Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Sommario

Analisi del contenuto intestinale più comune di macroinvertebrati sono visive. Che richiedono intensa conoscenza diversità morfologica degli organismi di preda, essi perdere morbido corposo preda e, grazie alla forte comminuzione della preda, sono quasi impossibile per alcuni organismi, tra cui anfipodi. Forniamo dettagliati, romanzo approcci genetici per macroinvertebrati preda identificazione nella dieta di anfipodi.

Abstract

L'analisi di reti alimentari è essenziale per una migliore comprensione degli ecosistemi. Ad esempio, interazioni cibo web possono subire cambiamenti severi causati dall'invasione di specie non indigene. Tuttavia, un'esatta identificazione delle interazioni predatore-preda campo è difficile in molti casi. Queste analisi sono spesso basate su una valutazione visiva del contenuto intestinale o l'analisi dei rapporti dell'isotopo stabile (δ¹⁵N e δ¹³C). Tali metodi richiedono una conoscenza completa circa, rispettivamente, diversità morfologica o firma isotopica da preda singoli organismi, che conduce agli ostacoli nell'esatta identificazione di organismi di preda. Analisi del contenuto intestinale Visual sottovalutare soprattutto organismi morbido corposo preda, perché macerazione, ingestione e la digestione delle prede organismi rendono difficile identificazione di specie particolari. Quindi, strategie di reazione a catena (PCR) basata della polimerasi, ad esempio l'utilizzo di primer specifico del gruppo imposta, forniscono un potente strumento per l'indagine sulle interazioni di rete alimentare. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per studiare il contenuto dell'intestino dei macroinvertebrati consumatori da campo utilizzando primer gruppo-specifici insiemi di ribosomal nucleare dell'acido desossiribonucleico (rDNA). DNA può essere estratta dall'interi esemplari (nel caso di piccoli taxa) o dal contenuto dell'intestino di esemplari raccolti sul campo. Presenza e l'efficienza funzionale dei modelli di DNA devono essere confermati direttamente dall'individuo testato utilizzando primer universale imposta le rispettive subunità della DNA di targeting. Inoltre dimostriamo che preda consumata può essere determinato ulteriore fino a livello di specie tramite PCR con primer di gruppo-specifici non modificato combinato con analisi di polimorfismo (SSCP) conformazione successivo singolo filamento usando i gel di poliacrilammide. Inoltre, mostriamo che l'uso di tinture fluorescenti differenti come etichette consente la proiezione parallela per frammenti di DNA di preda diversi gruppi dai campioni contenuti multipli dell'intestino tramite l'analisi del frammento automatizzato.

Introduzione

Predatore-preda interazioni, che costituiscono la maggior parte delle interazioni trofiche e dinamiche web di cibo, sono aspetti fondamentali per caratterizzare i flussi di materia ed energia in tutto reti alimentari all'interno e tra gli ecosistemi, che è uno degli obiettivi principali dell'ecologia ¹. la determinazione dell'origine e il flusso di carbonio e sostanze nutrienti è promuovere la comprensione della connettività ecologica tra ecosistemi². Tuttavia, gli ecosistemi, come fiumi e loro bacini imbriferi, non sono solo legati da flussi di materia organica e nutrienti, ma anche dai movimenti di organismi

Protocollo

1. raccogliere macroinvertebrati dal campo e preparazione dei campioni per analisi del contenuto genetico Gut.

1. Raccogliere macroinvertebrati in ogni sito, ordinare gli individui delle specie dei consumatori di interesse in singole provette e congelarli direttamente in azoto liquido o ghiaccio secco per evitare la liquidazione dell'intestino e degradazione del DNA.
   Nota: Evitare di conservare campioni in alcool, perché alcuni macroinvertebrati tendono a rigurgitare prima l'alcool uccide loro.
2. Utilizzare solo nel tratto gastro-intestinale di medie e grandi (circa > mm 3) specie di macroinvertebrati per analisi del contenuto genetico in....

Risultati

Abbiamo utilizzato con successo la procedura descritta in questo protocollo per analisi di dieta all'interno di diversi studi. In questa sezione presentiamo esempi che descrivono l'applicabilità delle diverse sezioni del protocollo.

Ad esempio, per dimostrare l'efficacia del set di primer specifico del gruppo stabilito da autori²⁸ e le potenzialità di analisi successive a valle dei prodotti di PCR mediant.......

