Articolo metodologico

Derivazione libera dell'integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo usando la matrice Laminina 521

DOI:

10.3791/56146

⸱

7 luglio 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una robusta derivazione di cellule pluripotenti indotte da humano (hiPS) è stata ottenuta utilizzando riprogrammazione mediata dei fibroblasti dermici da virus Sendai (SeV) non integrante. La manutenzione delle cellule hiPS e l'espansione clonale sono state eseguite usando condizioni di coltura xeno-free e chimicamente definite con matrice umana laminina 521 (LN-521) e Essential E8 (E8) Medium ricombinante.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le condizioni prive di Xeno e completamente definite sono parametri fondamentali per una generazione robusta e riproducibile di cellule pluripotenti indotte da umano omogeneo (hiPS). La manutenzione delle cellule hiPS sulle cellule alimentatori o alle matrici non definite sono suscettibili a varianze di lotto, alla contaminazione patogena e al rischio di immunogenicità. Utilizzando la matrice umana ricombinante laminina umana 521 (LN-521) in combinazione con formulazioni di media xeno e definite, riduce la variabilità e consente la generazione costante di cellule hiPS. Il virus Sendai virus (SeV) è un sistema basato su RNA non integrato, evitando quindi le preoccupazioni associate al potenziale effetto dirompente sull'integrità genoma che i vettori integranti possono avere. Inoltre, questi vettori hanno dimostrato un'efficienza relativamente elevata nella riprogrammazione dei fibroblasti dermici. Inoltre, la passaggistica cellulare singola enzimatica agevola la manutenzione omogenea delle cellule hiPS senza una notevole esperienza precedente di ce ce ceCultura. Qui descriviamo un protocollo che è stato ampiamente testato e sviluppato con particolare attenzione alla riproducibilità e alla facilità d'uso, fornendo un modo robusto e pratico per generare cellule umane hiPS definite e prive di xeno dai fibroblasti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dal momento che la prima derivazione delle linee cellulari hiPS da Takahashi et al. 1 , 2 , le cellule hiPS hanno fornito uno strumento utile per la modellizzazione delle malattie, la scoperta di farmaci e come materiale di origine per la generazione di terapie cellulari in medicina rigenerativa 3 . La coltura di cellule hiPS è da tempo dipendente dalla co-coltura con le cellule di alimentazione di fibroblasti 4 , 5 o su Matrigel 6 e con formulazioni di supporto contenenti serum bovino fetale (FBS). Le varianze batch-to-batch sono una conseguenza comune della natura indefinita di queste condizioni di coltura, con conseguente variazioni imprevedibili, che contribuiscono in modo significativo alla inaffidabilità di questi protocolli 7 . Lo sviluppo di un mezzo definito come Essential 8 (E8) 8 e le matrici di colture cellulari definite ad esempio LN-521 9 , consentonoS per la creazione di protocolli altamente riproducibili e aiuti nella robusta generazione e manutenzione di cellule hiPS omologate 7 , 8 , 9 , 10 .

Lo sviluppo di tecniche di riprogrammazione gratuite di integrazione è stato un salto in avanti. Originariamente, la riprogrammazione dipendeva da vettori retrovirali che sono stati integrati in modo casuale nel genoma con effetti disruptivi sull'integrità genomica 11 . I progressi nelle metodologie di riprogrammazione includono lo sviluppo di vettori basati su RNA. I vettori RNA hanno un vantaggio rispetto al metodo di riprogrammazione basata sul DNA, poiché l'integrazione involontaria attraverso la ricombinazione genomica non è possibile 12 . I vettori SeV forniscono un'elevatissima e transitoria di fattori esogeni attraverso RNA a singolo filamento senza una fase DNA- 11 . I vettori di riprogrammazione consegnati dal SeVSono diluiti per tutta l'espansione cellulare e, infine, spurgati dalla cultura fornendo un metodo di riprogrammazione libero. Successivamente, la manutenzione della pluripotenza dipende dall'espressione endogena dei geni pluripotenziali 2 .

