L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare come presentare gli odoranti a bassa volatilità per la registrazione singolo-sensillare da parte dei neuroni del recettore olfattivo Drosophila che rispondono ai feromoni cuticolari a catena lunga.
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Sommario
Abstract
Gli insetti si affidano al loro senso di odore per guidare una vasta gamma di comportamenti critici per la loro sopravvivenza, come la ricerca di cibo, l'evasione dei predatori, l'oviposizione e l'accoppiamento. Le sostanze chimiche di varie volatilità variabili sono state identificate come odoranti naturali che attivano gli insetti del recettore del olfattivo (ORN). Tuttavia, studiare le risposte olfattive agli odoranti a bassa volatilità è stato ostacolato dall'incapacità di effettivamente presentare tali stimoli usando metodi convenzionali di erogazione. Qui descriviamo una procedura che consente la presentazione efficace di odoranti a bassa volatilità per la registrazione in singola sensillazione in vivo (SSR). Minimizzando la distanza tra l'origine dell'odore e il tessuto bersaglio, questo metodo consente l'applicazione di odori biologicamente salienti ma finora inaccessibili, compreso l'acido palmitoleico, un feromone stimolante con un effetto dimostrato sugli ORN coinvolti nel corteggiamento e nel comportamento di accoppiamento 1 .La nostra procedura offre quindi un nuovo modo di analizzare una serie di odoranti a bassa volatilità per lo studio dell'intelligenza degli insetti e della comunicazione feromonica.
Introduzione
Gli ORN di Drosophila rispondono ad un vasto numero di odoranti, con lunghezze lunghe di catene di carbonio e vari gruppi funzionali, inclusi esteri, alcoli, chetoni, lattoni, aldeidi, terpeni, acidi organici, ammine, composti di zolfo, eterocicli e aromi 2 , 3 . Gli odoranti variati nelle loro caratteristiche fisico-chimiche possono avere volatilità notevolmente diverse, indicati dalla pressione del vapore del composto. In particolare, gli odoranti biologicamente rilevanti per Drosophila melanogaster differiscono tremendamente nella loro volatilità. Ad esempio, i ORN di Ir92a rispondono ad ammoniaca 4 , altamente volatile, con una pressione di vapore di 6.432 mmHg a 20 ° C. Al contrario, Or67d ORN risponde a un feromone maschio, cis- Vaccenil acetato ( c VA) 5 , 6 , la cui pressione vapore è di 43 mmHg a 20 ° C.
Ove_content "> Studiare la risposta olfattiva agli odoranti a bassa volatilità è particolarmente impegnativa con i metodi convenzionali di erogazione, in cui gli odoranti vengono consegnati attraverso un flusso d'aria di supporto su una distanza relativamente lunga ( cioè diversi centimetri), in quanto tali le risposte olfattive riportate Ad un determinato odorante a bassa volatilità può variare notevolmente, a seconda della progettazione del sistema di erogazione. Ad esempio, la risposta riportata di Or67d ORN ad un'elevata dose di c VA va da ~ 40 7 -> 200 picchi / s 6 Inoltre, l'inefficace consegna di c VA con metodi di consegna convenzionali è probabilmente attribuita a risultati falsi negativi, portando all'interpretazione che c VA di per sé non è sufficiente ad attivare OR67d ORNs 8. Questa interpretazione fu successivamente contestata da un altro studio che utilizza un Metodo di erogazione di odore a distanza ravvicinata 9. È quindi imperaPer sviluppare un sistema di erogazione robusto per la presentazione efficace di odoranti a bassa volatilità.Recentemente, abbiamo identificato diversi acidi grassi cuticolari a catena lunga come ligandi per Or47b ORNs. Sono alloggiati nel tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Fra gli odoranti di acido grasso a lunga catena, abbiamo scoperto che l'acido palmitoleico funziona come un feromone afrodisiaco che promuove il corteggiamento maschile attivando Or47b ORNs 1 . Tuttavia, in un altro studio che utilizza un metodo di consegna convenzionale di odore, è stato dimostrato che la laurate di metile provocava risposte da OR47b ORN, mentre l'acido palmitoleico non ha generato risposta se viene presentata dalla stessa distanza 10 . Rispetto a c VA, gli acidi grassi a catena lunga sono ancora meno volatili, con pressioni di vapore inferiori a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . La volatilità intrinsecamente bassa di odoranti di acido grasso a catena lunga, che impedisce un'efficace presentazione all'antenna viaSistemi di consegna convenzionali, probabilmente rappresentavano i risultati falsi negativi 10 . Questa incoerenza evidenzia l'inadeguatezza dei sistemi convenzionali di erogazione in presenza di odoranti a bassa volatilità. È stato dimostrato in precedenza che l'efficace erogazione di odori cuticolari di mosca richiede una stretta vicinanza tra l'origine dell'odore e il tessuto bersaglio 6 . Pertanto, per caratterizzare in modo completo gli effetti dei feromoni biologicamente attivi, imitando la distanza da cui sono probabilmente incontrati dalle mosche di frutta nella natura 12 , 13 , abbiamo convenuto che la distanza minima deve essere accordata ad alta priorità nella nostra procedura.
Il nostro metodo offre ulteriori vantaggi, compresa la compatibilità con le righe e le tecniche di elettrofisiologia standard. Le impostazioni preliminari di rigature richiedono una modifica minima per ospitare questo protocollo e la maggior parte dei passaggi SSR richiedono solo piccole regolazioni. QuestoRende la nostra tecnica facilmente accessibile ai ricercatori esperti in SSR. Inoltre, la nostra tecnica consente la presentazione di odoranti a bassa volatilità con instabilità e offset, correlando la distribuzione dello stimolo con la risposta neuronale. Infine, il layout hardware facilita gli scambi rapidi tra le cartucce odoranti, accelerando la raccolta dei dati su un intervallo di dosaggio desiderato.
Iniziamo esaminando la preparazione di elettrodi di riferimento e di registrazione, soluzione adulti Hemolymph-Like (AHL), cartucce di erogazione odoranti e il corrispondente olfattometro. Discuteremo poi la preparazione delle soluzioni odoranti dell'acido palmitoleico, seguita dalla preparazione della mosca per la registrazione. Continuiamo a considerare i criteri per la selezione di un sensitivo trichoide per registrare e esaminare più approfonditamente il posizionamento della cartuccia odorante prima di presentare i dati rappresentativi acquisiti utilizzando questo metodo. Infine, concludiamo esplorando le applicazioni utili di questa tecnicaUe, alcuni problemi incontrati e le loro soluzioni.
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Protocollo
1. Preparazione dell'hardware per la registrazione a4
- Utilizzare uno strumento per estrarre pipette per preparare elettrodi con capillari in vetro di alluminosilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Spingere leggermente la punta dell'elettrodo di riferimento con una coppia di pinze fine per facilitare l'inserimento nel clypeus della mosca ( cioè una piastra arrotondata nella parte anteriore della testa di mosca, sopra le bocche).
NOTA: 7 giorni di WT maschi (Berlino) sono stati utilizzati in questo studio. Utilizzare la soluzione salina AHL 14 come elettrolita per entrambi gli elettrodi. - Preparare 1 L di AHL miscelando 900 ml di acqua distillata con 6,312 g di NaCl, 0,373 g di KCl, 0,337 g di NaHCO 3, 0,1120 g di NaH 2 PO 4, 1.892 g di trealosio ּ 2 H 2 O, 3.423 g di saccarosio, 1,192 g di HEPES e 8,2 ml di 1 M MgCl 2 . Usando l'acqua distillata, portare il volume totale fino a 1 L. Portare il pH a 7,4 utilizzando 1 N NaOH e sterilizzare la soluzione con unSistema filtrante a vuoto. Per la conservazione a lungo termine, conservare le aliquote AHL a 4 ° C.