Discussione

Qui, presentiamo un metodo facile e conveniente per determinazione PCR-basata di interazioni predatore-preda da campioni di campo tramite gruppo-specifici primers per regioni di rDNA, che possono essere combinate con altre analisi non-molecolare dei campioni stessi. Tuttavia, ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo. In primo luogo, assicurare la specificità dei primer utilizzati è essenziale. In secondo luogo, è fondamentale evitare la contaminazione e la perdita di materiale contenuto intestinale dur.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
azoto liquido	Qualsiasi	NA	Per il trasporto di campioni di campo di macroinvertebrati al laboratorio.
Provette di reazione da 1,5 ml - Safelock	Any	NA	Per la raccolta di campioni di consumo sul campo e la successiva conservazione in azoto liquido, le provette di reazione non devono necessariamente essere pulite con PCR. Per evitare l'esplosione dei tubi, il coperchio dei tubi deve essere forato con un ago.
Stereomicroscopio	Any	NA	Assicurarsi che l'ingrandimento sia adatto a preparare il tratto gastro-intestinale della dimensione del consumatore di interesse.
Piastre di Petri	Qualsiasi	NA	Per sezionare il tratto gastrointestinale di campioni di consumo sotto lo stereomicroscopio.
Foceps in acciaio inossidabile: Pinza Dumont n. 7	Bioform	B40d	Questa pinza curva in acciaio inossidabile a volte può essere molto utile per tenere il campione fissato tra la parte curva senza perforare il tratto gastrointestinale.
Foceps in acciaio inossidabile: pinza Dumont Electronic No. 5	Bioform	B40b	Questa pregiata pinza in acciaio inossidabile è ideale per la preparazione del tratto gastro-intestinale di campioni di consumo.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Soluzione di decontaminazione per la rimozione di contaminazioni da DNA e RNA
Tovagliolo di carta senza peluria	Qualsiasi	da laboratorio NA
Qualsiasi		NA	La precisione deve essere di almeno 0,01 g.
Pipette per microlitri (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)	Qualsiasi
Safe-Lock da 2,0 ml	VWR	211-2165	È fondamentale che queste provette di razione siano prive di inibitori di DNA, DNasi, RNasi e PCR (PCR clean)!
Provette Safe-Lock da 1,5 ml	VWR	211-2164	È fondamentale che queste provette di razione siano prive di inibitori di DNA, DNasi, RNasi e PCR (PCR clean)!
Cloruro di sodio ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	Per tampone di estrazione del sale (SEB) e soluzione di NaCl 5M necessaria per l'estrazione del DNA.
Tris(idrossimetil)-amminometano Tris	carlroth	4855.2	Per tampone di estrazione del sale (SEB) e tampone TBE
Pipette per microlitri (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)	carlroth	8043.1	Per tampone di estrazione del sale (SEB) e tampone TBE
Acido borico ≥ 99,8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	Per tampone TBE. Non necessario se si ottiene un tampone TBE disponibile in commercio.
Sodio dodecil solfato (SDS)	carlroth	4360.1	Per l'estrazione della DNA
proteinasi K liofilo.	carlroth	7528.1	Preparare una soluzione di lavoro contenente 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Mulino per microsfere per l'omogeneizzazione dei campioni.
Perline in acciaio inossidabile, 5 mm	Quiagen	69989	Per l'omogeneizzazione dei campioni.
Termoscuotitore di riscaldamento	Qualsiasi	NA
Vortex Mixer	Qualsiasi	NA
Centrifuga refrigerata: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Centrifuga refrigerata utilizzata per la centrifugazione durante l'estrazione del DNA (Protocollo 1).
Isopropanolo	carlroth	6752,5
Etanolo 99,8 %, p.a.	Qualsiasi	NA
Grado di biologia molecolare (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	acqua priva di nucleasi (sterilizzata in flusso e trattata con DEPC) utilizzata per la risospensione del DNA e ogni volta che si riferisce a ddH2O all'interno del manoscritto
Olonucleotidi non modificati	Eurofins MWG Operon	NA	Primers non marcati
Olegonucleotidi modificati	Metabion International AG	NA	Primer marcati