Poiché pionieristici terapie a base di cellule hiPS stanno cominciando a passare a studi clinici, le richieste di lotti standardizzati, la riproducibilità e la sicurezza sono questioni essenziali per affrontare 13 . Pertanto, i prodotti di origine animale devono essere evitati. Ad esempio, l'uso di prodotti xenogeneici è stato associato al rischio di contaminazione degli agenti patogeni non umani. Inoltre, le cellule colte in presenza di componenti animali della coltura animale hanno dimostrato di incorporare acidi silici non umani nelle membrane cellulari che minaccia di rendere le cellule derivate immunogeniche 14 . Quindi, la necessità di eliminare i prodotti xenogeneic è necessaria per qualsiasi futura ricerca clinica. Questo protocollo si applica xeCultura priva di libertà e definizione nel mantenimento delle cellule hiPS che muovono le cellule più vicine alla conformità clinica.

Questo protocollo descrive un metodo coerente, altamente riproducibile e facile da usare che genera cellule hiPS standardizzate dai fibroblasti. Offre inoltre un sistema di coltura di facile utilizzo per la manutenzione di cellule hiPS stabilite. Questo protocollo è stato utilizzato per ricavare più di 300 linee di cellule hiPS nel centro nazionale svedese di iPS Core a Karolinska Institutet di cui alcune linee sono state precedentemente descritte 15 , 16 .

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La raccolta del materiale del paziente e la derivazione delle cellule hiPS è approvata dal Consiglio di revisione dell'etica, Stoccolma, 28 marzo 2012, Numero di registrazione: 2012 / 208-31 / 3. Le fasi della coltura cellulare devono essere eseguite in armadi di biosicurezza, salvo diversa indicazione. Praticare sempre tecniche di manipolazione sterili quando si lavora con le cellule. Lasciare che i supporti, le lastre e i reagenti raggiungano la temperatura ambiente prima di iniziare. Incubare le cellule a 37 ᵒC, 5% CO 2 in alta umidità.