NOTA: Le consegne costanti dell'acido palmitoleico sono contingenti all'uniformità tra le cartucce. È fondamentale che ogni cartuccia sia assemblata in modo riproducibile. - Utilizzando una lama di rasoio, rimuovere 0.9 centimetri dalla punta di una punta di pipetta da 200 μL per creare la prima sezione della cartuccia, di 4.1 cm; Fare riferimento alle dimensioni dettagliate nella Figura 1A . Utilizzare un'altra pipetta da 200 μl e rimuovere 1,7 cm e 1,5 cm dalla punta e dalla base rispettivamente per creare la seconda sezione della cartuccia, di 1,8 cm ( figura 1A ). Utilizzare un righello per garantire la riproducibilità.
- Utilizzare un ⅛ "perforatore per tagliare i dischi dalla carta filtrante.
- Utilizzare la pinza per posizionare un disco di carta filtrante alla punta della seconda sezione della cartuccia. Verificare visivamente che c'è una apertura nella punta della cartuccia attraverso la quale l'aria può passare.
- Fissare insieme le sezioni della prima e del secondo cartuccia, come mostrato nella Figura 1A . Angolare la seconda sezione della cartuccia verso il basso per facilitare lo spostamento quadrato alla preparazione ( Figura 1B ).
- Collegare la cartuccia con il tubo di mandata odore, montato su un micromanipolatore.
NOTA: Questo disegno consente di spostare la cartuccia verso l'esterno per facilitare lo scambio ( Figura 1C ). - Impostare il flusso d'aria costante umidificato a 2 L / min in un controllore di massa e portare l'odorante a 500 mL / min in un altro controllore di massa.
- Utilizzando il software (vedere la tabella dei materiali ), programmare la procedura per amministrare un soffio di odore da 500 ms.
2. Preparazione di Soluzioni Odoranti Acido Palmitoleico per la Consegna
NOTA: OR47b ORN risponde sia all'acido palmitoleico cis che al trans . Poiché l'acido palmitoleico è instabile a RT, le scorte sono conservate a -20 ° C e utilizzate entro un mese dall'apertura. L'etanolo è il solvente di scelta per l'acido palmitoleico.
- Utilizzare un miscelatore vortex per mescolare accuratamente 10 μL di stock di acido cis- o trans- palmitoleico o di diluizioni con 90 μl di etanolo al 100% per le diluizioni seriali dieci volte in microtubi da 1,7 ml. Preparare quotidianamente le diluizioni di acido palmitoleico fresco prima di esperimenti e utilizzare entro un giorno.
NOTA: Per gli odoranti che non sono solubili in etanolo, si raccomanda una fiala di vetro per la preparazione delle diluizioni di odori con altri tipi di solventi organici. - Utilizzando una micropipetta P10, applicare 5 μL di soluzioni di acido cis- palmitoleico delle diluizioni desiderate alla carta filtrante in ciascuna corrispondente cartuccia.
NOTA: Il dosaggio più alto (10 -1 ) contiene 450 μg del composto. Per le soluzioni di acido trans- palmitoleico, applicare invece 4,5 μL in modo che il dosaggio più alto (10 -1 ) contiene anche 450 μg di tLui composto. - Per evaporare completamente il solvente, posizionare le cartucce di acido palmitoleico in un essiccatore a vuoto per 1 h a RT e 7.59 mmHg di pressione.
NOTA: Le cartucce possono essere utilizzate fino a 4 ore a RT.
3. Preparazione di Drosophila per il pronto accesso alla at4 Sensilla per le registrazioni elettrofisiologiche in vivo
NOTA: Le mosche WT (Berlino) vengono allevate in campione di cereali standard a 25 ° C in un ciclo chiaro e scuro di 12:12. In seguito all'eclosione, le mosche sono separate da sesso in gruppi di dieci, per cui sono alloggiati in gruppo fino a 7 d di età. OR47b ORN in entrambi le mosche maschili e femminili rispondono all'acido palmitoleico. Per semplicità, solo le mosche maschili vengono esaminate nell'attuale studio.
