviluppo larvale è tipicamente influenzato da Wolbachia infezioni quando un ampio è previsto il^23,39,49.

1. Sette giorni dopo la schiusa versare l'intero contenuto del vassoio attraverso una maglia fine (poro formato 0,4 mm). Mantenere l'acqua filtrata larvale per un uso successivo in ovicups (Vedi sezione "Sangue alimentazione e deposizione delle uova"). Invertire la mesh e immergerlo in un recipiente di plastica con 200 mL di acqua per trasferire le pupe. Fornire cibo supplementare se qualsiasi larve rimangono.
2. Preparare le gabbie di emersione adulto (Figura 1) fornendo due tazze di soluzione di saccarosio al 10% (Figura 1F) e due Coppe di ovatta umida per evitare il disseccamento (Figura 1E).
3. Se non è necessario che le pupe essere filtrate per sesso, mettere i contenitori con coperchio di pupe nella gabbia e lasciare il coperchio leggermente aperta per permettere gli adulti ad emergere nella gabbia. In alternativa, posizionare un imbuto rovesciato sopra il contenitore per ridurre al minimo l'annegamento. Assicurarsi che tutti gli adulti sono emerse prima di rimuovere il contenitore dalla gabbia per impedire la selezione contro gli sviluppatori lenti.

3. pupal sessaggio per esogamici

1. Se le pupe devono essere ordinati dal sesso (ad es., per esogamici), pipettare le pupe da vassoi larvale e separare i due sessi (Figura 2) in contenitori di plastica (Figura 1A) con 200 mL di acqua ogni 24 ore fino al numero desiderato di ciascun sesso è stato raggiunto. Mettere i coperchi sui contenitori e lasciarli chiusi.
2. Gli adulti emergerà nei contenitori; confermare loro sesso prima di rilasciare in gabbie (Figura 2). Rimuovere eventuali adulti sessuati in modo non corretto con un aspiratore entro 24 h dalla emersione prima che raggiungano la maturità sessuale. Una volta che i sessi sono stati confermati, rilasciare gli adulti in gabbie ogni 24 ore.
3. Per ottenere Wolbachia-colonie infettate di un simile background genetico di una popolazione naturale, outcross aggiungendo Wolbachia-infettati femmine da colonie di laboratorio nelle gabbie dei maschi non infetti derivati da uova raccolte da ovitrap in il campo³⁹, mantenendo la densità prescritta di 500 persone per popolazione.
   1. Ripetere l'esogamici per almeno tre generazioni successive per la produzione di colonie che sono almeno 87,5% simili geneticamente per la popolazione di campo³⁹. Critico: Assicurarsi che i sessi siano corretti in questa fase (Vedi punto 3.1).
4. Femmina Ae. aegypti sono solitamente refrattari all'ulteriore inseminazione entro ore di accoppiamento⁵⁰. Quando esogamici colonie, consentire le femmine e i maschi a maturare in gabbie separate per due giorni e quindi aspirare le femmine nella gabbia maschio di fornire pari opportunità a tutti i maschi.

4. sangue alimentazione e deposizione delle uova

1. Attendere almeno tre giorni dopo l'ultima femmina è emerso prima sangue alimentazione per consentire un ampio tempo per maturare. Sangue di nutrire le femmine entro due settimane dalla nascita per prevenire la mortalità eccessiva, in particolare per le zanzare con le infezioni di Wolbachia che influenzare negativamente la longevità^22,24,49. Togliere le tazze di zucchero il giorno prima della poppata per migliorare i tassi di alimentazione.
   1. Chiedere ad un volontario per inserire loro avambraccio nella gabbia per consentire le zanzare femmina da sfamare. La maggior parte delle femmine dovrebbero nutrire di replezione entro 5 min, ma per ridurre la selezione contro lenti mangiatoie, lasciare l'avambraccio nella gabbia per 15 minuti, o fino a quando tutte le femmine sono visibilmente gonfie; un guanto di lattice per proteggere la mano da morsi è facoltativo ma consigliato.
   2. Due giorni dopo il pasto di sangue, posizionare due tazze di plastica contenente acqua di allevamento larvale e foderato con una striscia di carta vetrata (Figura 1) (o carta da filtro (Figura 1 H)) nella gabbia per le femmine per deporre le uova. Parzialmente e immergere la striscia di carta vetrata in acqua per mantenerla umida. Rimuovere altre fonti di acqua per impedire che le femmine depongono le uova fuori la Coppa di deposizione delle uova.
      Nota: l'acqua del rubinetto può essere utilizzato nelle coppe, ma acqua di allevamento larvale incoraggia la deposizione delle uova^51,52 e femmine deporranno le uova più in modo sincrono.

