Una robusta derivazione di cellule pluripotenti indotte da humano (hiPS) è stata ottenuta utilizzando riprogrammazione mediata dei fibroblasti dermici da virus Sendai (SeV) non integrante. La manutenzione delle cellule hiPS e l'espansione clonale sono state eseguite usando condizioni di coltura xeno-free e chimicamente definite con matrice umana laminina 521 (LN-521) e Essential E8 (E8) Medium ricombinante.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Derivazione libera dell'integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo usando la matrice Laminina 521
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le condizioni prive di Xeno e completamente definite sono parametri fondamentali per una generazione robusta e riproducibile di cellule pluripotenti indotte da umano omogeneo (hiPS). La manutenzione delle cellule hiPS sulle cellule alimentatori o alle matrici non definite sono suscettibili a varianze di lotto, alla contaminazione patogena e al rischio di immunogenicità. Utilizzando la matrice umana ricombinante laminina umana 521 (LN-521) in combinazione con formulazioni di media xeno e definite, riduce la variabilità e consente la generazione costante di cellule hiPS. Il virus Sendai virus (SeV) è un sistema basato su RNA non integrato, evitando quindi le preoccupazioni associate al potenziale effetto dirompente sull'integrità genoma che i vettori integranti possono avere. Inoltre, questi vettori hanno dimostrato un'efficienza relativamente elevata nella riprogrammazione dei fibroblasti dermici. Inoltre, la passaggistica cellulare singola enzimatica agevola la manutenzione omogenea delle cellule hiPS senza una notevole esperienza precedente di ce ce ceCultura. Qui descriviamo un protocollo che è stato ampiamente testato e sviluppato con particolare attenzione alla riproducibilità e alla facilità d'uso, fornendo un modo robusto e pratico per generare cellule umane hiPS definite e prive di xeno dai fibroblasti.
Introduzione
Dal momento che la prima derivazione delle linee cellulari hiPS da Takahashi et al. 1 , 2 , le cellule hiPS hanno fornito uno strumento utile per la modellizzazione delle malattie, la scoperta di farmaci e come materiale di origine per la generazione di terapie cellulari in medicina rigenerativa 3 . La coltura di cellule hiPS è da tempo dipendente dalla co-coltura con le cellule di alimentazione di fibroblasti 4 , 5 o su Matrigel 6 e con formulazioni di supporto contenenti serum bovino fetale (F....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
La raccolta del materiale del paziente e la derivazione delle cellule hiPS è approvata dal Consiglio di revisione dell'etica, Stoccolma, 28 marzo 2012, Numero di registrazione: 2012 / 208-31 / 3. Le fasi della coltura cellulare devono essere eseguite in armadi di biosicurezza, salvo diversa indicazione. Praticare sempre tecniche di manipolazione sterili quando si lavora con le cellule. Lasciare che i supporti, le lastre e i reagenti raggiungano la temperatura ambiente prima di iniziare. Incubare le cellule a 37 ᵒC, 5% CO 2 in alta umidità.
1. Isolamento di fibroblasti umani da biopsia cutanea
- Preparazioni....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Dalla biopsia alle cellule hiPS
L'intero processo dalla biopsia alle cellule hiPS stabilite, lontano dal vettore di riprogrammazione e pronto per la caratterizzazione, richiede circa 16 settimane ( Figura 1 ). Una sequenza più dettagliata è specificata nella Figura 2A . Circa 4 settimane sono necessarie per stabilire e ampliare le colture di fibroblasti. Le prime col.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il risultato atteso di questo protocollo è la generazione di successo di diverse linee cellulari hiPS derivate clonali. Importante, il metodo per la manutenzione e l'espansione delle cellule hiPS stabilite qui descritto è affidabile e può essere eseguita con poca esperienza precedente della coltura delle cellule staminali. La passaggio di cellule enzimatiche con ROCKi insieme alla matrice LN-521 è noto per mantenere le cellule come cariotipicamente normali, pluripotenti e facilmente capaci di differenziarsi evitando.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da segnalare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da agenti di finanziamento SSF (B13-0074) e VINNOVA (2016-04134).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Digestione per biopsia |
| Collagenasi | Sigma | C0130 | Digestione per biopsia |
| Gelatina | Sigma | G1393 | Matrice di fibroblasti |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Terreno per fibroblasti |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Terreno |
| per fibroblastiPenicillina/Streptomicina | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 terreni | ThermFisher Scientific | A1517001 | terreni di coltura cellulare iPS |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | matrice di coltura cellulare iPS |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Reagente di dissociazione |
| Inibitore della Rho-chinasi Y27632 | Millipore | SCM075 | Inibitore della Rho-chinasi (ROCKi) |
| CytoTune - kit di riprogrammazione iPS 2.0 | Life Technologies | A1377801 | vettore di riprogrammazione del virus Sendai Piatto |
| coltura tissutale da 35 mm | Sarstedt | 83.3900.300 | Piastre |
| coltura tissutale da 60 mm | Sarstedt | 83.3901.300 | |
| Piastre per coltura tissutale da 24 pozzetti | Sarstedt | 83.3922.300 | Fiasche per colture cellulari |
| T25 | VWR | 734-2311 | Colture cellulari |
| Provette da 15 mL | Corning | 430791 | Provette per centrifuga Provette |
| 1,5 mL | Eppendorf | 0030123.301 | Provetta da 1,5 mL |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | Contenitore per congelamento |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Crioviali per congelamento di fibroblasti |
| 1,8 mL | VWR | 479-6847 | Kit |
| crioconservazione per crioconservazione | PSC Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaIntegratore cellulare |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Enzima di dissociazione dei fibroblasti |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Diluente |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Emocitometro per preparazione alla biopsia |
| Sigma | BRAND, 718920 | Conteggio delle cellule | |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | Piastre di tenuta per la conservazione |
Riferimenti
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced p....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