- Assemblare uno scivolo a mosca: su una lastra di vetro, posizionare una copertura in vetro (18 x 18 mm 2 ) su una piccola quantità di argilla modellante, formando un angolo di 3 ° con il vetrino in vetro. Posizionare il nastro su entrambi i lati sull'internoDge della coverlip e sull'area della diapositiva immediatamente sotto. Sostituire con nastro fresco per ogni giorno di registrazione ( Figura 2A ).
- Usare un aspirapolvere mosso 15 per raccogliere la mosca di interesse nel tubo e quindi inserire una punta pipetta da 200 μl sopra l'estremità del tubo. Spingere contemporaneamente il tubo in avanti mentre soffia l'aria nel tubo per spingere la mosca alla fine della punta della pipetta. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare appena sotto il corpo della mosca e 2 lunghezze di testa sopra la mosca.
- Tampone il fondo della punta della pipetta con l'argilla di modellazione, spingendo la mosca verso l'alto fino a esporre sia l'antenna che il clypeus ( Figura 2B ). Per evitare l'uccisione della mosca, aggiungere solo l'argilla sufficiente per esporre le antenne e arista, in quanto ciò impedisce l'addome del mosca da schiacciare. Inoltre, aggiungete argilla lentamente e delicatamente per evitare ogni improvvise costrizione. Confermare che la mosca sia viva controllando l'antennaO il movimento di proboscide.
- Utilizzare pinze per manovrare la punta pipetta che ospita la mosca. Orientare la testa in modo che il clypeus sia rivolto a destra dell'osservatore. Regolare la preparazione lungo la copertura con le pinze fine fino a quando il lato laterale dell'antenna non si trova sulla superficie del coperchio ( Figura 2B ).
- Posizionare l'asta di supporto sull'arista per fissare l'antenna al nastro biadesivo per evitare il movimento ( Figura 2B ).
NOTA: L'asta di supporto viene tirato da un capillare di vetro borosilicato con un puller di pipetta e tenuto in posizione con l'argilla di modellazione ( Figura 2A ). - Posizionare la preparazione sullo stadio dell'impianto ( figura 2C ). Usando il microscopio, confermare che i tricolori sono visibili lungo il bordo distale-laterale del terzo segmento dell'antenna.
NOTA: Idealmente, la sensilla dovrebbe essere chiaramente distinta sullo sfondo, che semplifica la loro Identificazione e facilita la registrazione ( Figura 3 ). In questa preparazione, la maggior parte della sensibilità trichoide accessibile è del tipo at4. - Conservare la preparazione in un flusso d'aria costante umidificato (2 l / min) erogato tramite un tubo di mandata separato da una distanza di circa 2 cm dalla preparazione ( figura 4 ), come descritto in precedenza 2 , 15 .
4. Registrazione di at4 attività di Sensillum da OR47b ORN nei trichoidi at4 in risposta all'acido di Palmitoleic
- Inserire l'elettrodo di riferimento nel clypeus ( Figura 3A ). Per evitare danni ai tessuti, assicurarsi che l'elettrodo sia inserito appena sotto la superficie, dove può contattare l'emolimfia sotto la cuticola, con un movimento rapido e liscio.
- Abbassare l'elettrodo di registrazione lentamente quando entra nello stesso piano di vista del sensibile bersaglio (= "Xfig"> Figura 3B). Registra sotto una lente obiettivo 50X.
NOTA: La tagliente trichoidale duro richiede l'inserimento dell'elettrodo di registrazione nella base sensibile, la cui zona più ampia fornisce un bersaglio più ampio che riduce la probabilità che l'elettrodo sia deviato ( figura 3B , inset). - Prima di applicare stimoli di odore ad un sensillum, osservare i seguenti criteri di selezione; Ogni trichoide che non riesce a soddisfare questi standard dovrebbe essere respinto e un altro sensilismo scelto invece.
