Qui, descriviamo un metodo che unisce in situ MHC-tetramero colorazione immunoistochimica per determinare la localizzazione, fenotipo e la quantità di cellule T antigene-specifiche nei tessuti. Questo protocollo viene utilizzato per determinare le caratteristiche spaziali e fenotipiche delle cellule CD8 T antigene-specifiche rispetto a strutture in tessuti e altro tipo di cellula.
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Articolo metodologico
In Situ MHC-tetramero macchiatura e analisi quantitativa per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T antigene-specifiche CD8 nei tessuti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule T sono fondamentali per molti processi immunologici, compreso rilevazione ed eliminando le cellule infettate da virus, impedendo l'autoimmunità, assistendo nella produzione delle cellule di B e delle cellule di plasma di anticorpi e rilevare ed eliminare le cellule tumorali. Lo sviluppo di MHC-tetramero macchiatura delle cellule T antigene-specifiche analizzate tramite flusso cytometry ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare e comprendere l'immunobiologia delle cellule T. Mentre estremamente utile per determinare la quantità e il fenotipo delle cellule T antigene-specifiche, citometria a flusso non può determinare la localizzazione spaziale delle cellule T antigene-specifiche ad altre cellule e strutture nei tessuti e le attuali tecniche di disaggregazione per estrarre le T cellule necessarie per citometria a flusso hanno un'efficacia limitata in tessuti non linfoidi. In situ MHC-tetramero macchiatura (IST) è una tecnica per visualizzare le cellule T che sono specifiche per gli antigeni di interesse nei tessuti. In combinazione con immunohistochemistry (IHC), IST può determinare l'abbondanza, la posizione e il fenotipo delle cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche nei tessuti. Qui, descriviamo un protocollo per macchiare ed enumerare le cellule CD8 T antigene-specifiche, con specifici fenotipi che si trova all'interno di compartimenti tissutali specifici. Queste procedure sono le stesse che abbiamo usato nella nostra recente pubblicazione da Li et al., intitolato "cellule producenti su Virus dell'immunodeficienza delle scimmie in follicoli sono parzialmente soppresso da CD8+ cellule In Vivo." I metodi descritti sono ampiamente applicabili perché può essere utilizzati per localizzare, fenotipo e quantificare essenzialmente qualsiasi cella di CD8 T antigene-specifiche per cui i tetrameri MHC sono disponibili, in tutto il tessuto.
Introduzione
Le cellule T sono fondamentali per molti processi immunologici, compreso rilevazione ed eliminando le cellule infettate da virus, impedendo l'autoimmunità, assistendo nella produzione delle cellule di B e delle cellule di plasma di anticorpi e rilevare ed eliminare le cellule tumorali. Lo sviluppo del peptide/MHC di classe I tetramero macchiatura di antigene-specifiche le cellule CD8 T1 e il più recente sviluppo di MHC classe II tetramero macchiatura delle cellule di T CD42 tramite flusso cytometry ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare e comprendere la immunobiologia delle cellule T. Mentre estremamente utile p....
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Protocollo
1. giorno 1: taglio di tessuto fresco e incubazione primaria
- uso un bisturi per tagliare il tessuto fresco in pezzi piccoli (circa 0,5 cm di larghezza di 0,5 cm di altezza). Separatamente ogni tessuto per un pistone per colla e incorporarli con 3-5 mL dell'agarosi di basso-fusione di 4% in PBS. Etichettare il pistone con le informazioni di tessuto usando un adesivo. Metterlo in un supporto refrigerato in un secchio di ghiaccio per solidificare.
- Accendere il microtomo e impostare lo spessore delle sezioni a 200 µm. installa una lama di rasoio sulle microtomo e inserire lo stantuffo montato con il tessuto nel bagno microtomo.
- Preparare il ....
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Risultati
Figura 1 Mostra come raccogliere immagini confocal utilizzando un microscopio confocale. Nella figura 2 viene illustrata l'analisi quantitativa immagine usando ImageJ. Figure 3 e 4 indicano rappresentante immagini dei tessuti di linfonodo da un SIV infettati macaco rhesus macchiato con tetrameri MHC, CD8 anticorpi e anticorpi CD20 e servono a dimostrare la specificità della MHC-tetramero colorazi.......
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Discussione
IST combinato con IHC fornisce uno strumento essenziale per rilevare, caratterizzare e quantificare le cellule CD8 T antigene-specifiche in ambienti nativi con il contesto di altre cellule e strutture del tessuto. Qui, abbiamo descritto le procedure dettagliate per IST combinato con IHC, seguita da analisi dell'immagine quantitativa, per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T CD8 antigene-specifiche nei linfonodi da macachi rhesus. Macchiatura simile può essere applicata all'essere umano, del mous.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal servizio di sanità pubblica concede dal National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MHC-I monomero | NIH tetramero core facility | Materiali per la preparazione del tetramero MHC | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materiali per la preparazione del tetramero MHC |
| Siero di capra normale | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Agarosio a basso punto di fusione | Promega | V3121 | |
| Eparina | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Gelatina glicerica | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propil gallato | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Anticorpo instabile, utilizzare aliquote |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vettore | 6022201 | |
| capra-a-m-A488 (1:2.000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5.000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5.000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5.000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| Piastre per coltura tissutale a fondo piatto a 24 pozzetti | Falcon | 353226 | |
| Vetrino per microscopio | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Lama di rasoio | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather bisturi usa e getta | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | N. 21 | |
| Pennello rotondo #2 | PRINCETON ART & SPAZZOLA CO. | 4350R | Può tagliare secondo necessità con il rasoio |
| Microscopio confocale | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Riferimenti
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells p....
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Ristampe e permessi