1. Isolamento di fibroblasti umani da biopsia cutanea

  1. Preparazioni di medium di coltura, enzimi digestivi, rivestimento di piatti e strumenti di dissezione.
    1. Preparare il medium Fibroblast: 44,5 ml di Medius Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove, 5 ml di fegato fetale bovino (FBS) e 500 μL di penicillina / streptomicina (PEST) (vedere tabella 1 ), conservare a 4 ° C.
    2. Preparare gli enzimi digestivi ad una concentrazione di lavoro di 1 mg / ml: weiGh aliquote di 4 mg di dispasi e collageno di tipo I in tubi separati da 15 ml e si sciolgono in 4 mi di DMEM / F12 + 1% PEST. Sterilizzare la soluzione enzimatica passandola attraverso un filtro da 0,22 μm. Preparare ogni volta le soluzioni enzimatiche fresche.
    3. Cappare un pozzetto in una piastra di coltura del tessuto a 6 pozzetti (o piatto da 35 mm di coltura tissutale) per biopsia sezionata con 1 ml di gelatina 0,1% in soluzione salina fosfata tamponata (DPBS). Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
    4. Autoclave un set di forbici chirurgiche e pinze per biopsia per la dissezione.
  2. Manipolazione biopsia
    NOTA: procedere alle biopsie del processo il più velocemente possibile dopo essere state prese. Conservare in PBS + 1% PEST per un massimo di 48 ore a 4 ° C. La biopsia dovrebbe essere di 2 - 4 mm di diametro e secondo i permessi etici.
    1. Trasferire la biopsia in un piatto da 35 mm. Spostare la biopsia in un nuovo piatto da 35 mm e immergere la biopsia in 2 ml di etanolo al 70% per 30 s.
    2. Spostare la biopsia in un terzoPiatto da 35 mm e lavare con 1 ml di soluzione salina equilibrata Hank (HBSS) sterile, completa di PEST 1%.
    3. Trasferire la biopsia in un quarto piatto da 35 mm, aggiungere 1 ml di soluzione di dispersione al 0,1% di preparati freschi.
    4. Tagliare la biopsia cutanea in 1 - 2 mm 3 pezzi nel piatto utilizzando forbici e pinze chirurgiche e trasferire pezzi di biopsia inclusa la soluzione di dispersione in un tubo da 15 ml. Aggiungere un ulteriore 2 ml di dispersione.
    5. Sciacquare il piatto da 35 mm con una soluzione di dispasione da 1 ml e trasferire nel tubo da 15 ml.
    6. Incubare la biopsia a 4 ° C per una notte.
    7. Aggiungere 4 ml di collagenasi I 0,1% al tubo e incubare a 37 ° C per 4 ore.
    8. Centrifugare le cellule digerite 300 xg per 3 min, aspirare il surnatante e risospendere il digest in 2 mL di mezzo di fibroblasto.
    9. Rimuovere la soluzione di gelatina dalla piastra di coltura del tessuto a 6 pozzetti. Trasferire la sospensione cellulare includendo eventuali pezzi rimanenti a una piastra di coltura di tessuti a 6 pozzetti (o 35 mM piatto di coltura tissutale) pre-rivestito con gelatina 0,1% in DPBS.
    10. Cambiare il terreno ogni terzo giorno.
  3. Espansione dei fibroblasti umani
    NOTA: I fibroblasti sono pronti per essere passati a un pallone di coltura di tessuti T25 (25 cm2) quando l'80% confluente ( Figura 2B ). I fibroblasti in genere raggiungono l'80% confluenza entro 7 giorni. Tuttavia, il tempo richiesto può variare notevolmente ma non deve superare le 4 settimane.
    1. Aspirare il mezzo e lavare una volta con 2,5 mL di DPBS.
    2. Rimuovere DPBS e aggiungere 1 mL di Trypsin-EDTA (0,05%) e incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando le cellule visualizzano i bordi arrotondati e cominciano a staccarsi.
    3. Aggiungere 2 ml di mezzo di fibroblasti, se necessario sciacquare le cellule assicurando una disassociazione appropriata delle cellule. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo da 15 mL e centrifugare a 300 xg per 3 min.
    4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di fibroblasti e di fibroblasti di piastre in unColla T25 a coltura cellulare su tessuto cellulare. Quando si espandono i fibroblasti dopo questa fase, dissociare come sopra descritto e sementi 12 x 10 3 cellule / cm 2 .
    5. Una volta che le cellule confluenti sono pronte per essere congelate, espandere o piastra per riprogrammare. Fermare due cicli di fibroblasti prima di iniziare qualsiasi riprogrammazione (vedi sezione successiva per la procedura di congelamento). La riprogrammazione dell'efficienza è generalmente più elevata per i fibroblasti di passaggio più bassi, le cellule al passaggio 2 - 4 sono ottimali. Tuttavia, la riprogrammazione riuscita di fibroblasti fino al passaggio 10 è stata condotta usando questo protocollo.
  4. Congelamento e scongelamento dei fibroblasti
    1. Preparare il mezzo fresco di fibroblast: 90% FBS + 10% dimetilsolfossido (DMSO). Tenere a 4 ° C ( Tabella 1 ). Una volta confluent, il pallone di coltura tessuto T25 può essere congelato in tre cryovials. Preparare 500 μL di mezzo di congelamento di fibroblasti per flaconcino congelato.
    2. Per bloccare le cellule, dissociare cCome descritto nel punto 1.3, contano le cellule usando un emocitometro e trasferiscono porzioni di 3 x 10 5 cellule a 15-mL tubi. Infilare i tubi a 300 xg per 3 min. Aspirare il surnatante.
    3. Resuspendere le pellicole di cellule in 500 μl di 4 ° C di fibroblasto e trasferire in crisi. Posizionare le fiale in un contenitore di congelamento e incubare le cellule a -80 ° C per 24 ore prima di trasferirle in azoto liquido per l'immagazzinamento a lungo termine.
    4. Per scongelare le celle, immergere la parte inferiore del crioviale in acqua di 37 ° C. Una volta liquefatto, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL e aggiungere 5 mL di mezzo di fibroblasto. Le cellule di spin 300 xg per 3 min.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo di fibroblasti. Trasferire le cellule in un pallone di coltura tissuale T25 non rivestito e incubare a 37 ° C.