5. uovo raccolta e condizionamento

1. Le femmine deporranno le uova sulla carta vetrata appena sopra la linea di galleggiamento; raccogliere e sostituire le strisce di carta vetrata al giorno fino a quando non più uova. Nota che tale deposizione delle uova può continuare fino a una settimana.
2. Strisce di carta vetrata parzialmente asciugare tamponando delicatamente su un tovagliolo di carta per 30 s, facendo attenzione a non per staccare le uova. Avvolgere le strisce in un foglio di scottex asciutto, quindi metterlo in un sacchetto di plastica sigillabile (Figura 1I).
3. Verificare lo stato delle uova sotto un microscopio per dissezione (Figura 3). Se la carta vetrata le strisce sono troppo bagnati, uova possono nascere prima di essere immerso in acqua (Figura 3B), ma se secchi troppo duramente, uova possono sprofondare (Figura 3).
4. Le uova possono essere covate in qualsiasi momento di là di post-raccolta tre giorni; si schiudono tutte le uova da ogni Colonia, raccolte attraverso tutti i giorni, nello stesso contenitore di acqua per assicurare che la prossima generazione è campionata da una grande piscina casuale degli individui.
5. Per l'archiviazione a lungo termine, mantenere le uova in un contenitore sigillato con un'umidità elevata (> 80%) a circa 20 ° C. In queste condizioni, le uova senza Wolbachia possono essere conservate per diversi mesi mantenendo alta tratteggio tariffe^53,54.
6. Come alcune infezioni di Wolbachia riducono notevolmente la redditività delle uova con età^49,55, si schiudono le uova da Wolbachia-infettato linee entro una settimana dalla raccolta per evitare la mortalità eccessiva per il pertinente ceppi. Sangue nutrire le femmine nuovamente dopo una settimana se sono necessari più uova.

Tabella 1: Panoramica del programma di controllo Ae. aegypti Colonia a 26 ° C. I tempi di sangue-alimentazione femmina e la schiusa delle uova è flessibili, ma lunghe durate in queste fasi dovrebbero essere evitate, in particolare per le zanzare infettate con Wolbachia, al fine di ridurre al minimo la mortalità. Seguendo questo programma riduce al minimo la selezione contro le zanzare che sono veloce o lento per sviluppare o maturo in tutte le fasi di vita, a condizione che le larve sono alimentate in modo ottimale.