- Osservare un elevato rapporto segnale-rumore (per esempio, vedere la figura 3C ).
- Osservare i picchi identificabili da neuroni at4A e at4C ( Figura 3C ).
NOTA: Da notare, l'ampiezza del picco at4B appare molto simile a at4A 10 e non può essere identificata facilmente senza stimolazione odore. - Osserva che il tasso di tiro basale dei neuroni at4A èIntorno o inferiore a 20 Hz.
NOTA: Questo criterio è specifico per at4A poiché il tasso di tiro basale per il neurone è superiore a quello degli ORNs basiconic 2 . Un fuoco basale molto più elevato indica che i neuroni possono essere stati danneggiati durante l'inserimento dell'elettrodo.
- Collegare la cartuccia al tubo di mandata odorante. Inizia con il controllo del solvente e poi gli odoranti, dalle concentrazioni basse e alte. Utilizzare il micromanipulatore per manovrare la cartuccia verso la preparazione mentre si punta la cartuccia in modo esatto alla testa del prep. Verificare visivamente che la cartuccia è punta direttamente all'antenna ( figura 4 ) a pochi millimetri di distanza.
NOTA: L'obiettivo è orientare l'apertura della cartuccia direttamente all'antenna e posizionarla in prossimità del tessuto bersaglio. - Assicurarsi che la cartuccia odorante sia separata dall'elettrodo di registrazione a destra da 1 a 2 mm e dal fly preP scivolare sotto di circa 1 mm.
NOTA: Nell'impostazione descritta qui, la cartuccia odorante è strettamente confinata con l'elettrodo di registrazione, l'elettrodo di riferimento e lo scorrimento fly-prep ( Figura 4 ).
NOTA: prestare attenzione alla distanza tra la cartuccia e gli elettrodi di registrazione / riferimento. Si consiglia una distanza di circa 4 mm 1 . Il contatto involontario può terminare il segnale e rompere la punta dell'elettrodo di registrazione, danneggiando il neurone corrente e complicando ulteriori registrazioni.
NOTA: Si consideri la distanza che separa la cartuccia e la diapositiva del fly-prep. Toccare la copertura può anche disattivare l'elettrodo di registrazione per interrompere la registrazione. - Premere "Record" nel software di acquisizione dati per avviare la registrazione.
NOTA: per ogni registrazione a 10 s, un singolo impulso di odore da 500 ms viene inviato direttamente all'antenna, come descritto nel passaggio 1.9. - Dopo l'applicazione odorante,Tirare accuratamente la cartuccia prima di sostituirla con una cartuccia della concentrazione più prossima. Continuare fino a raggiungere l'intero intervallo di dosaggio.
NOTA: Si raccomanda di registrare un solo OR47b ORN da ogni volo per evitare eventuali effetti di adattamento. - Sciacquare accuratamente l'elettrodo di registrazione con acqua distillata dopo aver terminato la registrazione per il giorno.
- Analizzare e tracciare i dati utilizzando software di analisi offline disponibili in commercio.
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Risultati
La nostra tecnica è stata applicata con successo per determinare l'efficacia relativa degli isomeri dell'acido palmitoleico trans ( Figura 5A ) e cis ( Figura 5B ). I nostri dati rappresentativi dimostrano che l'acido trans- palmitoleico è un ligando più efficace per Or47b ORNs rispetto alla isoforma cis ( Figura 5C ). Un singolo neurone è stato regist...