2. SeV Vector Riprogrammazione dei Fibroblasti

  1. Preparazione di aliquote vettoriali
    ATTENZIONE: Maneggiare la SeV sotto il contenimento del livello 2 di biosicurezza. Fare riferimento al protocollo del produttore e alle linee guida locali 17 . Il titolo di virus varia tra i lotti.
    1. Prima di preparare aliquote calcolare la quantità di vettore necessaria per 5 x 10 4 celle secondo il protocollo del produttore ( ad esempio , CytoTune 2.0). Il titolo del virus varia generalmente da 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Sciogliere e combinare i vettori 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 e hKlf4 = MOI 3). Portare la quantità calcolata per la riprogrammazione di 5 x 10 4 cellule in tubi autoclavati da 1,5 ml. Aliquote del virus dilatate con il mezzo di fibroblasto a un volume finale di 250 μL per la riprogrammazione.
      NOTA: Ogni fiala è valida per la riprogrammazione di un pozzetto di una piastra di coltura del tessuto da 24 pozzetti con 5 x 10 4 fibroblasti. Conservare le aliquote del virus a -80 ° C.
  2. SeV Trasduzione vettoriale
    1. Aspira cu cuMescolare e lavare con 1 mL di DPBS. Aspirare DPBS e aggiungere 1 mL di Trypsin-EDTA (0,05%). Incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando le cellule sono staccate.
    2. Aggiungere 2 ml di mezzo di fibroblasti e risospendere le cellule e trasferire in un tubo da 15 ml. Centrifugare 300 xg per 3 min.
    3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di mezzo di fibroblasti.
    4. Contare i fibroblasti usando un emocitometro e le sementi di 5 x 10 4 cellule in un pozzo di una piastra di coltura del tessuto da 24 pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C per una notte.
    5. Aspirare il mezzo di coltura cellulare, aggiungere 250 μL della soluzione SeV e incubare a 37 ° C per una notte.
    6. Cambia media media giornaliera in fibroblasti fresche. Lasciare che le cellule trasmesse crescano per 7 giorni prima di essere passate alle piastre rivestite con LN-521. Preparare le piastre LN-521 il giorno prima del passaggio. Fare riferimento al punto 2.3.1 per la procedura di rivestimento.
  3. Riproduzione di fibroblasti trasdurate
    1. Preparazione di LN-521 piatti rivestiti: Diluire LN-521 in DPBS fino ad una concentrazione finale di 0,63 μg / cm 2 . Pipettare 2 ml della soluzione LN-521 per un piatto di coltura tissutale da 60 mm. Sigillare il piatto da 60 mm di coltura tissutale utilizzando il parafilm. Incubare per una notte a 4 ° C.
    2. Preparare le aliquote Medie (E8) Essential 8 per una facile manipolazione: 48,5 ml di media E8, 1 ml di supplemento E8 e 500 μL di PEST ( Tabella 1 ).
    3. 7 giorni dopo la trasduzione, passare le cellule ad un LN-521 rivestito piatto da 60 mm di coltura tissutale. Aggiungere 250 μl di Trypsin-EDTA (0,05%) e incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando le cellule sono staccate. Aggiungere 2 mL di fibroblasti e centrifugare le cellule per 3 min a 300 x g.
    4. Aspirare il surnatante. Resuspendere il pellet in 2 ml di mezzo di fibroblasti e contare le cellule in un emocitometro. Aspirare la soluzione LN-521 dalla piastra pre-rivestita e seminare 4 x 10 4 cellule in 5 ml di mezzo di fibroblasti nel piatto LN-521 pre-rivestito da 60 mm. Aggiungere inibitore della Rho-chinasi Y-27632(ROCKi) ad una concentrazione finale di 5 μM. Incubare a 37 ° C per una notte.
    5. Importante, il giorno successivo, cambiare media a media E8. Cambia E8 media ogni giorno. Le colonie cellulari hiPS emergono entro 2-3 settimane.

3. Raccolta delle colonie e espansione delle cellule hiPS

NOTA: i seguenti passaggi vengono eseguiti al di fuori dell'armadio della biosicurezza sotto un microscopio stereo. L'uso di hairnet e maschere di procedura è consigliato. Lavori attentamente per non contaminare la cultura cellulare.