Figura 1: Attrezzature utilizzate per l'allevamento di Ae. aegypti in laboratorio. Contenitori di plastica (A) utilizzati per uova da cova o di allevamento di larve con volumi di 500, 750 e 5.000 mL (da sinistra a destra). (B) vassoi utilizzati per l'allevamento di larve ad una densità controllata, solitamente 500 larve in 4 L di acqua. (C) (D), 3L gabbie utilizzate per adulti di alloggiamento e 19,7 L. Una densità di 25 adulti o meno al litro dovrebbe essere mantenuto per fornire spazio sufficiente. Coppa di 35 mL (E) con ovatta umida fornita come una fonte di acqua per gli adulti. (F) tazza da 35 mL con soluzione di saccarosio fornita attraverso un cavo o stoppino dentale come una fonte di zucchero. (G–H) Tazze riempite con acqua di allevamento larvale e fiancheggiata da un substrato di deposizione delle uova di carta vetrata o carta da filtro (G e H, rispettivamente). (io) chiusura lampo sacchetto usato per la conservazione di strisce di carta vetrata o carta da filtro. Macchie nere sulla carta vetrata sono uova di zanzara. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Laterale (A) e dorsale (B) viste di pupe e adulti Ae. aegypti (C) dimostrando il dimorfismo sessuale. I maschi sono posizionati a sinistra e le femmine a destra in ogni pannello. Quando alimentato in modo ottimale, pupe maschi e femminile si distinguono per dimensioni; le femmine sono più grandi dei maschi (A) ed hanno un cefalotorace relativamente bulboso rispetto ai maschi che hanno i lati più piatto (B). Maschi adulti sono facilmente distinguibili dalle femmine in tutte le condizioni di allevamento, principalmente di loro antenne piumosa e palpi lunghi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella figura 3. Quattro giorno vecchio Ae. aegypti uova in condizioni diverse. (A) intatto uova su strisce di carta vetrata mantenuti ad un'umidità elevata (> 80%) ma senza alcun'umidità visibile. Tassi del portello devono essere superiore al 90% per il selvaggio-tipo Ae. aegypti se mantenuta correttamente. (B) le uova che si schiudono prima di essere immerso in acqua (schiusa precoce) si distinguono per un cappuccio staccato uovo e larva visibile. Questo indica che la striscia di carta vetrata è stata mantenuta troppo umida. (C) le uova che sono asciugate troppo duramente potrebbero collassare e sono chiaramente visibili dalla loro apparenza concava. Se la carta vetrata si irrigidisce ciò indica anche che le uova possono essere troppo asciutte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 illustra gli effetti della nutrizione suboptimale sullo sviluppo delle larve di Ae. aegypti . Quando sono disponibili contenitori con 0,25 mg di cibo al larva al giorno o meno, aumenta il tempo di sviluppo per sia i maschi che le femmine, ed è meno sincrona rispetto in contenitori fornita con 0,5 mg di cibo. Se un'alimentazione adeguata non viene fornita per tutta la durata dello sviluppo larvale, questo potrebbe avere un impatto negativo sul programma di manutenzione. Lento-lo sviluppo di individui sono a rischio di essere selezionati contro, sangue alimentazione può essere ritardata, e c'è un elevato rischio di mortalità adulti prima riproduzione si verifica.

La figura 5 Mostra la lunghezza dell'ala (una stima delle dimensioni del corpo) di Ae. aegypti adulti allevati sotto una varietà di regimi alimentari. Lunghezza ala sia maschi che femmine diminuisce sostanzialmente e diventata più variabile quando la nutrizione è suboptimale. Dimensioni del corpo uniforme sono importanti per i confronti sperimentali come dimensione del corpo è associato positivamente con fecondità, e grandi zanzare sono tenute ad esporre una maggiore fitness sotto campo condizioni33,34,35 .

Gli effetti delle infezioni di Wolbachia i tratti di cui sopra sono descritti in altri studi, ma in genere c'è poco o nessun effetto23,39,49.

Figura 4: Percentuale cumulativa di Ae.aegypti (A) le femmine e i maschi (B) sviluppo all'età adulta sotto diversi regimi alimentari a 26 ° C. 100 larve sono state allevate in contenitori da 500 mL di acqua (una densità larvale di 0,2 larve per mL), forniti con diversi livelli di cibo (vedere tabella materiali) e segnato per il loro tempo di sviluppo. Solo le larve che sono sopravvissuti fino all'età adulta sono stati incluse. Barre di errore sono errori standard, con n = 4 ripetizioni per ogni trattamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Lunghezza dell'ala di Ae.aegypti (A) le femmine e i maschi (B) sviluppare sotto diversi regimi alimentari a 26 ° C. 100 larve erano allevate in contenitori da 500 mL di acqua (una densità larvale di 0,2 larve / mL) e fornite con diversi livelli di cibo. Un sottoinsieme degli adulti è stato misurato quindi per la loro lunghezza ala utilizzando metodi precedentemente descritti56. Barre di errore sono deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.