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Discussione
Qui abbiamo descritto una procedura con la quale le risposte di Or47b ORNs all'acido palmitoleico possono essere indotti e registrati in modo robusto. Abbiamo modificato un metodo convenzionale per la distribuzione di odori a lunga distanza 2 , 7 , 10 per risolvere il problema della mancanza di erogazione di feromoni. Abbiamo affrontato il problema della bassa volatilità odorante consegnando il composto tramite cartucce odo...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Ye Zhang per l'aiuto con le tracce del campione e Tin Ki Tsang per l'aiuto con le immagini. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di premio della Fondazione Ray Thomas Edwards e da una sovvenzione di NIH (R01DC015519) ai contributi di C.-YS e NIH (R01DC009597 e R01DK092640) a JWW
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Configurazione e preparazione Prep Materiali vari | |||
| Strumento estrattore per pipette | Sutter Instruments Novato CA USA | P97 | Pipette Estrattore |
| Capillari in vetro borosilicato | World Precision Instruments Sarasota FL USA | 1B100F-4 | per realizzare aste di tenuta |
| Capillari in vetro alluminosilicato | Sutter Instruments Novato CA USA | AF100-64-10 | per realizzare elettrodi |
| Vetrini per microscopio Superfrost | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA | 12-550-143 | per stazione di preparazione al volo |
| Nastro biadesivo permanente | Scotch St. Paul MN USA | NA | per stazione di preparazione al volo |
| Microscopio verticale | Olympus Shinjuku Tokyo Giappone | BX51 | per l'impianto di registrazione |
| Plastalina modellazione argilla | Van Aken North Charleston SC USA | B0019QZMQQ | per la stazione di preparazione e per stabilizzare l'asta di tenuta |
| Unità filtrante monouso sterile a flusso rapido con membrana SFCA, 0,45 mm | Nalgene Rochester NY USA | #156-4045 | per sterilizzare la soluzione |
| AHLName | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Materiali della cartuccia | |||
| 200 µ L puntale per pipetta | VWR Radnor PA USA | 53508-810 | per realizzare cartucce per odori e carta da filtro per la preparazione delle mosche |
| Whatman Maidstone Kent UK | 740-E | per realizzare cartucce per odori. | |
| Essiccatore sottovuoto | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA | VX-06514-30 | per vaporizzare il solvente etanolo |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Materiali odoranti | |||
| acido cis-palmitoleico | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA | #10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorante |
| acido trans-palmitoleico | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA | #9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorante |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA | E1028-500MLGL | per diluire l'acido palmitoleico |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Materiali per l'installazione dell'impianto | Micromanipolatore a cartuccia | ||
| odorante | Siskiyou Grants Pass OR USA | MX130R | per posizionare il software di visione del flusso dell'olfattometro |
| Alicat Tuscon AZ USA | FLOWVISIONSC | software per il controllo della portata | |
| Regolatore di massa | Alicat Tuscon AZ USA | MC-2SLPM-D | per il controllo della portata dell'aria umidificata |
| Regolatore di massa | Alicat Tuscon AZ USA | MC-500SCCM-D | per il controllo della portata per la stimolazione degli odori |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA | Ver. 10.4 | Software di acquisizione dati |
| Tubo di mandata dell'aria | Ace Glass Vineland NJ USA | 8802-936 | per fornire aria umidificata |
| Obiettivo 50X | Olympus Shinjuku Tokyo Giappone | LMPLFL50X | impianto di registrazione |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA | USA Ver. 10.4 | software per l'analisi dei picchi |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA | Ver. 6.37 | software per l'analisi dei dati |
| Monitor audio | ALA Scientific Instruments Farmingdale, NY, USA | NPIEXB-AUDIS-08B, | Rapporti acustici sui singoli picchi |
| Amplificatore extracellulare | ALA Scientific Instruments Farmingdale, NY, USA | NPIEXT-02F | per aumentare l'ampiezza dei segnali elettrici |
| Controller valvolare | , Warner Instruments | VC-8 | per controllare l'apertura della valvola per la stimolazione degli odori |
| Elettrodo di registrazione Micromanipolatore | Sutter Instruments Novato CA USA | MP-285 | per posizionare l'elettrodo di registrazione |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA | EQ-16.0008 | per aumentare l'ampiezza dei segnali elettrici |
| Oscilloscopio | Tektronix Beaverton OR USA | TDS2000C | Rapporto visivo dei singoli picchi |
Riferimenti
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