  1. Preparare la coltura del tessuto LN-521 a 24 pozzetti il ​​giorno prima della raccolta. Diluire LN-521 in DPBS 0,63 μg / cm 2 . Pipettare 250 μL della soluzione LN-521 in un pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 24 pozzetti. Piastre di tenuta con parafilm. Incubare per una notte a 4 ° C.
    NOTA: le colonie sono pronte per essere selezionate quando raggiungono una dimensione di diametro superiore a 1 mm. Le colonie dovrebbero presentare spigoli vivi e crescere in monogeno omogeneoOlayers ( figura 2D ).
  2. Aspirare la soluzione LN-521 e aggiungere 500 μl di E8 in un pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 24 pozzetti.
  3. Tagliare le colonie in pezzi più piccoli con un bisturi in un modello a griglia sotto uno stereomicroscopio. Raschiare meccanicamente i fogli delle cellule dal piatto e trasferire i fogli utilizzando una pipetta da 200 μl al pozzetto preparato ( Figura 2D -2E ). Raccogliere le colonie in pozzetti separati.
  4. Lasciare che le cellule si attacchino senza cambiare mezzo per 48 h. Successivamente, cambiare E8 media giornalmente.
  5. Quando le colonie hanno raggiunto dimensioni superiori a 5 mm, le cellule enzimatiche passano come singole cellule a un nuovo pozzetto di una piastra rivestita con LN-521.
  6. Aspira il mezzo di coltura cellulare dalle cellule e lavare con 250 μL di DPBS.
  7. Aspira DPBS. Aggiungere 250 μL di reagente di dissociazione e incubare per 3 minuti a 37 ° C.
  8. Osservate che le cellule hanno cominciato a arrotondare. distaccareLe cellule dalla piastra sciacquando le cellule con reagente di dissociazione poche volte.
  9. Aggiungere 500 μl di mezzo E8 a un tubo da 15 ml. Trasferire le cellule nel reagente di dissociazione nel tubo e centrifugare per 3 min a 300 x g.
  10. Aspirare la soluzione LN-521 dal pozzetto pre-rivestito LN-521 e aggiungere 500 μl di temperatura ambiente E8.
  11. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 500 μl di mezzo E8.
  12. Contare le cellule usando un emocytometro e le sementi di 2,5 x 10 4 - 5 x 10 4 nel pozzetto preparato LN-521 preparato (1,25 x 10 4 - 2,5 x 10 4 cellule / cm 2 ). Il formato della coltura cellulare può essere facilmente rielaborato per adattarsi allo scopo previsto.
  13. Aggiungere ROCKi ad una concentrazione finale di 10 μM. Incubare le cellule a 37 ° C.
  14. Cambia E8 media ogni giorno. Le cellule sono solitamente pronte al passaggio dopo 4 - 6 giorni. Le cellule di passaggio enzimatico come singole cellule come descritte sopra, quando il confluento circa il 90%.
    NOTA: I vettori di riprogrammazione sono progressivamente diluiti durante l'espansione delle cellule hiPS e non rilevabili dopo il passaggio 12. Le cellule che sono riprogrammate imparzialmente spesso cessano di proliferare attorno al passaggio 6 - 10 o perdono la loro caratteristica pluripotente morfologia delle cellule staminali ( Figura 3B ).
  15. Congelamento e scongelamento delle cellule hiPS
    1. Per congelare le cellule, dissociare enzimaticamente le cellule come singole cellule come sopra descritto, contare le cellule in un emocitometro e trasferire le cellule di 2,5 x 10 5 in un tubo da 15 mL contenente 1 mL di mezzo E8. Centrifugare a 300 xg per 3 min. Aspirare il surnatante.
    2. Resuspendere il pellet cellulare in 250 μl di cryomedium PSC a 4 ° C e trasferire in un cryovial. Posizionare il flaconcino in un contenitore di congelamento e incubare le cellule a -80 ° C per 24 ore prima di trasferirle in azoto liquido per l'immagazzinamento a lungo termine.
    3. Per scongelare le cellule, preparare un pozzetto LN-521 pre-stratificato di una coltura di tessuto da 24 pozzettiPiastra aspirando la soluzione LN-521 ed aggiungendo 250 μl di mezzo E8. Immergere la parte inferiore del crioviale in acqua di 37 ° C finché rimane solo un piccolo ghiaccio.
    4. Aggiungere 250 μl di E8 Medium al crioviale e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e aggiungere 1 ml di mezzo E8. Le cellule di spin 300 xg per 3 min.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 250 μl di media di temperatura ambiente E8. Trasferire la sospensione cellulare nel pozzetto preparato e aggiungere un supplemento di vitalità cellulare di 1% o 10 μM ROCKi. Incubare la piastra di coltura tissutale a 37 ° C.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dalla biopsia alle cellule hiPS