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive per miscele di reazioni PCR (tampone di reazione Y e S, dNTP e MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler o peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	I set di primer sono stati originariamente stabiliti su un termociclatore a gradiente avanzato Primus 96. Poiché questo ciclatore era piuttosto vecchio, abbiamo quindi verificato se i nostri set di primer sono efficienti e specifici nelle stesse condizioni utilizzando il peqSta96x (che potrebbe anche simulare il modello precedente). Tuttavia, i test hanno dimostrato che i nostri primer funzionano bene e sono ancora specifici (vedi Koester et al. 2013) senza utilizzare la simulazione della vecchia macchina.
Piastre PCR standard a 96 pozzetti	VWR Peqlab	732-2879	Utilizzate per le reazioni PCR.
Strisce per provette a basso profilo da 0,15 ml con strisce per tappo piatto	VWR Peqlab	732-3223	Strisce per tappo utilizzate per chiudere le piastre PCR.
Agarosio	Peqlab	35-1020	Utilizzato per l'elettroforesi su gel.
Microonde	Qualsiasi	NA
Pallone conico	Qualsiasi	NA
Cilindro graduato	Qualsiasi	NA
Unità di elettroforesi orizzontale e rispettivi pettini con denti	Qualsiasi	NA	Per elettroforesi su gel di agarosio.
Alimentatore per elettroforesi PS3002	Life Technologies	NA
Soluzione di bromuro di etidio 1 %	carlroth	2218.1	Utilizzato per preparare il bagno di colorazione per gel di agarosio.
Formamide	carlroth	6749.1	Necessario per il tampone di denaturazione per le analisi SSCP.
Blu di bromfenolo	AppliChem	A3640.0010	Necessario per il colorante di caricamento per l'elettroforesi su gel di agarosio.
Saccarosio	carlroth	4621.1	Necessario per il colorante di caricamento per l'elettroforesi su gel di agarosio.
100 bp-DNA-Ladder esteso	carlroth	T835.1	Come standard di dimensioni per l'elettroforesi su gel di agarosio.
Sistema di documentazione UV	Any	NA	Per visualizzare i risultati dell'elettroforesi su gel.
Rotiphorese NF-Acrilammide/Bis-soluzione 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	Per la preparazione di gel di poliacrilammide.
Perossidisolfato di ammonio	carlroth	9592.2	Per la preparazione di gel di poliacrilammide.
clip pieghevoli (32 mm)	Qualsiasi	NA	Per la preparazione di gel di poliacrilammide.
scatola di plastica di forma quadrata (21 &volte; 6,5 &volte; 5 cm)	Qualsiasi	NA	Per la preparazione di gel di poliacrilammide.
Tetrametiletilendiammina (TEMED)	carlroth	23.67.1	Per la preparazione di gel di poliacrilammide.
Becher	Any	NA
RC 10 Refrigeratore digitale	VWR	462-0138	Per analisi SSCP con elettroforesi su gel di poliacrilammide.
Unità di elettroforesi verticale P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	Per analisi SSCP con elettroforesi su gel di poliacrilammide.
Lastra di vetro dentellata	VWR	730-0261	Per analisi SSCP mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.
Lastra di vetro vuota	VWR	730-0260	Per analisi SSCP mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.
Distanziatori	VWR	730-0262	Per analisi SSCP utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide.
Pettine a 25 denti	VWR	730-0294	Per analisi SSCP con elettroforesi su gel di poliacrilammide.
Piattaforma di agitazione	Qualsiasi	NA	Per l'agitazione costante del bagno di colorazione.
Colorazione per acido nucleico GelStar (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	Per la colorazione di gel di poliacrilammide.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	Per analisi automatizzate dei frammenti. Dimensione standard per il lotto B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	Per analisi automatizzate dei frammenti. Formato standard per il lotto A.
Soluzione di caricamento dei campioni (SLS)	AB Sciex	608082	Per analisi automatizzate dei frammenti.
Piastra di sequenziamento - Micropiastra PCR in polipropilene a 96 pozzetti	Costar	6551	Per analisi automatizzate di frammenti.
Centrifuga a piastre, PerfectSpin P	Peqlab	NA	utilizzata per la centrifuga di prodotti PCR.
Piastra tampone - 96 pozzetti EIA/RIA Polistirene trasparente a fondo piatto non trattato Micropiastra	Corning	9017	Per analisi automatizzate di frammenti.
GenomeLab Tampone di separazione	AB Sciex	608012	Per analisi automatizzate di frammenti.
Gel di separazione - LPAI	AB Sciex	608010	Per analisi automatizzate di frammenti.
Sequenzer - CEQ8000 Sistema di analisi genetica	Beckman Coulter	NA	Per l'analisi automatizzata dei frammenti.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	Per analizzare i risultati delle analisi automatizzate dei frammenti.