L'intero processo dalla biopsia alle cellule hiPS stabilite, lontano dal vettore di riprogrammazione e pronto per la caratterizzazione, richiede circa 16 settimane ( Figura 1 ). Una sequenza più dettagliata è specificata nella Figura 2A . Circa 4 settimane sono necessarie per stabilire e ampliare le colture di fibroblasti. Le prime colonie...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il risultato atteso di questo protocollo è la generazione di successo di diverse linee cellulari hiPS derivate clonali. Importante, il metodo per la manutenzione e l'espansione delle cellule hiPS stabilite qui descritto è affidabile e può essere eseguita con poca esperienza precedente della coltura delle cellule staminali. La passaggio di cellule enzimatiche con ROCKi insieme alla matrice LN-521 è noto per mantenere le cellule come cariotipicamente normali, pluripotenti e facilmente capaci di differenziarsi evitando...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da segnalare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da agenti di finanziamento SSF (B13-0074) e VINNOVA (2016-04134).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DispaseLife Technologies171105-041Digestione per biopsia
CollagenasiSigmaC0130Digestione per biopsia
GelatinaSigmaG1393Matrice di fibroblasti
IMDMLife Technologies21980002-032Terreno per fibroblasti
FBSInvitrogen10270106Terreno
per fibroblastiPenicillina/StreptomicinaLife Technologies15070-063Antibiotic
Essential 8 terreniThermFisher ScientificA1517001terreni di coltura cellulare iPS
LN-521BiolaminaLN521-03matrice di coltura cellulare iPS
TrypLE select 1XThermoFisher Scientific12563011Reagente di dissociazione
Inibitore della Rho-chinasi Y27632MilliporeSCM075Inibitore della Rho-chinasi (ROCKi)
CytoTune - kit di riprogrammazione iPS 2.0Life TechnologiesA1377801vettore di riprogrammazione del virus Sendai Piatto
coltura tissutale da 35 mmSarstedt83.3900.300Piastre
coltura tissutale da 60 mmSarstedt83.3901.300
Piastre per coltura tissutale da 24 pozzettiSarstedt83.3922.300Fiasche per colture cellulari
T25VWR734-2311Colture cellulari
Provette da 15 mLCorning430791Provette per centrifuga Provette
1,5 mLEppendorf0030123.301Provetta da 1,5 mL
CoolCell LXBiocisionBCS-405Contenitore per congelamento
DMSOSigmaD2650-100mlCrioviali per congelamento di fibroblasti
1,8 mLVWR479-6847Kit
crioconservazione per crioconservazionePSC GibcoA2644601PSC CryomediumRevitaIntegratore cellulare
Tripsina-EDTA (0,05%)ThermoFisherScientific25300054Enzima di dissociazione dei fibroblasti
DMEM/F12Life Technologies31331-028Diluente
DPBSLife Technologies14190-094PBS
HBSSThermoFIsher Scientific14025-050Emocitometro per preparazione alla biopsia
SigmaBRAND, 718920Conteggio delle cellule
ParafilmVWR291-1213Piastre di tenuta per la conservazione
di per per colture cellulari per colture cellulari da di per enzimi digestivi

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195(2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009).
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
  22. Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016).
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Vettore del virus Sendaisistema di coltura xeno freeriprogrammazione dei fibroblastiprocedura di picking delle coloniepassaggi enzimaticimarcatori di pluripotenzadifferenziamento in corpi embrioidiformulazione di terreni definiti

Articoli correlati